乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的快速分子鉴定方法

技术领域

本发明属于中药材品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的单核苷酸多态性 （singlenucleotidepolymorphism，SNP）位点对乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草以及乌 拉尔甘草与胀果甘草或光果甘草杂交后产生的样本进行准确鉴定和区分。

背景技术

甘草作为最广泛使用的药用植物之一，在中国、美国、英国、欧洲、日本药典中均有 收载。2015版《中国药典》同时收载乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、光果甘 草(G.glabraL.)、胀果甘草(G.inflataBat.)的干燥根和根茎作为甘草药材的来源，我 国主产品种为乌拉尔甘草。但不同品种的甘草在不同国家和地区的分布具有差异，例如，在 美国和欧洲部分地区，光果甘草是最主要的药用品种。

甘草的传统形态学鉴定方法主要依赖于植物的地上部分特征，难以对甘草药材、 饮片以及各种加工品进行品种鉴定。显微鉴定方面，药材横切面的射线形态虽可作为甘草 品种区分的依据之一，但存在样品前处理困难、判别标准难以量化等问题，也无法对深加工 的药材饮片或粉末进行鉴定。化学成分方面，甘草的成分十分复杂，通过药材指纹图谱分析 也较难实现同属植物不同种的准确区分和鉴定。

DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在 物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种生物身份识别系统，从而实现对物种的快速 准确鉴定。Kenji等曾对不同品种甘草的ITS序列进行扩增和分析比对，发现胀果甘草和光 果甘草的ITS序列完全相同，同时与乌拉尔甘草的ITS序列在4个碱基位点存在差异（Biol. Pharm.Bull.2007,30,1497—1502）。因此，ITS序列中的SNP（singlenucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）位点可用于乌拉尔甘草的鉴定。但文献（J.Nat.Prod., 2015,78,2007–2022）及本研究团队的实验结果（图1）均表明，在进行甘草样品的ITS序列 扩增时，Kenji等所使用的ITS通用引物ITS4/5的扩增成功率和扩增效率较低，因此尚需通 过设计甘草ITS专属引物来提高PCR的准确性。此外，胀果甘草和光果甘草尚无较好的分子 鉴定方法。Kenji等筛选了叶绿体基因中的4个不同片段，仅trnH-psbA转录间隔区序列仅能 对大约80%的胀果甘草和光果甘草进行区分，仍有20%左右的样品无法通过目前已知的SNP 位点进行区分和鉴定（Biol.Pharm.Bull.2007,30,1497—1502）。因此，对于三个重要 的甘草药用品种，目前尚缺乏准确、高效的分子鉴定方法。

本发明设计了用于甘草ITS序列扩增的特异性引物，继而对甘草中多个叶绿体DNA 片段进行了扩增和筛选，最终将甘草ITS序列和ndhC-trnV转录间隔区序列的SNP位点相结 合，建立了对乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草三个近缘物种及其杂交品种进行快速品种鉴 定的方法，有利于实现甘草的种苗培育、药材和饮片生产的规范化。

发明内容

本发明第一个目的在于提供乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的鉴定用SNP标记。

本发明第二个目的在于提供甘草鉴定用SNP标记在不同品种甘草鉴定中的应用。

本发明第三个目的在于提供不同品种甘草的快速分子鉴定方法和流程。

本发明提供的乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品种的鉴定用SNP位点， 其核苷酸序列如SEQIDNo.1/2（ITS序列）和SEQIDNo.3/4（ndhC-trnV转录间隔区序列） 所示，自ITS序列的5’端起第159位为C或T，第383-385位为TGC或CAA；自ndhC-trnV转录间隔 区序列的5’端起第487位为A或T。

本发明提供的SNP位点可用于鉴定乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品 种：如果ITS序列5’端起第159位为C，且第383-385位为TGC，则鉴定为乌拉尔甘草；如果ITS 序列5’端起第159位为T，第383-385位为CAA，且ndhC-trnV转录间隔区序列5’端起第487位 为A，则鉴定为光果甘草；如果ITS序列5’端起第159位为T，第383-385位为CAA，且ndhC-trnV 转录间隔区序列5’端起第487位为T，则鉴定为胀果甘草。如果ITS序列5’端起第159位同时 存在C和T，383-385位同时存在TGC和CAA，则鉴定为乌拉尔甘草与胀果甘草或光果甘草杂交 后产生的杂交品种。

本发明提供的乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的鉴定方法，包括以下步骤：

1）以合适的方法提取样品DNA；

2）以待测样品DNA为模板，通过PCR反应扩增ITS序列；

3）对扩增产物进行测序，确定ITS序列的5’端起第159位和第383-385位的碱基。共有三 种可能情况：情况一，如果ITS序列的5’端起第159位碱基为C，383-385位的碱基为TGC，则样 品鉴定为乌拉尔甘草，鉴定结束；情况二，如果ITS序列的5’端起第159位碱基为C和T共存， 383-385位的碱基为TGC和CAA共存，则样品鉴定为杂交品种，鉴定结束；情况三，如果ITS序 列的5’端起第159位碱基为T，383-385位的碱基为CAA，则进行步骤4）；

4）以待测样品DNA为模板，通过PCR反应扩增ndhC-trnV转录间隔区序列；

5）对扩增产物进行测序，确定ndhC-trnV转录间隔区序列的5’端起第487位的碱基。测 序结果共有两种可能情况：情况一，如果ndhC-trnV转录间隔区序列的5’端起第487位碱基 为A，则样品鉴定为光果甘草，鉴定结束；情况二，如果5’端起第487位碱基为T，则样品鉴定 为胀果甘草，鉴定结束。

通过以上五个步骤，可实现乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品种的区分 和鉴定。其中，杂交品种特指乌拉尔甘草与胀果甘草杂交后形成的后代，或乌拉尔甘草与光 果甘草杂交后形成的后代。

本发明的独创性在于，一是设计了甘草ITS序列特异性引物，用于甘草属植物ITS 序列的高效扩增；二是首次发现叶绿体DNA中位于ndhC-trnV转录间隔区的一个全新SNP位 点，可用于胀果甘草和光果甘草的区分。将ITS序列与ndhC-trnV转录间隔区序列相结合，可 进行三个品种的准确鉴定。

附图说明

图1中a为使用ITS通用引物（ITS4/5）对甘草ITS序列进行扩增后的电泳结果，图1 中b为使用本发明所设计的甘草ITS特异性引物对甘草ITS序列进行扩增后的电泳结果。对 比可见，通用引物ITS4/5对甘草ITS序列的扩增错误率高（图1，a），而甘草ITS特异性引物可 显著提高甘草ITS序列的扩增成功率和扩增效率（图1，b）。

图2为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的ITS序列的SNP碱基情况 图。

图3为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草的ITS序列比对结果。

图4为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草的ndhC-trnV转录间隔区序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用以对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。下述实 施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可 从商业途径获得。

实施例1、野生甘草样本的品种鉴定。

1）从国内甘草的多个主要产区，收集野生甘草样本56份（均为干燥根），样品具体 信息如表1所示。用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取样品的 总DNA，具体步骤如下：

①取药材粉末50mg于1.5mLEP管中，加入液氮和少量石英砂，用研磨棒充分研磨；

②向研磨后的药材粉末中加入700μL65℃预热的缓冲液GP1(含0.5%巯基乙醇），迅速混 匀，65℃水浴40min；

③加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min；

④将水相转入一新离心管中，加入700μL缓冲液GP2，混匀；

⑤将液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃去废液；

⑥向吸附柱CB3中加入500μL去蛋白液GD，12000rpm离心30s，弃废液；

⑦加入600μL漂洗液GW，12000rpm离心30s，弃废液；

⑧重复步骤⑦；

⑨将吸附柱CB3放回废液收集管中，12000rpm离心2min，并将吸附柱CB3置于室温数分 钟，以彻底晾干残余的漂洗液；

⑩将吸附柱CB3转入一个新的离心管中，向吸附膜的中空部位悬空滴加50μLddH2O，室 温下放置3min，12000rpm离心2min，得样品的总DNA溶液，-20°C储存备用。

2）PCR扩增

引物序列为：ITS-F,GAAGGATCATTGTCGATGCC;ITS-R,GCGTTCAAAGACGCCTATTGG; ndhC-trnV-F,AGACCATTCCAATGCCCCCTTTCGCC;ndhC-trnV-R,GTTCGAGTCCGTATAGCCCTA。 引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，并分别用无菌去离子水溶解并稀释至10μM。

PCR反应体系：包含模板DNA0.5μL，正向及反向引物各1μL，TransStartKD PlusDNA聚合酶0.4μL，TransStartKDPlusBuffer4μL，dNTPs(2.5mM)0.4μL， 加无菌去离子水补齐至20μL。PCR反应程序：94°C预变性3min，然后进行35个循环：94°C变 性30s，56°C复性30s，68°C延伸1min15s，循环结束后68°C延伸10min，4°C保存。

PCR反应结束后，取反应产物5μL用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像 仪上进行检测（图1）。

3）测序

电泳检测后剩余的PCR反应产物直接由北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，各 样品均采用正向和反向测序，然后将正反向测序结果进行拼接，以保证测序的准确性。

4）序列比对

使用BioEdit和DNAMAN软件进行测序结果的分析和序列比对。在ITS序列中存在四个品 种特异性SNP位点。乌拉尔甘草ITS序列的5’端起第159位为C，第383-385位为TGC；胀果甘草 和光果甘草ITS序列的5’端起第159位为T，第383-385位为CAA；对于乌拉尔甘草与胀果甘草 或光果甘草杂交后产生的样品，SNP位点则同时存在以上两种碱基（图2，3）。在ndhC-trnV序 列中可获得一个品种特异性SNP位点，光果甘草的5’端起第487位碱基为A，胀果甘草的5’端 起第487位碱基为T（图4）。以上来源于两段DNA条形码的五个SNP位点可特异性地用于乌拉 尔甘草、胀果甘草、光果甘草和杂交品种的鉴定。

表1野生甘草样本的品种鉴定

实施例2、甘草饮片的品种鉴定。

实验方法基本同实施例1，所不同的是样品由野生甘草样本换为市售甘草饮片，其 中包括甘草饮片生品31批，炮制品（蜜炙）2批。将甘草饮片在液氮下研磨提取DNA，并进行 PCR扩增和序列分析。甘草饮片信息和品种鉴定结果如表3所示。结果表明，该方法可对甘草 商品饮片的来源品种进行区分和鉴定。在扩增得到的ITS序列中均可以检测到上述4个SNP 位点，在ndhC-trnV转录间隔区可以检测到1个SNP位点。据此得到每批样品的鉴定结果。根 据测定结果，我国市售甘草药材和饮片的原植物来源以乌拉尔甘草为主。

表2甘草饮片的品种鉴定

实施例3、甘草种子及幼苗的品种鉴定。

实验方法基本同实施例1，所不同的是样品由甘草干燥根换为甘草种子和刚发芽 的甘草幼苗。结果表明，该方法可对甘草种子及幼苗进行品种鉴定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。

<110>北京大学

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<212>DNA

<213>乌拉尔甘草ITS序列

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<212>DNA

<213>胀果甘草和光果甘草ITS序列

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<213>乌拉尔甘草和光果甘草ndhC-trnV转录间隔区序列

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<213>胀果甘草ndhC-trnV转录间隔区序列

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