多重PCR检测水产品中四种食源性致病菌的引物组及方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测食源性细菌领域，尤其涉及多重PCR检测水产品中四种食 源性致病菌的引物组及方法。

背景技术

食源性致病菌是影响食品安全的最主要因素之一，由于致病菌污染食品引起中毒事件 时有发生。随着渔业经济的发展和食品加工技术的进步，我国水产品市场供应日趋丰富， 其消费量不断上升，但水产品在养殖、捕捞、储藏、加工、运输、销售等环节极易受到病 原微生物的污染，且我国各地居民普遍有吃鲜活水产品如生鱼片(鱼生)、生蚝、生虾的 习惯，因此水产品及其加工品中食源性致病菌的检测是保证其食用安全的一项重要工作， 关系到消费者的健康及生命安全。沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌和金黄色葡萄 球菌均属水产品中重点调查的食源性致病菌。

食源性致病菌传统检测方法存在着检测周期长、操作繁琐、检测单一等不足。随着食 源性致病菌检测技术的高速发展，分子生物学检测技术因具有高效、灵敏、准确等优点， 被普遍应用于食源性致病菌的检测。而随之发展的多重PCR技术，能够同时检测多种致病 菌，提高检测效率的同时也降低了检测成本，具有广阔的应用前景。近年来，多重PCR检 测各种食源性致病菌技术方法层出不穷。然而，专门针对水产品中沙门氏菌、大肠杆菌 O157：H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测方法尚无报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供灵敏快速、操作便捷的多重PCR检测水产品中四种食 源性致病菌的引物组及方法，具体是同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌和 金黄色葡萄球菌的四重PCR引物组及方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：多重PCR检测水产品中四种食源性 致病菌的引物组，包括沙门氏菌上下游引物、大肠杆菌O157：H7上下游引物、志贺氏菌上 下游引物和金黄色葡萄球菌上下游引物共四对引物对，分别是序列表SEQ.ID.No.1和2、 SEQ.ID.No.3和4、SEQ.ID.No.5和6、SEQ.ID.No.7和8的碱基序列。

四对引物对分别扩增沙门氏菌invA基因、大肠杆菌O157：H7rfbE基因、志贺氏菌ipaH 基因和金黄色葡萄球菌femA基因。

四对引物对的摩尔浓度比为3∶3∶1∶2。

多重PCR检测水产品中四种食源性致病菌的方法，采用四对引物对对水产品总DNA进 行PCR扩增，电泳检测扩增结果；四对引物对分别是序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.3 和4、SEQ.ID.No.5和6、SEQ.ID.No.7和8的碱基序列。

PCR扩增的反应体系和扩增程序分别为：

反应体系：共50μL，包括：2×TaqPCRMasterMix30μL，10μmol/L沙门氏菌 上下游引物均为1.5μL，10μmol/L大肠杆菌O157：H7上下游引物均为1.5μL，10 μmol/L志贺氏菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L金黄色葡萄球菌上下游引物均为 1.0μL，模板2.0μL，灭菌水补足至50μL；

扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，58.3℃退火45s，72℃延伸1min， 进行35个循环，最后72℃延伸10min。

由于目前缺乏行之有效的同时检测水产品中食源性致病菌的方法，发明人根据水产品 主要食源性致病菌的特点，结合多重PCR技术，设计了多重PCR检测水产品中四种食源性 致病菌的引物组，包括沙门氏菌上下游引物、大肠杆菌O157：H7上下游引物、志贺氏菌上 下游引物和金黄色葡萄球菌上下游引物共四对引物对，分别是序列表SEQ.ID.No.1和2、 SEQ.ID.No.3和4、SEQ.ID.No.5和6、SEQ.ID.No.7和8的碱基序列。据此，还建立了一 种同时检测水产品中沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的四重PCR 方法。该法具有灵敏快速、操作便捷等特点，为水产品及其加工制品质量安全检测工作中 对上述4种食源性致病菌的检测提供一种准确快速、高效经济的手段，对保障我国水产品 食用安全具有重要意义。

附图说明

图1是引物组合筛选的电泳图，图中：M.DL1000DNAMarker；1.引物组合1；2.引物 组合2；3.引物组合3；NC.阴性对照；BC.空白对照。

图2是引物浓度正交试验L16(4⁴)的电泳图，图中：M.DL1000DNAMarker，1-16分 别为表2中试验号1-16的引物组合，NC.阴性对照，BC.空白对照。

图3是退火温度对多重PCR影响的电泳图，图中：M.DL1000DNAMarker，1-10分别 为退火51.3、52.1、53.1、53.8、54.6、55.2、56.6、57.2、58.3和59.2℃，NC.阴性 对照，BC.空白对照。

图4是PCRMasterMix对多重PCR影响的电泳图，图中：M.DL1000DNAMarker，1-8 分别为TaqPCRMasterMix添加量0.8×、0.9×、1×、1.1×、1.2×、1.3×、1.4×、 1.5×，NC.阴性对照，BC.空白对照。

图5是多重PCR特异性检测的电泳图，图中：M.DL1000DNAMarker；1.志贺氏菌； 2.沙门氏菌；3.金黄色葡萄球菌；4.大肠杆菌O157：H7；5.单增李斯特氏菌；6.肺炎克雷 伯菌；7.大肠埃希氏菌；8.副溶血性弧菌；9.创伤弧菌；10.霍乱弧菌；11.蜡状芽孢杆菌； 12.致病性嗜水气单胞菌；13.温和气单胞菌；14.海豚链球菌；15.无乳链球菌；16.4种目 标致病菌；NC.阴性对照；BC.空白对照。

图6是敏感性检测的电泳图，图中：M.DL1000分子量标准；1-9∶10倍梯度稀释的菌 悬液DNA：10⁸cfu/mL～10⁰cfu/mL；NC.阴性对照；BC.空白对照。

具体实施方式

多重PCR检测水产品中四种食源性致病菌的方法研究

由于多重PCR技术在食源性致病菌检测中表现出诸多优势，发明人考虑采用适当的培 养基实现沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的共增菌，并从引物 设计、引物浓度配比、反应条件等方面进行优化，建立能同时检测沙门氏菌、大肠杆菌 O157：H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法，以期用于于水产品质量安全检测。 具体研究如下：

一、材料和试剂

LB肉汤培养基购自杭州滨和微生物试剂有限责任公司；2×TaqPCRMasterMix(含 TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液)、细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试 剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；DL2000、pMD18-T克隆载体均购自宝生物工程(大 连)有限公司；氨苄青霉素购自Promega公司；琼脂糖购自英韦创津生物科技有限公司， 其他常规试剂均为国产分析纯。

沙门氏菌ATCC14028、志贺氏菌CMCC(B)51252、金黄色葡萄球菌ATCC6538、单增 李斯特氏菌CVCC1598、肺炎克雷伯菌CMCC(B)46114、大肠埃希氏菌CMCC44568、副溶 血性弧菌ATCC17802、创伤弧菌ATCC27562、霍乱弧菌NH87-21、蜡状芽孢杆菌CMCC(B) 63301购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

大肠杆菌O157：H7ATCC25922由深圳出入境检验检疫局惠赠。

致病性嗜水气单胞菌TE090214、温和气单胞菌NN090617、海豚链球菌NN090916、无 乳链球菌NN130813均为实验室分离株，分别记载如下：

《斑点叉尾鮰套肠症的病原鉴定及药敏特性》，大连水产学院学报，2009，24(6)： 475-481.《黄沙鳖温和气单胞菌的分离鉴定及药敏试验》，广东农业科学，2010，37(12)： 124-126.

《2011-2012年广西罗非鱼食源性致病菌及其药敏特性调查》，南方农业学报，2013， 44(11)：1914-1918.公众可从广西水产科学研究院获得。

二、引物设计与合成

选择沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、大肠杆菌O157：H7的O157抗原基因rfbE、志贺 氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH和金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林辅助基因femA的序列， 分别设计4对引物，共设计3组用于四重PCR的引物(表1)，由生工生物工程(上海)股 份有限公司合成。

表1引物信息

三、四重PCR检测方法的建立

<1>四种菌的共增菌

分别挑沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株的单菌落 接种于100mL的LB肉汤培养基中，36℃，120r·min^-1振荡培养18h；用灭菌生理盐 水10倍梯度稀释至10^-8，各吸取1mL稀释菌液，加入到96mLLB肉汤培养基，36℃静 止培养18h；将所得增菌液进行10倍梯度稀释，选择10^-4、10^-5稀释度的稀释液，分别 取100μl涂布在HE琼脂、O157：H7显色培养基、麦康凯(MAC)琼脂和Baird-Parker 琼脂培养基上，36℃静止培养24h，依据4种致病菌在各自选择性培养基上的菌落特点， 进行菌落计数，记录增菌数量。

<2>细菌DNA提取

采用细菌DNA提取试剂盒按说明书要求提取混合菌悬液的基因组DNA，于-20℃保存备 用。同时将前述15株试验菌株的单菌落分别接种于营养肉汤中(其中副溶血性弧菌接种 于含3％NaCl的营养肉汤中，单增李斯特氏菌接种脑心浸液培养基中)，36℃培养18h， 分别提取培养物DNA。

<3>引物组筛选

按照常规方法将三组引物分别进行四重PCR检测的初步试验，通过电泳图观察及筛选 三组引物。经测试(图1)，引物组合1获得较好效果，四条带清晰均匀，扩增效率高；引 物组合2和3产物效率均比较低，组合2中的沙门氏菌invA基因(441bp)和金黄色葡萄 球菌femA(341bp)条带比较弱；组合3中志贺氏菌ipaH(543bp)条带较弱。因此，选 择引物组合1作为四重PCR的引物组进行下一步的优化。

<4>多重PCR各引物添加量的正交优化

为了确定多重PCR反应中4对引物的添加量，把引物组合1的4对引物作为4个因素， 采用正交设计L₁₆(4⁴)在4个水平上(引物终浓度为0.1、0.2、0.3和0.4μmoL/L)进行 试验(表2)。

表2L16(4⁴)引物比例正交表

根据引物浓度正交试验L16(4⁴)电泳检测结果(图2)，16个处理组合都能扩增出4 条目的带，但扩增效果有差异；其中处理组合1、10、11、13效果较好，其中处理组合11 效果最佳，因此确定处理组合11为引物最佳添加浓度，即引物invA-F/R、rfbE-F/R、 ipaH-F/R和femA-F/R终浓度分别为0.3、0.3、0.1和0.2μmoL/L。

<5>多重PCR退火温度优化

设计温度梯度PCR反应程序，退火温度依次为51.3、52.1、53.1、53.8、54.6、55.2、 56.6、57.2、58.3和59.2℃，经梯度PCR后电泳检测(图3)，退火温度对该四重PCR扩 增效果的影响不大，退火温度在51～59℃时都能较好地扩增出4条目的带，但当退火温度 为58.3℃(泳道9)时各菌目的基因的扩增效率稍高且较均衡。因此，选58.3℃为该多重 PCR的最适退火温度。

<6>TaqPCRMasterMix浓度的优化

TaqPCRMasterMix的优化：在反应体系中使TaqPCRMasterMix添加量为0.8×、 0.9×、1×、1.1×、1.2×、1.3×、1.4×、1.5×，优化最适宜多重PCR反应的TaqPCR MasterMix反应浓度。经试验(图4)，在0.8×TaqPCRMasterMix时，Taq酶活力低，扩 增效率低。随着PCR反应体系中TaqPCRMasterMix浓度的增加，各菌目的基因的扩增量 变大，但当TaqPCRMasterMix为1.2×(泳道5)以上时，增加量变化不明显。因此， 兼顾扩增效率和检测成本，选1.2×TaqPCRMasterMix为最适TaqPCRMasterMix反应 浓度。

<7>多重PCR反应体系条件及参数

经优化后多重PCR总反应体系50μL，包括：2×TaqPCRMasterMix30μL，沙门氏 菌上下游引物(10μmol/L)均为1.5μL，大肠杆菌O157：H7上下游引物(10μmol/L) 均为1.5μL，志贺氏菌上下游引物(10μmol/L)均为0.5μL，金黄色葡萄球菌上下 游引物(10μmol/L)均为1.0μL，模板2.0μL，灭菌水补足至50μL。扩增程序为： 94℃预变性5min，94℃变性45s，58.3℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个 循环，最后72℃延伸10min。

<8>多重PCR特异性验证

以沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、肺 炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、蜡状芽孢杆菌、致病 性嗜水气单胞菌、海豚链球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌的DNA以及为4种目标菌的混 合基因组DNA为模板，采用优化好的多重PCR反应条件进行扩增，验证引物的特异性。

多重PCR反应体系对15株试验菌株的基因组DNA以及4种目标菌的混合基因组DNA 进行PCR扩增结果显示(图5)，沙门氏菌在434bp处出现扩增条带，大肠杆菌O157：H7209 bp处出现扩增条，志贺氏菌在530bp处出现扩增条带，金黄色葡萄球菌在426bp处出 现扩增条带，条带清晰、无拖尾，也未发现引物二聚体或非特异性扩增条带，其他细菌DNA 则均无扩增条带出现。并将各PCR产物进行测序及将序列在GenBank中进行BLAST同源性 比对，沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的目标产物序列与其引 物设计参考序列的同源性均为100％，表明扩增产物确为目的序列。该发明的四重PCR中4 对引物特异性好、无相互干扰，该多重PCR反应具有较强特异性，可用于同时检测本发明 涉及的4种致病菌中的一种或几种。

<9>多重PCR敏感性检测

将沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌4种菌株分别培养用普 通平板计数琼脂(PCA)计数，将各菌样以10⁸cfu/mL等体积混合后，用无菌生理盐水以 10倍稀释使各菌含量从10⁸cfu/mL到10⁰cfu/mL，各梯度取1mL菌液，采用试剂盒提取 DNA模板，检测多重PCR方法的灵敏度。多重PCR扩增10⁸cfu/mL～10⁰cfu/mL菌液DNA 结果(图6)显示，当菌悬液浓度≥10²cfu/mL时，沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、志贺 氏菌和金黄色葡萄球菌扩增后均可出现条带；当菌悬液稀释至10cfu/mL时，仅志贺氏菌 扩增后出现条带；因此，该多重PCR方法对沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和金黄色葡萄球 菌的最低检出限为10²cfu/mL，对志贺氏菌最低检出限为10cfu/mL。