一种避孕节育DNA疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种避孕节育DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

计划生育是我国的一项基本国策，有效控制人口数量、显著提高人口质量是关系到国富民强、国家、民族兴旺发达的千年大计。研究安全有效、可控可逆、简便易行的避孕措施不仅有重要的科学意义，而且对国家、对民族具有重要的现实意义和长远的历史意义。

随着基因重组技术的发展和人们对受精过程的分子基础和详细机理认识的深入，开发有效的免疫性避孕、节育疫苗将可能成为控制人口过度增长的理想措施。其机理主要是应用在受精过程中发挥关键作用的分子作为靶抗原用于免疫目标人群使之产生相应免疫反应，从而阻断受精过程，达到避孕节育目的，例如如DNA疫苗。

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA(有时也可是RNA)，将其注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。该疫苗既具有减毒疫苗的优点。同时又无逆转的危险，因此越来越受到人们的重视，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。

目前世界上所采用的避孕措施主要以女性为主，有关避孕药物还不完善，有致畸、肝脏毒性等副作用，其遗传后果还有待进一步评估。实际上避孕男女均有责任，男性主动参与避孕节育将很好促进男女平等和社会进步。目前可供男性选择的避孕措施少，并且这些措施存在着对肌体有害、可能失败以及不可逆等严重缺点。因此研制雄性免疫节育疫苗更具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种达到避孕节育效果的DNA疫苗及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种避孕节育DNA疫苗，包含编码和表达SEQIDNO:1所示核苷酸序列的质粒，SEQIDNO:1所示核苷酸序列为Bin1b的cDNA第35个碱基至第371个碱基核酸序列。

Bin1b又名Spag11aspermassociatedantigen11A，位于Chromosome:8；NC_000074.6(19157887..19159578)。本发明选择Bin1b的cDNA第35个碱基至第371个碱基核酸序列作为靶抗原基因以及采用适宜的质粒载体pSG.SS.YL和pSG.SS.C3d.YL，成功构建了pSG.SS.YL.Bin1b(质粒图谱见图4)和pSG.SS.C3d.YL.Bin1b(质粒图谱见图5)重组真核表达质粒作为DNA疫苗。

本发明所采用的靶抗原基因包括和其等同的核苷酸序列，即由于密码子简并性，等同的核苷酸序列在基因序列上和本发明采用的序列不同，但是并没有改变最终编码蛋白的氨基酸序列。

其中，质粒pSG.SS.YL和pSG.SS.C3d.YL由梁培禾博士惠赠，质粒图谱分别见图1和图2。

作为优选，所述质粒由pSG.SS.YL和位于pSG.SS.YL中信号肽序列SS及终止密码子标签YL之间的SEQIDNO:1所示核苷酸序列组成，即pSG.SS.YL.Bin1b重组真核表达质粒。

同时，作为优选，本发明所述DNA疫苗包含编码和表达SEQIDNO:1所示核苷酸序列以及C3d核酸序列的质粒。进一步优选为，由pSG.SS.C3d.YL、位于pSG.SS.C3d.YL中信号肽序列SS和终止密码子标签YL之间的SEQIDNO:1所示核苷酸序列组成，即pSG.SS.C3d.YL.Bin1b重组真核表达质粒，所述pSG.SS.C3d.YL为在pSG.SS.YL信号肽序列SS和终止密码子标签YL之间串联3个C3d核酸序列的质粒。

此外，本发明还提供一种避孕节育DNA疫苗的制备方法，扩增SEQIDNO:1所示核苷酸序列并与质粒连接，转化后提取即得，SEQIDNO:1所示核苷酸序列为Bin1b的cDNA第35个碱基至第371个碱基核酸序列。

作为优选，所述制备方法中与SEQIDNO:1所示核苷酸序列连接的质粒为pSG.SS.YL或pSG.SS.C3d.YL。

作为优选，所述扩增以pYA3149-Bin1b为模板，以SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示序列为引物进行PCR扩增。本发明扩增引物前端添加有限制性内切酶BglⅡ(AGATCT)和BamHⅠ识别序列(GGATCC)，故在此基础上，所述连接优选为Bg1Ⅱ和BamHⅠ双酶切扩增产物和质粒，在16℃下用T4DNA连接酶连接1h。

本发明扩增采用的质粒pYA3149-Bin1b由李彦锋博士惠赠，质粒图谱见图3。

作为优选，所述PCR扩增扩增程序为：

94℃预变性5min；

94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸60s，循环30次；

72℃延伸10min，4℃保存。

作为优选，所述PCR扩增体系为：

加ddH₂O至50ul，混匀。

经过试验检测，本发明提供的pSG.SS.YL.Bin1b和pSG.SS.C3d.YL.Bin1b的DNA疫苗免疫雄鼠后，其精子活力、雌鼠受孕率、平均产仔数量显著降低，免疫避孕效果显著好于对照组。同时雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗体滴度显著升高，血清IL-2、INF-γ浓度显著降低，血清IL-4、IL-10浓度显著增加。表明本发明所述避孕节育DNA疫苗可有效诱导雄鼠产生免疫性避孕效应。

由以上技术方案可知，本发明以Bin1b的cDNA第35个碱基至第371个碱基核酸序列作为靶抗原基因、以pSG.SS.YL和pSG.SS.C3d.YL为适宜的质粒载体，成功构建了pSG.SS.YL.Bin1b和pSG.SS.C3d.YL.Bin1b重组真核表达质粒作为DNA疫苗，可有效达到避孕节育效果。

附图说明：

图1示pSG.SS.YL质粒图谱；

图2示pSG.SS.C3d.YL质粒图谱；

图3示pYA3149-Bin1b质粒图谱；

图4示pSG.SS.YL.Bin1b质粒图谱；

图5示pSG.SS.C3d.YL.Bin1b质粒图谱；

图6示Bin1b的cDNA第35个碱基至第371个碱基核酸序列琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中，M:DNAMarkerDL2000；1：Bin1bPCR产物；2：Bin1b/BglⅡ；3：Bin1b/BamHⅠ；

图7示不同重组质粒转染HEK293细胞后培养上清中表达产物的Westernblot分析；其中，A：pSG.SS.YL转染结果；B：pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b转染结果；C：pSG.SS.YL-Bin1b转染结果。

具体实施方式：

本发明公开了一种避孕节育DNA疫苗及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的DNA疫苗及其制备方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明实施例所涉及的主要材料及其试剂如下：

昆明小鼠雄性，体重20～22g/只，均为8周龄以上健康有生育力成年鼠；

酶联免疫检测仪(美国Biorad)，96孔酶标板(丹麦NUNC)；

HEK293细胞和Raji细胞购自美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)；

分子生物学操作所用工具酶购自日本TaKaRa公司；

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自美国Omega公司；

胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxford公司；

琼脂粉、琼脂糖等购自上海生工生物技术服务有限公司；

DMEM购自美国Gibco公司；

引物由上海鼎安生物科技有限公司合成；

脂质体转染剂Lipofetamine2000购自美国Invitrogen公司；

抗Bin1b羊抗多克隆抗体购自美国SantaCruz公司(SPAG11A/B，K-13，sc-103236)；

SP9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；

FITC标记的兔抗羊IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明所述DNA疫苗的制备

以pYA3149-Bin1b为模板进行PCR扩增反应获得337bp大小的目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致(图6)。其中，PCR扩增程序为：

94℃预变性5min；

94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸60s，循环30次；

72℃延伸10min，4℃保存。

PCR扩增体系为：

加ddH₂O至50ul，混匀。

BglⅡ分别酶切PCR产物和pSG.SS.C3d3.YL以及pSG.SS.YL，用PCR产物纯化试剂盒进行回收，对回收产物分别用BamHⅠ进行再酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳酶切产物后，紫外灯下分别切割含目的片段和载体的凝胶，用胶回收试剂盒进行回收。T₄DNA连接酶连接胶回收产物(16℃，1h)。

将连接产物转化已准备好的感受态大肠杆菌DH5α，铺LB琼脂平板(氨苄青霉素抗性)，37℃培养。进行质粒DNA转化。LB培养基重悬细菌，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，倒置平板待液体吸收后，37℃培养12-16小时，观察抗药菌落的出现。待菌落长出后挑取单个菌落，小量扩增，提取质粒，获得重组质粒pSG.SS.YL.Bin1b和pSG.SS.C3d.YL.Bin1b，即DNA疫苗。

实施例2：重组质粒的验证

对提取后的质粒pSG.SS.C3d3.Bin1b和pSG.SS.YL.Bin1b用BglⅡ和BamHⅠ双酶切进行鉴定，以PCR结果为对照。0.8％琼脂糖凝胶电泳酶切结果显示，近337bp处的条带为酶切后的目的片段，同时测序结果也显示该片段为目的基因，表明pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b和pSG.SS.YL.Bin1b构建成功。

实施例3：重组质粒Bin1b表达的间接免疫荧光检测

pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b和pSG.SS.YL.Bin1b转染人胚肾HEK293细胞，采用Lipofectamine转染试剂盒转染。

转染完成48h后，取出盖玻片，冰丙酮固定5min，根据SP9000试剂盒进行酶修复与抗原封闭，加入Bin1b抗体(1:400)，孵育40分钟，PBS洗去抗体，加入FITC标记的抗羊IgG(1:500稀释)室温孵育30分钟，荧光显微镜观察结果。

以pSG.SS.C3d3.YL空载体的免疫荧光结果为阴性相比，pSG.SS.YL.Bin1b和pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b的表达结果显示大量目的蛋白表达于胞浆和胞核中，表明本发明所述DNA疫苗在真核细胞中Bin1b表达成功。

实施例4：Westernblot鉴定

收集实施例3中转染细胞培养上清，离心后装入透析袋，置于PEG6000固体中将上清液浓缩50倍，紫外分光光度法进行蛋白定量并用上样缓冲液稀释至2500ug/ml后进行SDS-PAGE电泳，首先灌制聚丙烯凝胶，先灌下层的分离胶，再灌上层的浓缩胶，然后上样(每孔50ug/20ul)进行蛋白电泳(电压浓缩胶为90V，分离胶为140V)。电泳结束后，进行PVDF膜电转，100V恒压电转1h，移入4℃冰箱20V电转过夜。取出PVDF膜，放入加有封闭液的密封塑料袋中，室温摇动4h。洗膜后加入Bin1b抗体(1:400)，室温摇动1小时，加入二抗(HRP标记抗羊IgG，1:1000稀释)，室温摇动1小时，洗膜后显影：将PVDF膜置于NEN化学发光试剂中反应1-3min；在暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影(图7)。

重组质粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b及pSG.SS.YL.Bin1b转染HEK293细胞后，Westernblot检测显示细胞培养上清中存在分子量分别为116kD及6kD分子量的表达产物，与Bin1b-C3d3融合蛋白及Bin1b蛋白理论分子量(5.8KD)接近，而质粒pSG.SS.YL转染后无与抗Bin1b抗体结合的蛋白产物表达。

实施例5：免疫细胞化学染色鉴定

盖玻片多聚赖氨酸包被后置于6孔细胞培养板中，然后将处于对数生长期的HEK293细胞接种于其中，采用Lipofectamine转染试剂盒转染；转染后继续培养过程中，细胞爬附于盖玻片上。

冷丙酮固定5-10min，0.3％H₂O₂甲醇溶液(新鲜配制)室温浸泡30min。5ml/LTriton-X100在4℃条件下通透细胞膜2min。正常山羊血清室温下封闭20min，甩去多余液体。滴加一抗(1:500)，室温孵育40分钟，滴加二抗(HRP标记抗羊IgG，1:400稀释)，37℃孵育0.5h。DAB显色。苏木素复染10s，盐酸酒精分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，以胞浆内出现明确棕黄色颗粒判定为阳性，照相记录。

重组质粒转染HEK293细胞后，免疫细胞化学染色检测Bin1b表达，pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b为强阳性，pSG.SS.YL.Bin1b为阳性。

实施例6：pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b流式细胞仪鉴定

Raji细胞膜上具有丰富的CD21分子(C3d受体)，把其与不同表达产物共孵育，间接免疫荧光染色标记Bin1b抗原，只有当Bin1b与C3d3为融合蛋白时，才能使Raji细胞荧光标记为阳性，利用流式细胞仪测定阳性细胞比例。具体方法如下：获取不同质粒转染细胞培养上清，各取150ul与Raji细胞37℃孵育1h。PBS漂洗后滴加一抗，500ul重悬细胞，室温孵育45min。PBS漂洗后滴加二抗(FITC标记抗羊IgG，1:200稀释)重悬细胞，室温孵育45min。PBS重悬细胞后进行流式细胞仪检测。

重组质粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b及pSG.SS.YL转染HEK293细胞后，用流式细胞仪检测与不同培养上清共孵育后的Raji细胞表面Bin1b抗原存在情况，显示前者荧光标记阳性细胞比例高达89.2％，而后者仅为3.5％，说明本发明重组质粒可表达融合蛋白，且其中Bin1b可被相应抗体识别，而C3d与其受体结合的功能也未受到影响。

实施例7：免疫避孕效应检测

1、动物免疫程序

将24只雄性昆明小鼠随机均分为4组各6只，pSG.SS.YL.Bin1b组(Bin1b组)和pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b组(C3d3-Bin1b组)、PBS阴性对照组(PBS组)和空载体pSG.SS.YL(空载体组)。C3d3-Bin1b组经股四头肌注射接种pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b质粒，每只动物两侧肢体轮流注射，初免及加强(2周和4周)共3次，每次接种DNA量100pmol/100ul。PBS组注射等量无菌0.01MPBS，空载体组应用空载体(pSG.SS.YL)进行免疫，Bin1b组应用pSG.SS.YL-Bin1b进行免疫。

2、免疫避孕效应观察

各组小鼠于免疫后6周与健康同龄有生育力雌鼠合笼喂养，各实验组雄鼠与雌鼠以1:3的比例进行合笼喂养，观察雌鼠是否出现阴道栓，若发现有阴道栓则立即雌雄分笼喂养，统计各组孕鼠数量及每窝产仔数量。

3、标本采集

每组动物于首次免疫后2、4、8周断尾取血15ul，混入30ul阿氏保存液，4℃静置3h，离心(1000rpm×5min)，取上清-70℃保存，用于抗体检测。首次免疫后第8周处死雄鼠，酒精喷洒体表消毒，在其下腹部横向剪开一道小口，纵向撕开，暴露腹壁肌肉，组织镊捏起膀胱投影区上方腹壁肌肉，轻微抖动避免内脏粘连，提起后横向剪开至腹壁两侧，充分暴露其下脂肪囊；拉出脂肪囊，暴露睾丸和附睾，镊子夹住附睾体的尾部末端，剥离附睾尾周围的脂肪和血管，沿镊子夹取部位剪下双侧附睾尾，放入生理盐水中清洗表面残留脂肪及血污。将附睾尾置于培养皿液滴中央，切碎附睾采集精子，精子悬液立即进行显微观察与活力计数。

4、血清Bin1b抗体的检测

抗体滴度检测采用ELISA分析法，PBS阴性对照组血清以1:10稀释后所测OD值作为背景值，各组ELISA测得的OD值以高于阴性对照组背景值3倍为阳性，以稀释血清至非阳性范围内的终末稀释值为抗体滴度。

5、血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平的测定

按美国R&D公司ELISA试剂盒说明书操作。

6、统计分析

应用统计分析软件SPSS10.0进行统计分析，P<0.05相差显著，P<0.01相差非常显著。

7、相关结果

⑴免疫性避孕效应观察

与两对照组相比，Bin1b组和C3d3-Bin1b组雌鼠受孕率、平均产仔数量均显著降低，雄鼠精子活力显著下降，C3d3-Bin1b组变化趋势较Bin1b组显著。见表1。

表1各组小鼠雄鼠免疫避孕效应

与PBS组比较**P<0.01，与空载体组比较^▲▲P<0.01，与Bin1b组比较^△△P<0.01

⑵雄鼠血清抗Bin1b抗体生成情况测定

Bin1b组首次接种后2、4、8周均出现抗体阳性反应，最大稀释度分别为1:20、1:80和1:640，C3d3-Bin1b组接种后2、4、8周抗体最大稀释度分别为1:80、1:320和1:2560，显著高于同期Bin1b组。空载体组和PBS组未出现阳性反应。

⑶雄鼠血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平测定结果

Bin1b组和C3d3-Bin1b组IL-2和INF-γ浓度呈降低趋势，C3d3-Bin1b组显著低于Bin1b组，空载体组与PBS组无显著区别。Bin1b组和C3d3-Bin1b组IL-4和IL-10浓度呈升高趋势，C3d3-Bin1b组显著高于Bin1b组。结果见表2-5。

表2各组小鼠血清IL-2浓度检测结果(pg/ml，n＝6)

与PBS组比较**P<0.01，与空载体组比较^▲▲P<0.01，与Bin1b组比较^△△P<0.01

表3各组小鼠血清INF-γ浓度检测结果(pg/ml，n＝6)

与PBS组比较**P<0.01，与空载体组比较^▲▲P<0.01，与Bin1b组比较^△△P<0.01

表4各组小鼠血清IL-4浓度检测结果(pg/ml，n＝6)

与PBS组比较**P<0.01，与空载体组比较^▲▲P<0.01，与Bin1b组比较^△△P<0.01

表5各组小鼠血清IL-10浓度检测结果(pg/ml，n＝6)

与PBS组比较**P<0.01，与空载体组比较^▲▲P<0.01，与Bin1b组比较^△△P<0.01

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。