一种与水稻光合作用相关的WSP1蛋白及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明具体涉及一种与水稻光合作用相关的WSP1蛋白及其相关生物材料与应用，属于生物技术领域。

背景技术

光合作用为水稻的生长提供了物质来源和能量来源，叶绿体是进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，参与天线复合体上光能的捕获，电荷的分离以及电子传递。叶绿素的合成从谷氨酸(glutamate)开始到最终形成叶绿素a(Chla)和叶绿素b(Chlb)，共需18种酶催化完成。在此过程中任何内部、外部条件的变化都会导致叶色变异而表现为缺绿症状，如白化、黄化、条纹、斑马等叶色异常表型。目前已分离出多个与叶绿素合成相关的基因，主要有包括编码叶绿素a氧化酶OsCAO1和OsCAO2和编码镁离子螯合酶的OsCHLD、OsCHLH和OsCHLI，而编码联乙烯还原酶的OsDVR基因以及编码叶绿素合成酶的YGL1基因也已经确定与叶绿素合成有关。

高等植物叶绿体的发育需经过一系列复杂的变化过程，需要细胞核基因编码的蛋白和叶绿体编码的蛋白协调参与完成。在黑暗条件中，叶片中非光合作用的前质体发育成黄化质体，黄化质体中含有晶格状的原片层，经光照黄化质体不断分化发育形成叶绿体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：

A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；

A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；

A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；

A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；

A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；

A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；

A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；

A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。

本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在在调控植物叶色和/或穗色中的应用；

所述调控植物叶色和/或穗色是通过调控植物叶绿素含量和/或叶绿体发育体现的。

上述应用中，所述叶绿素为叶绿素a和/或叶绿素b和/或叶绿素a+b。

本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在在培育光合作用效率提高的转基因植物中的应用；

所述光合作用效率提高体现在转基因植物的叶色和/或穗色变绿。

本发明最后一个目的是提供一种培育光合作用效率提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育光合作用效率提高的转基因植物的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的光合作用效率高于所述受体植物。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

所述转基因植物的光合作用效率高于所述受体植物体现在如下1)-8)中至少一种：

1)所述转基因植物的叶色比所述受体植物绿；

2)所述转基因植物的穗色比所述受体植物绿；

3)所述转基因植物的叶绿素a含量比所述受体植物高；

4)所述转基因植物的叶绿素b含量比所述受体植物高；

5)所述转基因植物的叶绿素a+b含量比所述受体植物高；

6)所述转基因植物的叶肉细胞中的叶绿体数量比所述受体植物高；

7)所述转基因植物的叶肉细胞中的基粒数量比所述受体植物高；

8)所述转基因植物的叶肉细胞中的基粒堆叠层数比所述受体植物高。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。

本发明利用图位克隆技术克隆了控制水稻叶色和穗色的功能基因WSP1(WHITESTRIPLELEAF/PANICLES1)，并利用转基因互补实验鉴定了WSP1基因的功能；同时还发现WSP1基因是通过调控叶绿素合成和叶绿体发育来调控水稻叶色和穗色变化的。本发明的控制水稻叶色和穗色的功能基因WSP1对提高水稻光合作用效率和水稻的产量有重要意义，还可将其作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记应用于良种繁育和杂交育种中。

附图说明

图1为白穗突变体wsp1的形态学特征。其中，图1A为三叶期的白穗突变体wsp1和野生型水稻(日本晴)的叶片表型；图1B和图1C为成熟期的白穗突变体wsp1和野生型的表型；图1D为成熟期的白穗突变体wsp1和野生型的叶片表型。

图2为WSP1基因在水稻染色体上的初步定位和精细定位图及突变位点分析与峰图。图2A为WSP1基因在水稻染色体上的初步定位和精细定位图；图2B为突变位点分析；图2C和图2D为突变位点的峰图。

图3为T₀代转WSP1水稻、野生型水稻和白穗突变体wsp1穗部和叶片的表型。图3A为互补载体pCAMBIA2300-WSP1的结构图；图3B为T₀代转WSP1水稻、野生型水稻和白穗突变体wsp1穗部的表型；图3C为T₀代转WSP1水稻、野生型水稻和白穗突变体wsp1的分子鉴定。其中，WT为野生型水稻(日本晴)；wsp1为白穗突变体wsp1；cp为T₀代转WSP1水稻。

图4为白穗突变体wsp1与野生型水稻(日本晴)的苗期、分蘖期、成熟期的光合色素含量比较。图4A为白穗突变体wsp1与野生型水稻(日本晴)的苗期、分蘖期、成熟期的叶绿素a的含量比较；图4B为白穗突变体wsp1与野生型水稻(日本晴)的苗期、分蘖期、成熟期的叶绿素b的含量比较；图4C为白穗突变体wsp1与野生型水稻(日本晴)的苗期、分蘖期、成熟期的叶绿素a+b的含量比较。

图5为白穗突变体wsp1与野生型水稻(日本晴)的苗期叶片扫描电镜比较。图5A和图5B为野生型水稻(日本晴)的苗期叶片扫描电镜图；图5C和图5D为苗期白穗突变体wsp1白色部分的叶片扫描电镜；图5E为苗期白穗突变体wsp1绿色部分的叶片扫描电镜。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的籼稻品种Dular在文献“Science.2012Sep14；337(6100):1336-40.”中公开过，公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得。

下述实施例中的粳稻品种“日本晴”在文献“Science.2002；7:92–100.”中公开过，公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得。

下述实施例中的白穗突变体wsp1在文献“PlantMolBiol.2009Jan；69(1-2):69-80)”中公开过，公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得。

实施例1、白穗突变体wsp1及WSP1基因的获得

一、白穗突变体wsp1的发现及形态学特征

水稻(OryzasativaL.)白穗突变体wsp1(whitestriple/panicle1)的原始野生材料为粳稻品种“日本晴”，来自日本晴T-DNA插入突变库，在河北廊坊万庄基地获得。白穗突变体wsp1的表型最早出现在3叶期，具体表现在：和野生型水稻(日本晴)相比，在3叶期白穗突变体wsp1的叶片呈现白绿相间，主脉和大脉表现为白化，中脉尤其明显(图1A)，而野生型水稻(日本晴)没有白化现象；随着植株的发育，白穗突变体wsp1的叶片的白化条纹增多，成熟期时表现为花斑叶(图1D)，最显著的特征是，白穗突变体wsp1的穗部颜色表现为白化，而野生型水稻(日本晴)呈现绿色(图1B和图1C)。

二、WSP1基因的获得

1、遗传规律

以白穗突变体wsp1为母本，野生型水稻(日本晴)为父本进行正交，得到的F1代植株全部表现为正常表型，将F₂代种子播种四周后，随机选200个单株，发现156株的表型和野生型水稻(日本晴)表型相同，为正常型植株，44株表型和白穗突变体wsp1表型相同，为突变型植株。卡平方检测结果(χ²＝0.95<χ²0.05＝3.84)表明：正常植株的表型和突变体植株的表型分离比符合3：1；进一步证明该突变表型受隐性单隐性核基因控制。

2、WSP1基因的获得

(1)分析和定位群体

将纯合wsp1突变体和籼稻品种Dular进行杂交，得到F₁代，F₁代自交，得到F₂群体，并从F₂群体中选出810株突变表型明显的白穗表型突变个体作为定位群体。

(2)取步骤(1)获得的成熟期的白穗表型突变个体的嫩叶(每株取1克)，并采用快速提取方法提取总DNA。

(3)WSP1基因的初步定位

以步骤(2)获得的基因组DNA为模板，分别采用表1中的Indel引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增产物经4％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶染色，根据PCR扩增产物的多态性，将WSP1初步定位在Indel1与Indel2两个Indel标记之间(如图2A所示)。

(4)WSP1基因的精细定位

选取F₂群体中810株隐性个体，在初定位的基础上进一步设计Indel标记，最终将WSP1精确定位于30-30123bp范围之内，如图2A所示。

(5)WSP1基因的获得

根据上述步骤(4)的初步定位的结果，在30-30123bp范围内根据RiceAutomatedAnnotationSystem(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内共有5个候选基因并设计了各基因的测序引物(表1)。

表1、引物序列

分别以白穗突变体wsp1和野生型水稻(日本晴)的基因组DNA为模板，采用表2中的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并对PCR扩增产物进行测序分析。结果发现：与野生型水稻(日本晴)相比，白穗突变体wsp1为仅在某一候选基因的第3个外显子的第1312位核苷酸(该突变位点为序列1的第479位核苷酸)发生突变，由T突变为A，其余序列与野生型日本晴全部相同，该突变使序列2的第160个L-亮氨酸(Leu)突变为组氨酸(His)。将此结果重复验证，发现其他白穗突变体wsp1也均都发生上述突变。将上述发生突变的候选基因命名为WSP1基因，其核苷酸序列如序列表中序列1(突变位点为序列1的第479位核苷酸)，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

表2、引物序列

实施例2、互补植株的获得及表型鉴定

一、互补植株的获得

1、互补载体pCAMBIA2300-WSP1的构建

将序列表中序列3所示的DNA分子插入到pCAMBIA2300载体(购买于pCambia官方网站，网址为：http://www.cambia.org/daisy/cambia/585)的PstI和EcoRI酶切位点间，获得了互补载体pCAMBIA2300-WSP1。并对互补载体pCAMBIA2300-WSP1进行测序。

测序结果表明：互补载体pCAMBIA2300-WSP1为将序列表中序列3所示的DNA分子插入到pCAMBIA2300的PstI和EcoRI酶切位点间，且保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体(图3A)。

2、重组菌的获得

将步骤1获得的互补载体pCAMBIA2300-WSP1通过电击的方法转入农杆菌EHA105(淼灵生物，货号：CCell32003)中，得到重组菌pCAMBIA2300-WSP1/EHA105，用于转化水稻愈伤。

3、转化

将白穗突变体wsp1的种子经过诱导培养基培养3周后(培养条件：32℃光照强度13230Lx)，挑选生长旺盛的wsp1愈伤作为转化的受体。用步骤2获得的重组菌pCAMBIA2300-WSP1/EHA105侵染wsp1愈伤，25℃暗培养3天，然后在含有150mg/LG418和400mg/L羧苄的筛选培养基上培养2周(培养条件：32℃，光照强度13230Lx)，将无农杆菌污染并有新鲜愈伤长出的个体用于分化培养(培养条件：32℃，光照强度13230Lx)，待分化出小苗，将其转至生根壮苗培养基上培养2周左右后(培养条件：32℃，光照强度13230Lx)转田间种植，得到T₀代转WSP1水稻(互补植株，cp)。用引物SE-F(TTGACAGGGCTACCAGGTGTTCTATTTGAGC)和SE-R(CTCCGTTTCATATTATAAAACTTTC)对互补植株进行分子鉴定，鉴定结果如图3C所示：从图中可以看出：野生型水稻具有230bp的条带，白穗突变体wsp1具有201bp的目的条带，而互补植株具有大小为201bp和230bp的目的条带。说明互补植株为成功导入了WSP1基因的白穗突变体wsp1。

二、互补植株的表型

对步骤一获得的T₀代转WSP1水稻(互补植株，cp)的叶色和穗色进行观察。以野生型和白穗突变体wsp1为对照。

结果如图3B所示：与同时期的白穗突变体wsp1相比，T₀代转WSP1水稻的叶色、穗色均恢复为正常绿色，且T₀代转WSP1水稻的叶色、穗色与野生型水稻(日本晴)的叶色、穗色无显著性差异。说明WSP1基因在白穗突变体wsp1中的过表达使白穗突变体wsp1的叶色和穗色恢复正常表型，进而说明本发明的WSP1基因具有控制水稻叶色和穗色的功能。下述试验进一步研究WSP1基因如何调控水稻叶色和穗色。

三、互补植株的光合色素含量测定

1、分别取苗期(三叶期(L3)、四叶期(L4)、分蘖期(FL)和成熟期(P))的白穗突变体wsp1、互补植株和野生型水稻(日本晴)的同一叶片叶尖(苍白部分)和叶下部(淡绿部分)的叶片，去掉主脉，剪成1cm左右的片段，称取0.2g浸泡于10ml80％丙酮溶液中，26℃条件下暗培养48小时。

2、使用紫外分光光度计(DU800，BECKMANCOULTER)在663nm、645nm和470nm三种波长下测定步骤1获得的叶片中的叶绿素a(Chla)和叶绿素b(Chlb)的光密度值。每次试验3次重复，然后根据Amon(1949)的方法计算出各检测叶片中的叶绿素a和叶绿素b的含量，按照Wellburn(1994)计算叶绿素a和叶绿素b的含量，计算公式如下：chla＝(12.7×OD₆₆₃－2.69×OD₆₄₅)×V/W；chlb＝(22.9×OD₆₄₅－4.68×OD₆₆₃)×V/W。其中：V为提取液体积(10ml)，W为叶片质量0.2g，OD₆₆₃、OD₆₄₅及OD₄₇₀为在分光光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。

结果如图4所示：与野生型水稻相比，白穗突变体wsp1在苗期(三叶期、四叶期)、分蘖期和成熟期的叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素a+b的总含量均明显减少，而互补植株的叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素a+b的总含量和野生型水稻无明显差异。说明白穗突变体wsp1的WSP1基因突变引起的叶片和穗部的变化是由于叶绿素含量的缺失引起的，进而说明WSP1基因可以调控植物的叶绿素含量。

四、互补植株的叶绿体发育

1、样品

取三叶期的白穗突变体wsp1的白色部分、淡绿色部分、互补植株和野生型水稻(日本晴)的叶片，并切成0.5～1mm3左右的小块；

2、固定

将切好的样品块放入2ml离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；

3、脱水

先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1：1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理20分钟；

4、渗透

将样品在无水丙酮和包埋剂(3：1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1：1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；

5、包埋

将上述步骤4的产物转移至包埋盒内，37℃过夜，然后45℃处理12小时，最后60℃处理24小时，获得包埋样品；

6、切片、拍照

将步骤5得到的包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用HitachiH-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。

结果如图5所示：从图中可以看出，野生型水稻叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒排列紧密(图5A和图5B)，白穗突变体wsp1的绿色部分的电镜结果与野生型水稻相似(图5E)，而与野生型水稻相比，白穗突变体wsp1的白色部分的叶肉细胞中只有少数叶绿体，基粒数目减少，基粒堆叠层数减少，甚至缺失(图5C和图5D)，而互补植株的叶绿体结构和野生型水稻无明显差异。说明白穗突变体wsp1的WSP1基因突变造成了白穗突变体wsp1中叶绿体结构的破坏，进而说明WSP1基因可以调控植物的叶绿体发育。

上述试验表明：WSP1基因可以调控植物的叶绿素含量及叶绿体的发育，进而调控植物的光合作用效率。