一种用于防治中晚期肺腺癌的马尾松嫩枝皮提取物及其制备方法与其组合物

技术领域

本发明涉及中药提取物技术领域，具体涉及一种用于防治中晚期肺腺癌的马尾松嫩枝皮提取物及其制备方法与其组合物。

背景技术

癌症对人类的威胁日益增大，日渐成为危及人类健康与生命的“头号杀手”。征服癌症已成为全人类面临的一项迫在眉睫的任务，各国都把它作为重要课题，并投入巨资进行攻关。由于癌症的手术治疗、放射治疗、化学药品治疗均存在一定程度的局限性，且化学药品治疗癌症的毒副作用不断出现，国际科学界开始把目光转向更为安全的天然植物提取物，并成为治疗癌症的研究热点。

20世纪50年代，法国Masquelier博士首次从法国海松的树皮中提取得到一种黄酮类天然抗氧化剂混合物-原花青素，其抗氧化活性为V_E的50倍、V_c的20倍，并能清除体内过多的活性氧自由基，降低机体脂质过氧化程度，具有抗氧化、延缓衰老、增加免疫能力等功效。50年代后期，上述法国海松树皮提取物被注册为Pycnogenol药物，用于提高血管抵抗力，降低毛细血管脆性和通透性，防止血管内皮损伤等用途。1999年Huynh等(Huynhetal，AnticancerRes，1999)发现上述法国海松树皮提取物能抑制癌活性代谢物NNK活化，可防止抽烟诱发的肺癌。

尽管国外存在关于法国海松、新西兰辐射松树皮提取物生物学活性的研究报道，但我国松树生存环境独特，其体内次生代谢物种类、含量和性质与前两者相比存在诸多差异。吴杰等人研究了中国松科中不同品种松树皮中活性成分的差异，结果显示不同品种松树皮活性物质的含量差异显著，其中，马尾松树皮提取物中的总多酚含量、总黄酮含量、原花青素和水溶性多糖含量最高。并且，有关马尾松树皮提取物的研究多集中在由马尾松树皮提取原花青素等活性物质方面，其提取工艺也各有差异。

崔映宇等(《食品科学》，2004年)从马尾松树皮中制备获得了马尾松树皮提取物，其提取过程包括将马尾松树皮经筛选、烘干和粉碎后，用纯水加热浸提，浸提液经粗滤、离心分离和微滤后，除去悬浮物和大分子杂质，再用中空纤维膜超滤，得到含有前花青素等生物活性成分的透过液，纳滤浓缩，去除糖类、无机盐等杂质和水后，干燥，即得。但上述提取过程采用热水浸提，提取温度较高，导致松树皮中含有的挥发性物质丢失，影响萃取物活性，且纯化过程中以单一原花青素作为目标物，其过滤浓缩条件以及对糖类等物质的去除，将导致马尾松树皮提取物无法保持其有效成分的完整性。

薄采颖等使用超声法从马尾松树皮中提取多酚类物质，包括将马尾松树皮切碎、干燥和粉碎后，得到松树皮粉末，以70％乙醇为溶剂，在30℃条件下，料液比为20:1(ml：g)，超声提取40min，提取液离心过滤，测多酚得率。该方法采用乙醇作为提取溶剂，提取温度略高，与水作为提取溶剂低温提取相比，提取物组分将会有较大差异。

CN1923830A通过水溶剂从马尾松树皮中提取原花青素，具体包括以松树皮内皮层为原料，加入5-10倍的水，沸腾回流1-2h，经过300目管道过滤器，放出浸提液，重复一次，合并浸提液；离心，过柱，浓缩，干燥得到粉末。该方法采用沸腾回流收取提取物，将导致有效成分的损失。

CN101468121A公开了将紫花苜蓿、覆盆子、小槟榔和马尾松树皮按照1:1:1:1混合，加入3倍重量的净水浸泡48h，在≥100℃下煎煮5h，然后初滤、精滤和微孔阻菌精滤，浓缩后，喷雾干燥，得到粉末。该方法提取原料除马尾松树皮外还包括紫花苜蓿、覆盆子、小槟榔，将导致提取物混合组分与单独马尾松树皮提取物有较大差异，且采用了高温煎煮、喷雾干燥的方法，使得部分有效组分挥发物不能锁定被流失。

杜鹃等研究了回流、索氏提取、超声提取等不同的浸提方法及不同提取条件，通过水溶剂从马尾松树皮中提取原花青素的效率，结果表明不同的浸提方法，不同的提取条件都会影响原花青素得率。且在使用超声法提取原花青素时其最佳提取温度为50℃，并给出了低温条件会影响原花青素提取效率的不利教导。

CN101701013A公开了用水作为溶剂从松树皮中提取原花青素，以松树皮为原料，水为提取溶剂，进行超声波强化浸提，得到原花青素浸提液；再用微滤除杂、超滤纯化、纳滤浓缩的膜分离技术处理，得到浓缩液；再经真空干燥或冷冻干燥，得到原花青素产品。该方法记载了提取过程在低温条件下操作，但其具体实施方式选择了45℃和50℃进行超声提取，并仍然以提取原花青素作为主要目标物，纯化过程中选择了与原花青素相适应的截留分子量，得到的冻干产品中原花青素的含量可以达到67-68％wt，总酚含量可达到85-87％wt。

综上，马尾松树皮提取物含有多种酚类、糖类等多种成分组合而成的复合物，且不同的提取溶剂、提取过程、提取条件、分离纯化操作等，均会导致最终提取物中组分及组分比例的差异。并且，马尾松树皮的研究均采用马尾松树主杆老皮作为提取原料，尚未见特异选择马尾松嫩枝皮作为提取原料的相关报道。由于嫩枝皮与主杆老树皮植物组织处于不同的生长阶段，其所含有的生物活性物质有所不同，且主杆老树皮生长时间较久，受环境因素影响较大，导致嫩枝皮与老树皮提取物活性成分的差异。崔映宇等使用马尾松树皮提取物抑制肺腺癌的启示，冯东茹等通过提取马尾松树皮中的原花青素，用于抑制肺腺癌细胞株Glc-82的增殖活性；李伟等使用松树皮提取物促进人肺腺癌细胞A549的凋亡，但上述抑制肺腺癌细胞株的活性成分为原花青素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于防治肺腺癌的马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：1)将马尾松嫩枝皮粉碎至200-800目，制得马尾松嫩枝皮粉，其中，所述的马尾松嫩枝皮为马尾松枝头枝条当年发出的嫩枝在春夏季节采摘得到的松树皮；2)在4～25℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入水，浸泡1-10h，其中，马尾松嫩枝皮粉与水的质量体积比为1：2-1:15，制得马尾松嫩枝皮粉水浸泡液；3)将马尾松嫩枝皮粉水浸泡液超声提取5min-2h，过滤，制得马尾松嫩枝皮水提液；4)马尾松嫩枝皮水提取液经干燥，即得。

本发明的优选技术方案中，所述马尾松嫩枝皮粉碎前经筛选、除杂、烘干处理，优选所述烘干温度为30～80℃，更优选为40-70℃，最优选为50-60℃。

本发明的优选技术方案中，所述马尾松嫩枝皮粉碎至250-700目，优选为300-600目，更优选为350-500目。

本发明的优选技术方案中，所述马尾松嫩枝皮的采摘时间为3-6月，优选为4-5月。

本发明的优选技术方案中，所述提取温度为8-20℃，优选为10-15℃。

本发明的优选技术方案中，所述浸泡2-8h，优选浸泡3-6h，更优选浸泡4-5h。

本发明的优选技术方案中，马尾松嫩枝皮粉与提取用水的质量体积比为1:4-1:12，优选为1:6-1:10。

本发明的优选技术方案中，所述水选自软水、蒸馏水、去离子水的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，超声提取次数为1-6次，优选为2-5次，更优选为3-4次。

本发明的优选技术方案中，所述超声提取条件为，超声10-100min，优选超声15-80min，更优选超声20-60min，最优选超声25-40min。

本发明的优选技术方案中，所述超声提取条件为，超声功率为200-1000W，优选为350-900W，更优选为500-750W。

本发明的优选技术方案中，所述超声提取条件为，超声1-100s，间隙1-100s，优选超声5-80s，间隙5-80s，更优选超声10-70s，间隙10-70s，最优选超声15-60s，间隙15-60s。

本发明的优选技术方案中，所述过滤依次为初滤、精滤、膜阻菌过滤，优选初滤用100目筛网过滤，精滤使用生白布反复吸附过滤4-6次，膜阻菌过滤的孔径为0.22μm-0.45μm。

本发明的优选技术方案中，所述干燥选自减压浓缩干燥、冷冻干燥或喷雾干燥的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述提取物中有效成分包括多酚、总碱和多糖，优选所述有效成分含有2-5％的多酚，15-25％的总碱和60-80％的多糖，更优选含有2.39％的多酚、18.07％的总碱和78.6％的多糖。

本发明的目的在于提供一种用于防治肺腺癌的马尾松嫩枝皮提取物，所述提取物由本发明所述的制备方法制备得到。

本发明的优选技术方案中，所述提取物中有效成分包括多酚、总碱和多糖，优选所述有效成分含有2-5％的多酚，15-25％的总碱和60-80％的多糖，更优选含有2.39％的多酚、18.07％的总碱和78.6％的多糖。

本发明的优选技术方案中，其中所述提取物为粉末，优选所述粉末为100％全水溶性浅棕色半透明结晶体。

本发明的目的在于提供一种用于防治肺腺癌的药物组合物，所述的药物组合物由本发明所述的制备方法制得的马尾松嫩枝皮提取物和药学上可接受的载体组成。

本发明的药物组合物可采用本领域常规的制剂技术制备得到。

本发明的优选技术方案中，所述的药物组合物选自口服制剂、外用制剂、肠溶口服制剂的任一种。

本发明的优选技术方案中，所述的口服制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、口服液、混悬液、丸剂、散剂、滴丸、糖浆剂、合剂、露剂、泡腾剂、糊剂、乳剂、茶剂的任一种或其肠溶制剂。

本发明的优选技术方案中，所述的肠溶口服制剂选自肠溶片剂、肠溶胶囊剂、肠溶颗粒剂、肠溶粉剂、肠溶口服液、肠溶混悬液、肠溶丸剂、肠溶散剂、肠溶滴丸、肠溶糖浆剂、肠溶合剂、肠溶露剂、肠溶泡腾剂、肠溶糊剂、肠溶乳剂、肠溶茶剂的任一种。

本发明的优选技术方案中，所述的外用制剂选自凝胶剂、贴膏剂、霜剂、软膏剂、搽剂、洗剂、栓剂、涂抹剂、膏剂的任一种。

本发明所述的药学上可接受的载体为本领域熟知用于制备上述制剂的常用赋形剂或辅料。口服制剂或外用制剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于填充剂(又称稀释剂)、润滑剂(又称助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、矫味剂或赋香剂等。粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮，优选的纤维素衍生物为微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素；填充剂，例如乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐、山梨醇或甘氨酸，优选无机钙盐为硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙或沉降碳酸钙；润滑剂，例如微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油或聚乙二醇；崩解剂，例如淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素，优选的淀粉衍生物为羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉或玉米淀粉；湿润剂，例如十二烷基硫酸钠、水或醇等。

本发明的优选技术方案中，将活性成分与药学上可接受的缓控释载体按其制备要求加以混合，再按照本领域熟知的缓控释制剂的制备方法，如加入阻滞剂包衣或将活性成分微囊化后再制成微丸，如缓释微丸或控释微丸；所述的缓控释载体包括但不仅限于油脂性掺入剂、亲水胶体或包衣阻滞剂等，所述的油脂性掺入剂选自单硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、矿油、聚硅氧烷或二甲基硅氧烷的任一种或其组合；所述的亲水胶体选自羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、PVP、阿拉伯胶、西黄耆胶或卡波普的任一种或其组合；所述的包衣阻滞剂选自乙基纤维素(EC)、羟丙甲基纤维素(HMPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、丙烯酸类树脂的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的药物组合物为其缓释制剂或控释制剂，优选所述的缓释制剂为缓释微丸，所述的控释制剂为控释微丸。

本发明的优选技术方案中，所述药物组合物为肠溶片剂，优选所述肠溶片剂的药用辅料为微晶纤维素，更优选所述的薄膜包衣材料为羟丙基甲基纤维素(HPMC)。

本发明的优选技术方案中，所述马尾松嫩枝皮肠溶片剂中含有马尾松嫩枝皮提取物30-70份，微晶纤维素1-10份，优选为马尾松嫩枝皮提取物40-50份，微晶纤维素3-6份。

本发明的优选技术方案中，所述单位剂量的马尾松嫩枝皮提取物肠溶片剂中含15mg微晶纤维素和250mg马尾松嫩枝皮提取物。

本发明的优选技术方案中，所述单位剂量的马尾松嫩枝皮提取物肠溶片剂中含30mg微晶纤维素和500mg马尾松嫩枝皮提取物。

本发明的另一目的在于提供一种所述的马尾松嫩枝皮提取物或其药物组合物在制备用于治疗肺腺癌的药物中的应用。

本发明的优选技术方案中，所述肺腺癌选自中晚期肺腺癌或其在淋巴结、锁骨、肋骨、胸椎、腰椎、骨盆任一部位的转移或其转移并发症。

本发明的优选技术方案中，患者的用药量与其年龄、性别、体质、病情等因素相关。优选成人患者的用量为500mg/粒/次，每次6粒，每日三次，更优选未成年及儿童患者的用量为成人患者的一半用量，或者根据其年龄、性别、体质、病情等因素进行适当调整。温开水空腹服药。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、基于对嫩枝皮和老树皮的对比研究，发明人选择马尾松嫩枝皮作为松树皮提取原料，并采用低温超声水提取且优化提取条件，如在4～25℃条件下提取，避免挥发性有效成分的损失及混入杂质及热敏性物质，并能保持有效成分纯净、不受破坏，且能保持萃取物所具活性不受破坏，获得了具有特殊功能活性的提取物，所述提取物含有2-5％的多酚，15-25％的总碱和60-80％的多糖。

2、研究表明，本发明提取的马尾松嫩枝皮提取物中除原花青素以外的其他活性成分显著地抑制肺腺癌细胞株A549的增殖，所述提取物用于防治中晚期肺腺癌及其在淋巴结、锁骨、肋骨、胸椎、腰椎、骨盆的转移导致的并发症，其肿瘤抑制率高达93.66～99.58％，且具有毒副作用小、安全性高等优点。

3、传统提取工艺采取加热提取、加温浓缩等高温操作，导致提取物中70％以上的有效成分失效，如传统提取(加温提取、浓缩)不能完全保持药物原生态及纯天然；传统提取加温(色深)失去活性；传统提取加温(色深及发黑)活性受到破坏；传统提取加温超过100～110℃最有效组分挥发物不能锁定被流失。

4、本发明采用低温超声水提取的方法制备马尾松嫩枝皮提取物，既减少溶剂污染，又杜绝三废(废水、废渣、废气)的排放及其对环境的污染，确保生产过程安全；同时，本发明将马尾松嫩枝皮提取药渣用于制备生物肥料或生物质能源，利于资源的循环利用，显著提高资源利用率。

5、本发明采用春夏季节采摘的马尾松树枝头枝条“嫩枝皮”作为药用原料，既利于保护森林植被，又能拉动贫困山区大面积种植创收并脱贫致富。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1马尾松嫩枝皮提取物的制备

马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)采摘马尾松树枝头枝条当年3月发出的嫩枝皮，筛选无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的嫩枝皮，风选除杂后，在50℃烘干，制得马尾松嫩枝皮干品；

2)将1.5Kg马尾松嫩枝皮干品粉碎至400目，制得马尾松嫩枝皮粉；

3)在15℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入软水，进行超声水提取，其中，马尾松嫩枝皮粉与软水的质量体积比为1：2，所述超声提取条件为，超声功率为550W，超声6s，间隙6s，超声10min，制得马尾松嫩枝皮超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤4次，取滤液经0.22μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液经冷冻干燥后，制得马尾松嫩枝皮提取物220g。

5)将马尾松嫩枝皮提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例2马尾松嫩枝皮提取物的制备

马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)采摘马尾松树枝头枝条当年4月发出的嫩枝皮，筛选无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的嫩枝皮，风选除杂后，在80℃烘干，制得马尾松嫩枝皮干品；

2)将2.0Kg马尾松嫩枝皮干品粉碎至500目，制得马尾松嫩枝皮粉；

3)在25℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入软水，进行超声水提取，其中，马尾松嫩枝皮粉与软水的质量体积比为1：8，所述超声提取条件为，超声功率为550W，超声8s，间隙8s，超声12min，制得马尾松嫩枝皮超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤5次，取滤液经0.22μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液经喷雾干燥后，制得马尾松嫩枝皮提取物282g。

5)将马尾松嫩枝皮提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例3马尾松嫩枝皮提取物的制备

马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)采摘马尾松树枝头枝条当年5月发出的嫩枝皮，筛选无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的嫩枝皮，风选除杂后，在60℃烘干，制得马尾松嫩枝皮干品；

2)将2.5Kg马尾松嫩枝皮干品粉碎至450目，制得马尾松嫩枝皮粉；

3)在20℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入软水，进行超声水提取，其中，马尾松嫩枝皮粉与软水的质量体积比为1：5，所述超声提取条件为，超声功率为600W，超声10s，间隙10s，超声10min，制得马尾松嫩枝皮超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤6次，取滤液经0.45μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液经喷雾干燥后，制得马尾松嫩枝皮提取物356g。

5)将马尾松嫩枝皮提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例4马尾松嫩枝皮提取物的制备

马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)采摘马尾松树枝头枝条当年6月发出的嫩枝皮，筛选无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的嫩枝皮，风选除杂后，在55℃烘干，制得马尾松嫩枝皮干品；

2)将3.0Kg马尾松嫩枝皮干品粉碎至200目，制得马尾松嫩枝皮粉；

3)在18℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入软水，进行超声水提取，其中，马尾松嫩枝皮粉与软水的质量体积比为1：10，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声15s，间隙15s，超声12min，制得马尾松嫩枝皮超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤5次，取滤液经0.22μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液经减压干燥后，制得马尾松嫩枝皮提取物396g。

5)将马尾松嫩枝皮提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例5马尾松嫩枝皮提取物的制备

马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)采摘马尾松树枝头枝条当年4月发出的嫩枝皮，筛选无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的嫩枝皮，风选除杂后，在60℃烘干，制得马尾松嫩枝皮干品；

2)将4Kg马尾松嫩枝皮干品粉碎至400目，制得马尾松嫩枝皮粉；

3)在4℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入软水，进行超声水提取，其中，马尾松嫩枝皮粉与软水的质量体积比为1：15，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声20s，间隙20s，超声10min，制得马尾松嫩枝皮超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤5次，取滤液经0.22μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液经喷雾干燥后，制得马尾松嫩枝皮提取物520g。

5)将马尾松嫩枝皮提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例6马尾松嫩枝皮提取物的制备

马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)采摘马尾松树枝头枝条当年5月发出的嫩枝皮，筛选无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的嫩枝皮，风选除杂后，在55℃烘干，制得马尾松嫩枝皮干品；

2)将5Kg马尾松嫩枝皮干品粉碎至450目，制得马尾松嫩枝皮粉；

3)在10℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入软水，进行超声水提取，其中，马尾松嫩枝皮粉与软水的质量体积比为1：10，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声25s，间隙25s，超声8min，制得马尾松嫩枝皮超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤5次，取滤液经0.22μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液经喷雾干燥后，制得马尾松嫩枝皮提取物603g。

5)将马尾松嫩枝皮提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

对照例1马尾松嫩枝皮提取物的制备

马尾松嫩枝皮提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)采摘马尾松树枝头枝条当年5月发出的嫩枝皮，筛选无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的嫩枝皮，风选除杂后，在55℃烘干，制得马尾松嫩枝皮干品；

2)将5Kg马尾松嫩枝皮干品粉碎至100目，制得马尾松嫩枝皮粉；

3)在30℃条件下，在马尾松嫩枝皮粉中加入软水，进行超声水提取，其中，马尾松嫩枝皮粉与软水的质量体积比为1：10，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声25s，间隙25s，超声8min，制得马尾松嫩枝皮超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤5次，取滤液经0.22μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液经喷雾干燥后，制得马尾松嫩枝皮提取物256g。

5)将马尾松嫩枝皮提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

对照例2马尾松松树皮提取物的制备

马尾松松树皮提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)筛选无可见异物，无腐烂、无霉变，水分≤10％的马尾松松树皮，风选除杂后，在55℃烘干，制得马尾松树皮干品；

2)将5Kg马尾松树皮干品粉碎至450目，制得马尾松树皮粉；

3)在16℃条件下，在马尾松树皮粉中加入软水，进行超声水提取，其中，马尾松树皮粉与软水的质量体积比为1：10，所述超声提取条件为，超声功率为700W，超声25s，间隙25s，超声8min，制得马尾松树皮超声水提液；

4)采用100目滤网进行初滤，再使用生白布反复吸附过滤5次，取滤液经0.22μm的滤膜进行阻菌过滤，滤液经喷雾干燥后，制得马尾树皮提取物258g。

5)将马尾松树皮提取药渣用于制备生物肥料，提高资源利用率。

实施例7马尾松嫩枝皮提取物检测

实施例1-6制得的马尾松嫩枝皮提取物为浅棕色，气味苦，口感甘苦，组织形态均匀、无可见异物粉末(感官指标)，100％溶于水；对照例1提取物的色泽较浅，口感甘苦味略淡，组织形态均匀、无可见异物粉末，100％溶于水；对照例2提取物的色泽为棕红色，气味苦，口感苦、辛，组织形态均匀、无可见异物的粉末，100％溶于水。

按照HPLC、苯酚硫酸法检测实施例1-6及对照例1-2制得的马尾松嫩枝皮提取物中的多酚、总碱和多糖含量，结果见表1。

表1

由表1可见，马尾松嫩枝皮的粉碎程度及提取条件，如提取温度对提取物有效成分的含量影响较大。粉碎颗粒较大，提取温度较高会影响到有效成分的提取效率，且较高的提取纯化温度会导致多酚、总碱等物质损失率增大。由相同条件下马尾松嫩枝皮提取物与老树皮提取物提取结果可知，二者提取物的提取率相差较大，且提取物的有效成分存在明显差异，松树皮提取物中多酚和总碱的含量均低于嫩枝皮提取物。

实施例8马尾松嫩枝皮提取物对人肺腺癌细胞的生长抑制作用

以5-氟尿嘧啶为阳性药物，采用MTT法测定实施例1-6制得的马尾松嫩枝皮提取物对人肺腺癌细胞A549及人胚肺成纤维细胞MRC-5(正常细胞)的生长抑制作用。

将实验细胞(A549、MRC-5)置于含5％CO₂的37℃培养箱中培养，待长满70％～90％面积后，用0.25％胰酶EDTA消化，收集细胞，1000r/min离心5min，倾去上清液，细胞沉淀用含10％小牛血清的RMPI1640培养液打匀后接入25mL培养瓶中，5mL每瓶，每周传代2～3次。

以细胞培养基溶解测试药物，得到10mg/ml的储备溶液。用培养基梯度稀释得到64、32、16、8及4、2、1、0.5μg/ml浓度药物。人肺癌细胞A549细胞以10000个/孔、人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞以5000个/孔铺于96孔板中，48h后更换含相应浓度的培养基，每个浓度6个复孔；同时设仅含培养基的孔为阴性对照，孵育24h后吸掉各孔中的培养基，用PBS清洗1～2次，更换含15％MTT的培养基，继续孵育4h。吸掉培养基，加入150mlDMSO，低速振荡10min，用酶标仪检测490nm处吸光度，参考波长为630nm。抑制率采用以下公式计算：

实施例1制备的马尾松嫩枝皮提取物对人肺腺癌细胞A549具有较强的生长抑制作用，IC50值为4.9μg/ml，而其在5mg/ml浓度下，对正常细胞MRC-5没有明显的毒副作用。5-氟尿嘧啶对人肺腺癌细胞A549的IC50值为2.2μg/ml。结果见表2。

表2马尾松嫩枝皮提取物对A549细胞的生长抑制作用

同法测定实施例2-6马尾松嫩枝皮提取物对A549细胞的生长抑制作用，测得其IC50为3～7μg/ml，且对正常细胞没有明显的毒副作用。对照例1-2提取物对A549细胞的抑制作用较差，IC50值均高于实施例1-6所述嫩枝皮提取物。

实验结果表明，本发明的马尾松嫩枝皮提取物对肺腺癌细胞具有显著的生长抑制作用，而对正常细胞没有明显的毒副作用。并且，马尾松嫩枝皮提取物对肺腺癌细胞的生长抑制作用呈现明显的量效关系，即随着提取物浓度的增加，对细胞的生长抑制作用逐渐提高。

实施例9嫩枝皮提取物中抗癌活性成分研究

对实施例2中马尾松嫩枝皮提取物溶液进行进一步处理，去除其中总碱和多糖，获得与嫩枝皮提取物中多酚浓度相当的多酚提取物。测定两提取物对肺腺癌细胞株A549的抑制活性差异，结果如下所示：

表3本发明提取物与多酚提取物活性差异比较

由表3可见，本发明首次采取低温超声水提取方法制得马尾松嫩枝皮提取物，该提取物中含有除原花青素外的其他具有抑制肺腺癌活性的总碱、多糖等成分，这些有效成分呈现了协同增效作用。

实施例10马尾松嫩枝皮提取物肠溶片剂的制备

(1)马尾松嫩枝皮提取物肠溶片剂片芯的组成：

马尾松嫩枝皮提取物500g

微晶纤维素50g

制得片芯1000片。

(2)肠溶包衣液的组成：

将包衣粉羟丙基甲基纤维素(HPMC)约20g以95％乙醇为溶剂配制成浓度为9％的包衣液225g(每500g药物需要包衣液225g)。

(3)马尾松嫩枝皮提取物肠溶片剂的制备方法，包括下述步骤：

1)称取实施例2制得的马尾松嫩枝皮提取物500g，加入50g微晶纤维素，均匀混合，按照粉末直接压片法，制备片芯1000片；

2)将进风温度调至为85℃，出风温度为50℃；将片芯倒入包衣锅，开启转速为1.5r/min，稍预热，至片床片子有温感；开启喷液，注意包衣锅内片子的情况，适当调速至2r/min-3r/min；待片子上包有一层薄膜衣时，可以停止喷液，烘干3min，关闭热风，冷却出锅。

实施例11马尾松嫩枝皮提取物延长肺腺癌中晚期患者生存期的作用研究

将实施例10制得的马尾松嫩枝皮提取物口服肠溶片剂，用于中晚期肺腺癌志愿者的治疗。

选取确诊患有中晚期肺腺癌的二十名志愿者成人患者，其中，三名晚期患者已发现癌症细胞的骨转移，四名晚期患者已发现癌症细胞的淋巴结转移，两名晚期患者已发现癌症细胞的胸椎转移。患者按照下述方式给药：500mg/粒/次，每次六粒，每日三次，温开水送服。

结果表明，二十名患者的存活时间平均延长2-5年，生存质量得到明显改善。

综上，本发明首次采取低温超声水提取方法制得马尾松嫩枝皮提取物，该提取物中含有除原花青素外的其他具有抑制肺腺癌活性的总碱、多糖等成分，并在提取物中呈现协同增效作用。本发明马尾松嫩枝皮提取物主要用于中晚期肺腺癌及淋巴结、锁骨、肋骨、胸椎、腰椎、骨盆的转移导致的并发症，其肿瘤抑制率高达93.66～99.58％，且具有毒副作用小、安全性高等优点。