硫代磷酸酯衍生物与过量溴乙酮基芳环物的反应及产物

技术领域

本发明属于化学生物领域，涉及一类新的化合物、化学反应和生物技术。硫代磷酸 酯衍生物和溴乙酮基芳环衍生物在一定条件下发生反应生成含有硫醚的磷酸三酯产物。 当溴乙酮基芳环衍生物是α-溴对羟基苯乙酮(CAS编号2491-38-5)时，得到的含有硫 醚的磷酸三酯产物可以在光照条件下转变为磷酸二酯类物质。

技术背景

硫代磷酸酯衍生物的硫原子具有较强的亲核性，有报道表明一些含溴类化合物可与 硫代磷酸酯衍生物发生化学计量比为1：1的亲核取代反应，生成相应的硫代磷酸酯类 化合物[1-2]。本发明发现，硫代磷酸酯衍生物和溴乙酮基芳环衍生物在一定条件下，可 发生化学计量比为1：2的反应，生成含有硫醚的磷酸三酯产物(图3)。该类含有硫醚 的磷酸三酯产物和该类化学反应，从未见报道，是一类新的化合物和化学反应。该类化 合物和化学反应在药物合成、生物修饰等领域均有广泛的应用前景。

通过本发明发现的化学反应，可以将含有硫代磷酸酯骨架的核酸修饰为含有硫醚的 磷酸三酯骨架的核酸，是一种化学修饰核酸的新方法。当反应物溴乙酮基芳环衍生物是 α-溴对羟基苯乙酮(CAS编号2491-38-5)时，得到的含有硫醚的磷酸三酯骨架的核酸 可以在光照条件下转变为正常的含有磷酸二酯骨架的核酸，是一种合成具有光响应性能 的核酸新方法。光响应性核酸被广泛地用于光控基因表达、细胞内生化分析等重要领域 [3-4]。

发明内容

本发明涉及一种重排反应，需要两种带有特定结构的反应物，其中一种反应物为硫 代磷酸酯衍生物：可指一般的硫代磷酸酯类有机小分子或者盐，也可指含硫代磷酸酯基 团的大分子，如含硫代磷酸骨架的核酸等；另一种反应物为溴乙酮基芳环衍生物：与溴 相连的碳原子上的氢可以被不同的取代基取代，芳环上也可连不同的取代基；这两种反 应物若按照等比例混合，只能发生一般的亲核反应生成1:1产物，而本发明所指的重排 反应需要满足以下投料比：带溴乙酮基的芳环体系的物质的量为硫代磷酸酯衍生物的两 倍及其以上时，并在一定条件下可经过中间产物(1:1产物)重排后，继续与带溴乙酮 基的芳环体系发生亲核反应得到含有硫醚的磷酸三酯产物(1:2产物)，如图3所示。

本发明中的反应条件可分为两类：一、有机小分子之间反应一般在有机体系中， 反应需要在有机溶剂和碱性环境下进行，有机溶剂即乙醇、乙腈、二氯甲烷等所有有机 溶剂，碱性物质不仅可以是碱类物质，如氢氧化钠，也可以是弱酸强碱盐，如碳酸钾、 碳酸铯等，可室温反应或者加热回流反应；二、含生物大分子的反应物一般在水溶液体 系或者水与有机溶剂混合体系中，反应过程加入一定的缓冲液，如磷酸盐缓冲、碳酸盐 缓冲、MES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲等，pH 可在4～10之间，可在10℃～100℃反应。

本发明能够使含硫代磷酸骨架的核酸衍生物在光照条件下转化为正常磷酸骨架的 核酸：带硫代磷酸骨架的核酸与过量α-溴对羟基苯乙酮(CAS编号2491-38-5)反应后， 得到的含有硫醚的磷酸三酯骨架的核酸可以在光照条件下转变为正常的含有磷酸二酯 骨架的核酸。

发明的优点和积极效果：

1、本发明提出的含有硫醚的磷酸三酯类化合物是一类新化学物质，在药物合成和生物 分子修饰方面有潜在的应用价值。

2、本发明提出的新化学反应，简单高效，而且反应条件温和，一般只需要室温条件， 反应一定时间即可。

3、本发明的反应不仅适用于有机小分子体系，而且同样适用于生物大分子体系，可在 缓冲水溶液中反应。

4、本发明的重排反应对硫代磷酸骨架的核酸进行处理后，再经过光照，能够恢复到正 常核酸的磷酸骨架，是一种简单高效的光响应性核酸的合成方法。

附图说明

图1本发明中反应物硫代磷酸酯衍生物结构示意图

图2本发明中反应物溴乙酮基芳环衍生物结构示意图

图3本发明中反应推测机理流程图，以及含有硫醚的磷酸三酯衍生物结构示意图

图4合成DEPT-OH和含有硫醚的磷酸三酯衍生物TEEP-OH的流程图

图5含有硫醚的磷酸三酯衍生物TEEP-NO₂的结构简式以及单晶结构图

图6含有硫醚的磷酸三酯衍生物TEEP-OMe和TEEP-Naph的结构简式

图7硫代磷酸骨架的核酸经过本发明的重排反应以及光照后恢复正常核酸骨架的流 程图

图8核酸T15-1PS修饰前后及修饰后光照的PAGE结果图

图9核酸硫代8-17DNAzyme和10-23DNAzyme修饰前后及修饰后光照的PAGE结 果图

具体实施方式

1、在有机体系中，硫代磷酸酯衍生物和溴乙酮基芳环衍生物按照1:2物质的量(若按 1:1比例加入时可得到1:1反应产物，其余步骤同下)加入一定量的有机溶剂中混合均 匀，一般每1mmol反应物加入5～50mL溶剂，再加入碱性物质于反应物0.1～100倍当 量，室温或者加热回流并不断搅拌下反应0.1h～72h，具体反应是否完全可通过薄层色 谱(TLC)点板观察判断。当反应完全后，先减压蒸馏除去反应溶剂，并用乙酸乙酯和 水的混合溶液处理残留物，通过萃取收集有机相，再用水洗涤三次后用无水硫酸钠进行 干燥，最后减压除去有机溶剂即可得到所需的产物。得到的物质可经过质谱和核磁检验 是否为目标产物及其纯度。

2、在水溶液体系或者水和有机溶剂混合体系中，一般有生物大分子作为反应物，溴乙 酮基芳环衍生物的物质的量为硫代磷酸酯衍生物的2～1000倍，两反应物溶解于pH在 4～10之间的缓冲体系，如磷酸盐缓冲、碳酸盐缓冲、MES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲、 HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲等，若其中一个反应物为有机小分子，可加入适当 比例的有机溶剂保证小分子溶解即可，在10℃～100℃反应0.5h～200h，反应完可通过 超过滤器(Amicon)去除过量的小分子，将产物进行纯化。对于蛋白质、核酸等生物大 分子，可通过聚丙烯酸凝胶电泳(PAGE)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)进行表征，验证产物。

3、含硫代磷酸骨架的核酸转化成正常磷酸骨架的核酸：将含硫代磷酸骨架的核酸用溴 乙酮基芳环衍生物小分子进行修饰，选择上述具体实施方式2的条件：先将溴乙酮基芳 环衍生物小分子溶解在有机溶剂中，配成1mM～1000mM溶液；准备50μM～500uM硫 代磷酸骨架的核酸水溶液和浓度为10mM～500mM、pH在4～10之间的缓冲体系，三者 等体积混合，也可根据小分子的溶解性适当再加入0.1％～50％有机溶剂，只要保证溴乙 酮基芳环衍生物小分子的量至少为核酸上的硫代位点数的两倍及其以上，反应效果较佳 的比例是前者的量为后者硫代位点数的20～100倍之间，在10℃～100℃反应0.5h～200h， 反应完可通过超过滤器(Amicon)去除过量的小分子，将修饰产物进行纯化。修饰产物 在200～400nm紫外灯下光照1～30min能够得到正常磷酸骨架的DNA。通过聚丙烯酸 凝胶电泳(PAGE)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行表征， 验证修饰产物和光照产物。

实施实例：

实施实例一：含有硫醚的磷酸三酯代表化合物TEEP-OH的合成

1、将0.42g(2mmol)O,O-二乙基硫代磷酸钾盐分散于50mL乙腈中，再逐渐加入0.86g (4mmol)2-溴-4羟基苯乙酮和1.38g(10mmol)碳酸钾固体；室温不断搅拌下反应3h， 通过薄层色谱(TLC)点板观察反应完全。之后，减压蒸馏除去反应溶剂，并用50mL 乙酸乙酯和50mL水的混合溶液处理残留物，通过萃取收集有机相，再用50mL水洗涤 三次后用无水硫酸钠进行干燥，最后减压除去乙酸乙酯，得到产物TEEP-OH(结构与 重排机理见图4)，淡黄色固体粉末0.81g，产率92％。通过质谱和核磁检验目标产物及 其纯度，核磁结果：1HNMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm):10.45(s,1H),9.69(s, 1H),7.91(d,2H),7.29(d,2H),6.87(d,2H),6.76(d,2H),6.30(s,1H),4.28(s,2H),4.03(q, 4H),1.17(t,6H).13C-NMR(300MHz,CD3CN),δ(ppm):192.8,162.0,157.6,145.2,131.3, 127.6,126.7,126.4,115.4,115.3,109.9,64.8,39.0,15.4.质谱结果：C₂₀H₂₃O₇PS[M+Na]⁺理论值461.1，实际值461.1.

实施实例二：化合物TEEP-OH的对比化合物DEPT-OH的合成

2、为了与实例一的产物进行对比，将实施实例一中的原料按照1:1物质的量配比进行反 应：将0.42g(2mmol)O,O-二乙基硫代磷酸钾盐分散于50mL乙腈中，再逐渐加入0.43 g(2mmol)2-溴-4羟基苯乙酮和0.69g(5mmol)碳酸钾固体；室温不断搅拌下反应15 min，通过薄层色谱(TLC)点板观察反应完全。之后，减压蒸馏除去反应溶剂，并用 50mL乙酸乙酯和50mL水的混合溶液处理残留物，通过萃取收集有机相，再用50mL 水洗涤三次后用无水硫酸钠进行干燥，最后减压除去乙酸乙酯，得到产物DEPT-OH(结 构与反应流程见图4)，白色粉末0.54g，产率89％。通过质谱和核磁检验目标产物及其 纯度，核磁结果：1HNMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm):11.52(s,1H),7.88(d,2H),6.87 (d,2H),4.45(s,1H),4.40(s,1H),4.08(q,4H),1.23(t,6H).13C-NMR(300MHz, DMSO-d6),δ(ppm):191.9,163.1,131.6,127.1,115.9,63.8,37.9,16.3.质谱结果： C₁₂H₁₇O₅PS,[M-H]^-理论值303.3，实际值303.0.确认实例一中1:2比例反应产物 TEEP-OH和本实例1:1比例反应产物DEPT-OH后，再分别测磷谱，同时测反应物O,O- 二乙基硫代磷酸钾盐的磷谱，并以磷酸作为基准物，结果显示如下表：

实施实例三：含有硫醚的磷酸三酯代表化合物TEEP-NO₂的合成

3、将0.42g(2mmol)O,O-二乙基硫代磷酸钾盐分散于50mL乙腈中，再逐渐加入0.98g (4mmol)2-溴-4-硝基苯乙酮和1.38g(10mmol)碳酸钾固体；室温不断搅拌下反应2h， 通过薄层色谱(TLC)点板观察反应完全。之后，减压蒸馏除去反应溶剂，并用50mL 乙酸乙酯和50mL水的混合溶液处理残留物，通过萃取收集有机相，再用50mL水洗涤 三次后用无水硫酸钠进行干燥，最后减压除去乙酸乙酯，得到产物TEEP-NO₂(结构见 图5)，黄色固体粉末0.94g，产率95％。通过质谱和核磁检验目标产物及其纯度，核磁 结果：¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆),δ(ppm):8.38(d,2H),8.27(d,2H),8.24(d,2H),7.70 (d,2H),7.17(s,1H),4.71(s,2H),4.10(q,4H),1.22(t,6H).¹³C-NMR(300MHz,DMSO-d₆), δ(ppm):193.7,150.6,146.9,141.3,141.2,140.6,140.5,130.4,125.5,124.4,120.7,65.2, 41.0,16.4.质谱结果：C₂₀H₂₁N₂O₉PS[M+Na]⁺理论值519.1，实际值519.1。同时，将产 物粉末0.5g溶于5mL乙醇：乙腈＝1:1(v/v)混合溶剂中,＝，室温蒸发结晶2天，可得到 黄色块状晶体，通过X射线衍射(XRD)测得单晶结构，如图5所示。

实施实例四：含有硫醚的磷酸三酯代表化合物TEEP-OMe的合成

4、将0.21g(1mmol)O,O-二乙基硫代磷酸钾盐分散于20mL乙腈中，再逐渐加入0.46g (2mmol)2-溴-4-甲氧基苯乙酮和0.83g(6mmol)碳酸钾固体；室温不断搅拌下反应4h， 通过薄层色谱(TLC)点板观察反应完全。之后，减压蒸馏除去反应溶剂，并用30mL 乙酸乙酯和30mL水的混合溶液处理残留物，通过萃取收集有机相，再用30mL水洗涤 三次后用无水硫酸钠进行干燥，最后减压除去乙酸乙酯，得到产物TEEP-OMe(结构见 图6)，黄色固体0.40g，产率86％。通过质谱验证：C₂₂H₂₇O₇PS[M+Na]⁺理论值489.1， 实际值489.1。

实施实例五：含有硫醚的磷酸三酯代表化合物TEEP-Naph的合成

5、将0.32g(1.5mmol)O,O-二乙基硫代磷酸钾盐分散于30mL乙腈中，再逐渐加入 0.75g(3mmol)2-溴乙酰基萘和1.38g(10mmol)碳酸钾固体；室温不断搅拌下反应4h， 通过薄层色谱(TLC)点板观察反应完全。之后，减压蒸馏除去反应溶剂，并用50mL 乙酸乙酯和50mL水的混合溶液处理残留物，通过萃取收集有机相，再用50mL水洗涤 三次后用无水硫酸钠进行干燥，最后减压除去乙酸乙酯，得到产物TEEP-Naph(结构见 图6)，淡黄色固体0.71g，产率94％。通过质谱验证：C₂₈H₂₇O₅PS[M+Na]⁺理论值506.1， 实际值529.1。

实施实例六：含有1个硫醚的磷酸三酯修饰的核酸DNA的合成及光照后恢复为正常 DNA

6、先将15μL600μM硫代(PS)DNAT15-1PS(序列详见图8)水溶液中，加入15μL 100mMpH＝6.0磷酸钠盐缓冲溶液和10μL40mM2-溴-4-羟基苯乙酮溶液(溶于二甲基 甲酰胺DMF中)，混合溶液室温反应65h，反应后用3KAmicon进行离心除去过量的 小分子2-溴-4-羟基苯乙酮，并用10mMpH＝6.0磷酸钠盐缓冲溶液洗涤6次后，紫外- 可见分光光度计进行最终DNA浓度测定；取10μL50μM修饰后的DNA进行紫外365 nm光照15min；修饰和光照反应的流程见图7。然后将修饰前的硫代DNA(T15-1PS)、 修饰后的DNA(T15-1PS-TEEP)、修饰后加光照的DNA(T15-1PS-TEEP+UV)进行 聚丙烯酸凝胶电泳(结果见图8)，以及MALDI-TOF-MS表征(测试前进行脱盐处理)： T15-1PS理论分子量4517，实际分子量4516；T15-1PS-TEEP理论分子量4786，实际 分子量4789；T15-1PS-TEEP+UV理论分子量4511(T₁₅)，实际分子量4505。表征结果 验证了反应流程图7，说明硫代的DNA经过本发明的重排修饰以及光照处理能够恢复 正常磷酸骨架的DNA。

实施实例七：含有1个和3个硫醚的磷酸三酯修饰的核酸DNA的合成及光照后恢复为 正常DNA

7、将8-17DNAzyme的1PS和3PS两种不同硫代的DNA，以及10-23DNAzyme的1PS 和3PS两种不同硫代的DNA分别配成10μL800μM的水溶液，再分别加入10μLDMF， 10μL100mMpH＝6.0磷酸钠盐缓冲溶液和10μL50mM2-溴-4-羟基苯乙酮溶液(溶于 二甲基甲酰胺DMF中)，其中含1PSDNA的混合溶液在37℃下反应6h，含3PSDNA 的混合溶液在37℃下反应20h，反应后用3KAmicon进行离心除去过量的小分子2- 溴-4-羟基苯乙酮，并用10mMpH＝6.0磷酸钠盐缓冲溶液洗涤6次后，紫外-可见分光光 度计进行最终DNA浓度测定；取10μL50μM修饰后的DNA进行紫外365nm光照15 min；然后将修饰前的硫代DNA、修饰后的DNA、修饰后加光照的DNA进行聚丙烯酸 凝胶电泳(结果见图9)，以及MALDI-TOF-MS表征(测试前进行脱盐处理)： 8-17-1PS-TEEP理论分子量10389，实际分子量10387；8-17-1PS-TEEP+UV理论分子 量10104(8-17)，实际分子量10104；8-17-3PS-TEEP理论分子量10960，实际分子量 10948，8-17-3PS-TEEP+UV理论分子量10104(8-17)，实际分子量10108； 10-23-1PS-TEEP理论分子量10554，实际分子量10559；10-23-1PS-TEEP+UV理论分 子量10269(10-23)，实际分子量10264；10-23-3PS-TEEP理论分子量11124，实际分子 量11123，10-23-3PS-TEEP+UV理论分子量10269(10-23)，实际分子量10273；表征结 果验证了反应流程图7，说明不同硫代个数以及不同种类的DNA经过本发明的重排修 饰以及光照处理均能够恢复正常磷酸骨架的DNA。