多西他赛-油酸前药及其纳米结构脂质载体和应用

技术领域

本发明属于药物制剂新辅料和新剂型领域，包括多西他赛-油酸前药(DTX-OA)及基于core-match机理包载的纳米结构脂质载体(NLC)，以及其在口服给药中的应用。

背景技术

多西他赛(DTX)是临床应用广泛的抗癌药。但极低的水溶性导致市售制剂中含有大量的吐温80和乙醇作为增溶剂，易产生毒副作用，进而限制了其临床应用。同时，注射给药不可避免的面临诸多弊端，例如易发生感染，患者依从性低，副作用大等。与注射给药相比，口服给药具有方便，经济，患者有较高的顺应性等特点。但由于多西他赛水溶性极低，渗透性差，且本身为P-gp底物，导致多西他赛口服生物利用度很低。

纳米载体由于能够提高抗癌药物的疗效并且减少药物副作用而被广泛用于靶向药物传递系统。其中，纳米结构脂质载体作为新一代的脂质纳米粒在口服药物传递中备受瞩目，因其具有很好的生物相容性和稳定的缓控释效果。但包载多西他赛的纳米结构脂质载体存在载药量低的问题(5％，w/w)，限制了其临床应用。根据core-match理论，当经过化学修饰的药物与纳米载体含有相同的成分时，修饰后的药物与载体之间会产生极高的亲和力，可以显著提高纳米载体的载药量。因此，设计合成了多西他赛-油酸前药，将其包载于含有油酸(OA)作为液态脂质的纳米结构脂质载体中(DTX-OA-NLC)，通过core-match机制提高药物的载药量，并进一步提高多西他赛的口服生物利用度。

发明内容

本发明的第一个目的旨在提供多西他赛-油酸前药。

本发明的第二个目的旨在提供基于core-match机理包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体的制备方法。

本发明的第三个目的旨在提供基于core-match机理包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体在口服给药中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

该多西他赛-油酸前药以多西他赛为母药，以酯键链接一分子油酸而形成前药，是一种稳定性好、功能性强的脂肪酸前药。

所述的多西他赛-油酸前药的结构式如下：

所述的多西他赛-油酸前药，其特征在于，油酸与多西他赛侧链2’位相连。其制备过程如下：油酸(OA)溶于少量二氯甲烷中，在双环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化作用下，N₂保护下冰浴2-3h，然后与多西他赛在25-30℃N₂保护下反应24-36h，经分离纯化得到白色粉末状前药。反应式如下：

所述的基于core-match机理的纳米结构脂质载体可采用乳化超声法制备，以单硬脂酸甘油酯为固体脂质，以油酸为液体脂质，以多西他赛-油酸前药为主药，以泊洛沙姆188(F₆₈)为表面活性剂，以赖氨酸桥连的聚乙二醇2000二维生素E琥珀酸酯(PLV₂₀₀₀)为表面修饰材料，其中，各组分间的重量百分组成为：1：0.3～0.5：0.5～1.0：0.3～0.5：0.8～1.2(单硬脂酸甘油酯：油酸：F₆₈：PLV_2K：DTX-OA)，优选为：7：3：5：3：8。表面活性剂可以脱氧胆酸钠替代，表面修饰材料可以赖氨酸桥连的聚乙二醇5000二维生素E琥珀酸酯(PLV₅₀₀₀)替代。

制备工艺如下：将一定量的单硬脂酸甘油酯，油酸，多西他赛-油酸前药，PLV₂₀₀₀，溶于适量乙醇中，加热至70-80℃，磁力搅拌下使其溶解均匀。将F₆₈溶于一定量水中，加热至70-80℃，磁力搅拌下使其溶解均匀。将上述乙醇溶液快速加入到水溶液中，70-80℃水浴下保持磁力搅拌5-10min。将上述溶液超声处理(200-400W，5-10min)，迅速冰浴冷却，得到淡蓝色乳光液体制剂。

本发明具有以下有益效果：制备的多西他赛-油酸前药稳定性好，在大鼠血浆中相对于多西他赛有更高的稳定性。制备的基于core-match机理的纳米结构脂质载体粒径较小且均一(90nm)，载药量高(23％，w/w)，物理稳定性好，体外肠灌流试验和体内药动学试验证实基于core-match机理包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体能显著提高多西他赛的口服生物利用度。

附图说明

图1为本发明实施例1的多西他赛-油酸前药的¹HNMR谱图。

图2为本发明实施例1的多西他赛-油酸前药的高分辨质谱谱图。

图3为本发明实施例1的多西他赛-油酸前药的FT-IR谱图。

图4为本发明实施例1的多西他赛-油酸前药与多西他赛在大鼠血浆中的稳定性对比图。

图5为本发明实施例3的纳米结构脂质载体的透射电子显微镜图。A：多西他赛-油酸纳米结构脂质载体；B：多西他赛纳米结构脂质载体。

图6为本发明实施例3的纳米结构脂质载体在不同模拟介质中的胶体稳定性。A：多西他赛-油酸纳米结构脂质载体；B：多西他赛纳米结构脂质载体。

图7为本发明实施例3的纳米结构脂质载体在不同模拟介质中的体外释放实验。

图8为本发明实施例3的纳米结构脂质载体的原位单向肠灌流的吸收速率常数(K_a)图。

图9为本发明实施例3的纳米结构脂质载体的原位单向肠灌流的表观吸收系数(P_app)图。

图10为本发明实施例3的包载香豆素-6的纳米结构脂质载体的大鼠肠道吸收分布图。

图11为本发明实施例3的包载DiR的纳米结构脂质载体的小鼠肠道吸收分布图。

图12为本发明实施例3的包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体大鼠肠道摄取机制图。

图13为本发明实施例3包载香豆素-6的纳米结构脂质载体的MDCK细胞摄取图。

图14为本发明实施例3的纳米结构脂质载体口服给药药时曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

多西他赛-油酸前药的合成。

油酸(OA)溶于少量二氯甲烷中，在双环己基碳酰亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化作用下，N₂保护下冰浴2h，然后与多西他赛在25℃N₂保护下反应24h，经分离纯化得到白色粉末状前药。反应式如下：

采用核磁共振测定¹H-NMR氢谱来确定实施例1中前药的结构，选用的溶剂为CDCl₃，结果如图1。1.158ppm,1.783ppm,5.229ppm,8.131ppm为多西他赛H_7’–9’,H₁₄,H₂₀,H_25,29的特征峰。0.886ppm，1.271ppm，1.290ppm，1.334ppm，1.657ppm，2.041ppm，2.372ppm，5.368ppm为油酸-CH₃，CH₃-(CH₂)₅-CH₂-，CH₃-(CH₂)₅-CH₂-，-CH₂-(CH₂)₃-CH₂-，-CH₂-CH₂CH₂CO-，-CH₂CH₂CO-，-CH₂CH＝CHCH₂-，-CH₂CO-和-CH＝CH-的特征峰。

采用FT-IR图谱来确定实施例1中前药相对于母药在化学基团上的变化，结果如图2。2978.00cm^-1和2939.43cm^-1为多西他赛结构中-CH₃的特征峰。2927.85cm^-1和2854.56cm^-1为多西他赛-油酸前药中-CH₂-的特征峰。

采用高分辨质谱来确定实施例1中多西他赛-油酸前药的分子量和分子式。结果如图3。测得分子量为1072.59,分子式为C₆₁H₈₆N₁O₁₅。

实施例2

多西他赛-油酸前药的稳定性

将多西他赛-油酸前药与多西他赛分别加入到大鼠血浆中，置于37℃振荡器中，测定药物在0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h，72h，96h，120h的含量变化。结果如图4所示。在大鼠血浆中，多西他赛-油酸前药相比于多西他赛具有更高的稳定性。

实施例3

乳化超声法制备基于core-match机理的纳米结构脂质载体

制备工艺如下：将一定量的单硬脂酸甘油酯(6.7mg)，油酸(3.3mg)，多西他赛-油酸前药(8mg)，PLV₂₀₀₀(3mg)，溶于适量乙醇中，加热至80℃，磁力搅拌下使其溶解均匀。将F₆₈(10mg)溶于10mL水中，加热至80℃，磁力搅拌下使其溶解均匀。将上述乙醇溶液快速加入到水溶液中，80℃水浴下保持磁力搅拌5min。将上述溶液超声处理(200W，5min)，迅速冰浴冷却，得到淡蓝色乳光液体制剂。将上述方法中的多西他赛-油酸前药分别替换为多西他赛，香豆素-6和DiR，其他条件不变，制备包载多西他赛，香豆素-6，和DiR的纳米结构脂质载体。

通过透射电子显微镜测定实施例3中制备的包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体和包载多西他赛的纳米结构脂质载体的粒径和形态，结果如图5。透射电镜图表明载药纳米结构脂质载体为粒径均一的球形，粒径在100nm左右。

所制备的多西他赛纳米结构脂质载体的载药量约为5％，而多西他赛-油酸前药纳米结构脂质载体的载药量约为23％，说明core-match机理能显著提高纳米制剂的载药量。

实施例4

纳米结构脂质载体的胶体稳定性试验

以pH1.2盐酸溶液，pH6.8磷酸盐缓冲液，模拟胃液，模拟肠液为介质。将1mL包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体和1mL包载多西他赛的纳米结构脂质载体分别加入到30mL不同的介质中，置于37℃震荡器中。在规定的时间点测定纳米结构脂质载体的粒径。

结果如图6，在pH1.2盐酸溶液，pH6.8磷酸盐缓冲液中，包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体和包载多西他赛的纳米结构脂质载体在规定的时间内均能保持粒径不变。但在模拟胃液，模拟肠液中，包载多西他赛的纳米结构脂质载体在8小时候后粒径显著增大，相比之下包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体粒径无明显变化，表明基于core-match机理的纳米结构脂质载体具有更好的胶体稳定性。

实施例5

纳米结构脂质载体的体外释放试验

采用透析法考察实施例3制备的纳米结构脂质载体的体外释药特征。分别移取包载多西他赛和多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体溶液1mL(100ug/mL)于透析袋中，透析袋两端夹紧，分别置于含有30mLpH1.2盐酸溶液和PH6.8磷酸盐缓冲液的锥形瓶中，在37℃恒温振荡器中进行体外释放度考察。在规定的时间点取样2mL，同时补充2mL新鲜的释放介质到锥形瓶中。样品经0.45μm微孔滤膜过滤，取20μL进行含量测定。

图7结果表明包载多西他赛的纳米结构脂质载体在释放介质中快速释放，但包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体释药缓慢，具有良好的缓控释效果，说明core-match效应能显著提高药物与载体的亲和力，提高制剂的缓控释效果。

实施例6

大鼠原位单向肠灌流试验

实验前，供试液饱和管路1h，并以0.2mL/min的流速收集出液口流出的药液，测定该药液浓度作为肠道进口灌流液中药物的浓度，以消除实验过程中管路对药物的吸附作用。将大鼠禁食过夜(自由饮水)，用质量分数为20％的乌拉坦腹腔注射麻醉(1.0g/kg)，置于恒温手术台上以保持体温。沿腹中线剪开3～4cm的开口，打开腹腔，分离出待考察肠段，取约10cm于两端切口，用预热至37℃的生理盐水轻缓的将肠内容物冲洗干净，于切口处插管，结扎。将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿，于红外灯下保温。进口处用已知重量的装有供试液的烧杯进行灌流，流速0.2mL/min，每隔15min在出口处用另一已知重量的EP管收集一次(同时迅速更换下一个供试液烧杯和EP管)，称量此时供试液烧杯和EP管的重量，测定药物的浓度，实验持续时间为120min。实验最后将大鼠处死，剪下被灌流肠段，用尺测量其长度(l)和内径(r)。根据以下公式计算药物吸收速率常数(K_a)和表观吸收系数(P_app)。

$K_a=(1-\frac{C_{out}}{C_{in}}·\frac{V_{out}}{V_{in}})·\frac{Q}{{\mathrm{\pi r}}^{2}l}$

$P_{app}=\frac{-Q·ln(\frac{C_{out}}{C_{in}}·\frac{V_{out}}{V_{in}})}{2\pi rl}$

C_out为流出管中供试液药物的浓度；C_in为流入管中供试液中药物的浓度；V_out为收集管中流出液的体积；V_in是流入的供试液的体积。

图8(K_a)，图9(P_app)为大鼠原位单向肠灌流结果。载药纳米结构脂质载体在各个肠段的吸收均强于溶液组，对于K_a，多西他赛-油酸纳米结构脂质载体相对于多西他赛-油酸溶液组在十二指肠，空肠，回肠，结肠分别显著性提高了1.4倍,2.0倍,1.9倍和1.5倍；多西他赛纳米结构脂质载体的K_a相对于多西他赛溶液组仅在空肠，回肠显著性提高了1.6倍和2.0倍。对于P_app，多西他赛-油酸纳米结构脂质载体相对于多西他赛-油酸溶液组在十二指肠，空肠，回肠，结肠分别显著性提高了1.6倍,2.3倍,2.1倍和1.5倍；多西他赛纳米结构脂质载体的P_app相对于多西他赛溶液组仅在空肠，回肠分别显著性提高了1.7倍和2.1倍。结果证明实施例3所构建的纳米结构脂质载体能显著提高药物的肠吸收，且基于core-match机理的纳米结构脂质载体具有更好的肠吸收。

实施例7

纳米结构脂质载体在大鼠肠道的吸收分布

大鼠禁食(自由饮水)12h后，分别灌胃包载香豆素-6的纳米结构脂质载体和香豆素-6溶液剂，50min后，猝死大鼠。分别取出约1cm长的十二指肠、空肠、回肠和结肠，冰冷的PBS(pH7.4)清洗干净后，外翻，置于包埋剂(OTC)中于-80℃冷冻。将冷冻的肠段切成10um厚的薄片，分别置于表面凃有阳离子树脂的载玻片上，用4％的多聚甲醛室温固定10min。PBS(pH7.4)清洗两次后，用罗丹明鬼笔环肽于37℃染色120min。再次清洗后，用DAPI染色10min。最后滴加封片液，加置盖玻片，进行共聚焦成像。

由图10可以看出，纳米结构脂质载体在整个肠段的荧光强度均明显强于溶液剂。由重叠后的图片可以看出，蓝色和绿色荧光的叠加区域制剂组比溶液组更深。可以观察到香豆素-6被小肠细胞吸收后，可向更深的部位渗透，说明纳米结构脂质载体能够促进药物在小肠的吸收。

实施例8

纳米结构脂质载体在小鼠肠道的吸收分布

小鼠禁食(自由饮水)12h后，分别灌胃包载DiR的纳米结构脂质载体和DiR溶液剂。分别于给药后第2h，4h，8h猝死小鼠，取出除盲肠外的整个肠段。用生理盐水清洗取出的肠段，并立即用活体成像仪检测荧光强度。

由图11可以看出，纳米结构脂质载体在整个肠段的荧光强度均明显强于溶液剂。随着时间的推移，DiR在小鼠肠道内逐渐被清除，荧光强度逐渐变弱至消失。但8h后纳米结构脂质载体在肠细胞内仍然能保持一定的荧光强度，说明纳米结构脂质载体能够促进药物在肠道的吸收。

实施例9

纳米结构脂质载体肠道吸收机制研究

精密移取多西他赛-油酸纳米结构脂质载体适量，用K-R液稀释得到浓度为25μg/mL的供试液。将大鼠禁食(自由饮水)12h，用质量分数为20％的乌拉坦腹腔注射麻醉(1.0g/kg)，固定，置于恒温手术台上以保持体温。沿腹中线剪开3～4cm的开口，打开腹腔，剪下回肠，K-R液洗净内容物，去除肠系膜，将肠囊外翻并置37℃K-R液中。剪成80-100mg的肠环，置于24孔板中，加入1mLK-R液洗两遍，分别加入氯丙嗪溶液、吲哚美辛溶液、秋水仙碱溶液、槲皮素溶液和叠氮钠溶液各1mL(n＝3)，于37℃水浴中孵育45min。去除上述溶液，各孔均加入供试液1mL，37℃水浴中继续孵育45min。去除药液，加入冰冷的K-R液，洗三遍，终止摄取。4℃保存，待测。同时，该实验还在4℃和不加摄取抑制剂的条件下进行，作为对照。药物相对吸收率(R_r)按照下式计算：

$R_r\left(\%\right)=\frac{A_e/m_e}{A_c/m_c}\times 100\%$

其中，A_e和A_c分别为实验组和对照组样品的峰面积，m_e和m_c分别为实验组和对照组样品的质量。

如图12所示，当外翻肠环中加入网格蛋白抑制剂氯丙嗪、小窝蛋白抑制剂吲哚美辛、巨胞饮抑制剂秋水仙素、小窝蛋白和网格蛋白非依赖内吞抑制剂槲皮素、能力耗竭剂叠氮钠后，多西他赛-油酸前药纳米制剂的摄取量显著降低(p＜0.01)至对照组的39.68％，69.94％，77.59％，61.30％，62.24％。表明纳米粒是经上述五种途径介导的内吞入胞并且整个摄取过程是能量依赖的。其中，网格蛋白介导的内吞是最重要的途径。

实施例10

纳米结构脂质载体经MDCK细胞吸收情况

将MDCK细胞以1×10⁴/孔/mL接种于6孔培养板中，置于CO₂培养箱中。24h后，用37℃的DMEM高糖培养液(无血清)洗涤2-3次，于培养箱中培养30min，小心弃去培养液，加入1mL的1μg/mL香豆素-6乙醇溶液和包载香豆素-6的纳米结构脂质载体，分别于37℃恒温摇床中振荡1h,3h和5h。孵化结束后，弃去培养液，加入4℃的PBS终止细胞摄取，PBS洗3次。加500uL4％多聚甲醛37℃固定10min,PBS洗3次。然后加入500uL0.5％TritonX-100以增加细胞通透性，PBS洗3次。将盖玻片取出，细胞面朝上至于平面上，在暗室下，向盖玻片上加入100uLDAPI溶液，再次放入湿盒中。37℃振荡1h。弃去溶液，PBS洗3次，取出盖玻片，置于滴有封固液的载玻片上，于共聚焦显微镜下观察。

由图13可知，溶液组和纳米粒组对香豆素-6的吸收随着时间的推移逐渐增加，但在每一时间段，纳米结构脂质载体组的吸收均显著高于溶液组，说明纳米结构脂质载体能够促进药物经MDCK细胞的吸收。

实施例11

多西他赛-油酸纳米结构脂质载体药代动力学研究

取35只健康、雄性大鼠，体重200g左右，随机分为5组，给药前禁食12h，自由饮水。一组静脉注射多西他赛溶液(5mg/kg)作为对照，另四组分别口服给药多西他赛-油酸溶液(53.2mg/kg)，多西他赛-油酸纳米结构脂质载体(53.2mg/kg)，多西他赛溶液(40mg/kg)，多西他赛纳米结构脂质载体(40mg/kg)，于规定的时间点眼眶取血，通过液相色谱-质谱联用仪测定药物浓度。

由图14可知，与多西他赛溶液组和多西他赛纳米结构脂质载体组相比，多西他赛-油酸前药纳米结构脂质载体的生物利用度提高了4.04倍和2.06倍。表明基于core-match机理包载多西他赛-油酸前药的纳米结构脂质载体能显著提高多西他赛的口服生物利用度。