一种用于鉴别四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代染色体数的制片方法

技术领域

本发明涉及一种植物染色体的制片方法，特别涉及一种有效鉴别四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代染色体数的制片方法，本发明属于生物技术领域。

背景技术

四倍体大燕麦(AvenamagnaL.)是一个野生种,系异源四倍体，表现为对小麦白粉病、锈病、赤霉病高抗或免疫，以及具有早熟、抗旱，蛋白质(42％)、赖氨酸含量高等特点(孙泽民等.中国燕麦.北京:中国农业出版社,1989；余懋群等.3种燕麦的核型研究.武汉植物学研究,1995,13(2):177-179；邓光兵等.燕麦种间杂种F₁的形态学与细胞遗传学研究.作物学报,2005,31(9):1186-1191.)。为了使四倍体大燕麦的这些优良性状转移到普通小麦(TriticumaestivumL.)，最近十多年来，本课题组开展了一系列四倍体大燕麦与普通小麦的杂交和选育工作，获得了一批品质好的、稳定的杂交品系。有效了解这些杂交后代的染色体组成对于认识其杂交和染色体重组机制具有重要的作用。

植物染色体的制备有上百年的历史，使用的部位包括根尖、腋芽、茎尖、愈伤组织等生长旺盛的区域。小麦为世界范围内重要的粮食作物，因此人们很早就关注其染色体组成并做了大量的观察分析，流程大体如下(陈瑞阳等：植物有丝分裂染色体标本制备新方法.植物学报,1979,21(3):297-298；李懋学，张敩方.植物染色体研究技术.哈尔滨：东北林业大学出版社.)：

1.预处理：应用适宜的预处理液(如饱和的α-溴代奈、对苯二酚、一定浓度的8-羟基喹啉或秋水仙素溶液)或低温等。

2.低渗：通常用蒸馏水或0.075MKCl室温处理30分钟。

3.固定：最常用固定液为甲醇：冰醋酸(体积比3：1)。

4.解离：一种是酸解，酸解液为1N的浓盐酸或浓盐酸：95％乙醇(体积比1：1)；一种是酶解，即一定浓度的纤维素酶和果胶酶混合液。

5.后固定：解离后的材料水洗后用上述固定液固定。

6.制片：大多采用压片法或火焰干燥法。

7.染色：染色液有改良的苯酚品红、卡宝品红、孚尔根、吉姆萨等。

迄今国内有关燕麦染色体制备方面的报道很少，步骤也不很详细。武生辉等(武生辉等.野生大燕麦和砂燕麦的核型研究.内蒙古农牧学院学报,1989,10(2):115-120.)开展野生大燕麦和砂燕麦染色体制备的流程为：

预处理--0.002M8-羟基喹啉的0.01％-0.2％秋水仙素溶液，3小时；

酸解--1NHCl，60℃下，5-8分钟；

水洗--蒸馏水冲洗3-5次或冲洗1-2次后用水泡1小时；

酶解--2.5％果胶酶和纤维素酶混合液，26℃，40分钟；

染色--卡宝品红，5-20分钟。

余懋群等(余懋群等.3种燕麦的核型研究.武汉植物学研究,1995,13(2):177-179.)提供的砂燕麦、野生大燕麦、黑龙江野燕麦核型分析的步骤很简单，即：取萌发种子的根尖，在饱和α-溴代奈溶液0-4℃下预处理1夜后，用酒精、冰醋酸(3：1)固定液0-4℃下固定24小时，用孚尔根染色观察。

综上所述，到目前为止有关普通小麦和燕麦染色体制备的方法不外乎预处理、固定、解离、后固定、制片和染色等程序。为了探讨四倍体大燕麦与普通小麦杂交后代染色体的数目，我们最初也采用这种通用的技术处理根尖，然而结果并不理想，表现在：

第一，采用研究者们普遍使用的饱和α-溴代奈室温预处理3小时或用蒸馏水4℃低温过夜处理后，根尖细胞中的分裂相较少，染色体黏在一起，难以鉴别。而不经任何预处理后直接低渗、固定，根尖细胞中的分裂相较多，但染色体分散差。

第二，用蒸馏水或0.075MKCl室温前低渗处理30分钟达不到使染色体分散的效果。

第三，只用酶解或酸解难以使根尖有效软化、缺少后低渗、后固定的时间短于1小时、压片力度不足等，这些都影响到细胞的分散和染色体的分开。

因此，目前迫切需要提供一种可用于普通小麦和大燕麦染色体制备的方法，从而为大燕麦与普通小麦的杂交和选育工作提供技术支持。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，考虑到这两个亲缘关系较近的物种杂交后会发生染色体断裂、融合、易位等现象，从而导致细胞内染色体很粘稠，不易分开的特点，本发明人认为：恰当的预处理是必要的，但浓度需要调整；前低渗的时间需要延长；酶解和酸解应该合理结合从而保证植物材料能充分软化；增加后低渗以及后固定处理的时间。

为此，本发明提出了一种用于鉴别四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代染色体数的制片方法，具体步骤如下：

(1)预处理：0.075mol/LKCl溶液、饱和α-溴代萘溶液和蒸馏水按照体积比2：3：5配制成预处理液，将植物材料浸泡于预处理液中，22-25℃处理3小时后，水洗15分钟；

(2)固定：甲醇与冰醋酸按照体积比3：1配制成固定液，将预处理后的植物材料用固定液固定，22-25℃固定1小时，水洗15分钟；

(3)酶解：2％纤维素酶和2％果胶酶按照体积比1:1配制成酶解液，将固定后的植物材料用酶解液在37℃下酶解2小时，快速水洗，避免剧烈震荡；

(4)酸解：浓盐酸和95％乙醇按照体积比1：1配制成酸解液，将酶解后的植物材料用酸解液22-25℃处理1分钟，水洗15分钟；

(5)后低渗：酸解后的植物材料置于0.075mol/LKCl溶液中，22-25℃处理1小时；

(6)后固定：经后低渗处理后的植物材料采用步骤(2)中的固定液22-25℃固定1小时以上；

(7)制片：挑取2-3个经上述步骤处理后的植物材料，用玻棒用力砸碎后轻轻铺散到整个载玻片，而后进行火焰干燥；

(8)染色；

(9)压片。

在本发明中，优选的，所述的植物材料包括取自四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代的根尖或茎尖。

在本发明中，优选的，所述的染色包括在载玻片上滴加改良苯酚品红，加上盖片，22-25℃染色10分钟。

采用本发明的方法，我们对四倍体大燕麦与普通小麦杂交后代22个品系的染色体数目进行了分析，结果发现采用该方法得到的染色体制片中细胞分裂相多、染色体分散好，而且该方法重复性高，结果可靠，因此，本发明提供了一种能够有效鉴别四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代染色体的数目新方法。

附图说明

图1为采用常规制片方法观察到的细胞分裂相照片；

图1A为杂交后代品种S20的细胞分裂相照片(x200)，其中很难找到一个中期相；图1B为杂交后代品种S109-3-5的细胞分裂相照片(x200)，其中未见一个中期相；

图2为采用常规制片方法观察到的染色体的分散情况；

图2A为杂交后代品种S109-169的染色体的分散情况(x1000)，其中大部分染色体都绞在一起，难以数清；图2B为杂交后代品种张燕八号的细胞分裂相照片(x1000)，其中染色体黏在一起，无法数清；

图3为采用本发明的制片方法观察到的细胞分裂相照片；

图3A为杂交后代品种S20-211的细胞分裂相照片(x200)，其中能找到4个中期相；图3B为杂交后代品种张燕七号的细胞分裂相照片(x200)，其中能找到6个中期相；

图4为采用本发明的制片方法观察到的染色体的分散情况。

图4A为杂交后代品种S20-211的染色体的分散情况(x1000)，其中观察到染色体共有42条；图4B为杂交后代品种张燕七号的细胞分裂相照片(x1000)，其中观察到染色体共有43条。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1四倍体大燕麦与普通小麦杂交后代22个品系的染色体数目分析

1、材料准备

将获得的四倍体大燕麦与普通小麦杂交后代22个品系的种子用水浸泡后，置于湿润的滤纸上于25℃下培养萌发，待其根长至10mm左右时，切取根尖分生区，迅速按如下步骤操作。

2、制片

(1)预处理：0.075mol/LKCl溶液、饱和α-溴代萘溶液和蒸馏水按照体积比2：3：5配制成预处理液，将切取的根尖浸泡于预处理液中，25℃处理3小时后，水洗15分钟；

(2)固定：甲醇与冰醋酸按照体积比3：1配制成固定液，将预处理后的根尖用固定液固定，25℃固定1小时，水洗15分钟；

(3)酶解：2％纤维素酶和2％果胶酶按照体积比1:1配制成酶解液，将固定后的根尖用酶解液在37℃下酶解2小时，快速水洗，避免剧烈震荡；

(4)酸解：浓盐酸和95％乙醇按照体积比1：1配制成酸解液，将酶解后的根尖用酸解液25℃处理1分钟，水洗15分钟；

(5)后低渗：酸解后的根尖置于0.075mol/LKCl溶液中，25℃处理1小时；

(6)后固定：经后低渗处理后的根尖采用步骤(2)中的固定液25℃固定1小时；

(7)制片：挑取2-3个经上述步骤处理后的根尖，用玻棒用力砸碎后轻轻铺散到整个载玻片，而后进行火焰干燥；

(8)染色：在载玻片上滴加改良苯酚品红，加上盖片，25℃染色10分钟：

(9)压片：使用恰当的力压片使染色体有效散开。

3、染色体数目分析

将细胞制片置于显微镜下观察，并对染色体数目进行计数，结果如表1所示：

表1四倍体大燕麦与普通小麦杂交后代染色体数目的统计结果

以上结果表明，采用本发明方法得到的染色体制片染色体分散好，而且重复性高，结果可靠，能够有效鉴别四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代染色体的数目。

对比例1

为了说明本发明的制片方法(按照实施例1进行)相较于常规方法(武生辉等.野生大燕麦和砂燕麦的核型研究.内蒙古农牧学院学报,1989,10(2):115-120.)的有益效果，本发明进行了对比试验。

结果如图1-图4所示。

图1为采用常规制片方法观察到的细胞分裂相照片，图1A为杂交后代品种S20的细胞分裂相照片(x200)，其中很难找到一个中期相，图1B为杂交后代品种S109-3-5的细胞分裂相照片(x200)，其中未见一个中期相。

图2为采用常规制片方法观察到的染色体的分散情况，图2A为杂交后代品种S109-169的染色体的分散情况(x1000)，其中大部分染色体都绞在一起，难以数清，图2B为杂交后代品种张燕八号的细胞分裂相照片(x1000)，其中染色体黏在一起，无法数清。

图3为采用本发明的制片方法观察到的细胞分裂相照片，图3A为杂交后代品种S20-211的细胞分裂相照片(x200)，其中能找到4个中期相，图3B为张燕七号的细胞分裂相照片(x200)，其中能找到6个中期相。

图4为采用本发明的制片方法观察到的染色体的分散情况，图4A为杂交后代品种S20-211的染色体的分散情况(x1000)，其中观察到染色体共有42条，图4B为杂交后代品种张燕七号的细胞分裂相照片(x1000)，其中观察到染色体共有43条。

以上结果表明，相较于常规方法，采用本发明的方法得到的染色体制片中细胞分裂相多、染色体分散好，能够有效鉴别四倍体大燕麦、普通小麦或其杂交后代染色体的数目。