DNA Marker的制备方法及其质粒和质粒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种DNAMarker的制备方法，本发明涉及在上述DNAMarker的制备过程中所构建的质粒，本发明还涉及上述质粒的制备方法，属于基因工程领域。

背景技术

基因工程又称重组DNA技术，是指在体外在分子水平上对DNA进行切割、连接、修饰等一系列操作的过程，在生命科学、生物医学领域起到了非常巨大的作用。在对DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的分离、纯化、切割、修饰、连接、扩增、序列测定等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA的电泳。DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备、检测、浓度测定、目的DNA片段的纯化，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。DNA分子量标准物(DNAMarker)是分子生物学实验中必不可少的用于确定目的DNA片段大小的标准参照物。DNA片段与DNAMarker在同一块琼脂糖凝胶中进行电泳迁移，通过比较迁移率可以估算出目的DNA的大小。

尽管实现DNAMarker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNAMarker还是有相当的难度。目前各实验室中DNAMarker的使用大部分是从商业公司购买，而且由于DNAMarker是消耗品，每个实验室中的使用量非常大，具有广阔而良好的市场前景。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的DNAMarker产品。按照DNAMarker制备所涉及的关键技术,其制备方法可以分为限制性内切酶酶切和PCR扩增两种方法；其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA和人工构建的质粒载体。PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。

PCR扩增法是最常用的。虽然工作简单，但是重复成本高，长片段扩增效率低，并且还需要在回收后根据产物的亮度合理配比以达到最佳效果，可重复性差。酶切质粒的方法前期投入大，但是可以在前期设计的时候充分考虑各个分子量大小的浓度配比，使得酶切后的各分子量级别浓度达到最佳状态，并且产品各批次之间的基本没有差异。

酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性，温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法是用于以单位长度递增的DNAMarker(比如100bpDNALadder，条带为100bp，200bp，300bp等依次递增)的制备，其优点是制备方便，条带分布均匀，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNAMarker质量较好。

综上，在目前DNAMarker的生产过程中，主要采用的PCR扩增的方式，虽然该方法简单，但是一种劳动密集型的，难以保证批次之间重复性的生产，从而难以实现大规模生产，总体成本较高的方法。酶切法中的人工构建DNA分子的酶切是将来技术发展的主流。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有DNAMarker质粒的制备方法以及DNAMarker的制备方法，以能够通过大规模生产得到质量稳定均一的DNAMarker。

本发明采用了如下技术方案：

本发明提供一种含有DNAMarker的质粒，其特征在于，包括：预定长度的多条DNAMarker片段，各片段之间具有相同的酶切位点。

进一步，本发明的含有DNAMarker的质粒，还可以具有这样的特征：其中，DNAMarker片段长度分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，700bp。

进一步，本发明的含有DNAMarker的质粒，还可以具有这样的特征：其中，酶切位点为EcoRI酶切位点。

本发明还提供一种含有DNAMarker的质粒的构建方法，包括如下步骤：

A、取多条长度不同的DNAMarker片段，各长度的DNAMarker片段的拷贝数为一个或多个；

B、通过重叠PCR拼接各DNAMarker片段，拼接后的片段称为外源片段，外源片段中的DNAMarker之间具有相同的酶切位点，外源片段两端与骨架载体连接处的酶切位点与片段中间的酶切位点不同；

C、选择质粒作为骨架载体，且该骨架载体上不带有EcoRI酶切位点，随后将外源片段连接进入骨架载体，构建得到一个重组质粒。

进一步，本发明的DNAMarker的质粒的构建方法，还可以具有如下技术特征：

其中，DNAmarker片段中包括100bp的片段，100bp片段的合成方法如下：首先合成引物组：第一引物100-1：5’-CGGAATTCTTCTCATGCTGAAAACGTGG-3’和第二引物100-2：5’-GGATCCAGGCTCTGCGGGCCCGGCGT-3’，

第三引物100-3：5’-GGATCCGTTTCTGCGGGAAAGTGTTC-3’和第四引物100-4：5’-GGATCCGACATCCCGGCAAGCATGGC-3’,

第五引物100-5：5’-GGATCCATCCACGGAGTATGCCGAC-3’和第六引物100-6：5’-GGATCCGAGCACGGTGTACGTCAGCC-3’，

第七引物100-7：5’-GGATCCAGCCTGTTTTTCAGCGATC-3’和第八一引物100-8：5’-GGATCCTCTGCATCAGCACATCATC-3’，

第九引物100-9：5’-GGATCCAAGCGGCAGGGCTTGCCGG-3’和第十引物100-10：5’-GGATCCATTACGTCATCCTCCGTC-3’，

然后以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNA聚合酶进行扩增，获得5种100bp片段，回收备用。

进一步，本发明的DNAMarker的质粒的构建方法，还可以具有如下技术特征：其中，DNAmarker片段中具有200bp的片段，200bp片段的合成方法如下：首先合成三对引物：第十一引物200-1：5’-GGATCCGCTGATGACAGTATCAGAAG-3’)和第十二引物200-2：5’-GGATCCCAGCGCCTGTCGGCTCAGCG-3’，第十三引物200-3：5’-GGATCCGCTGCACAGAAAGCGGGG-3’和第十四引物200-4：5’-GGATCCAGGGTGATCGCACCGGCAAG-3’，第十五引物200-5：5’-GGATCCGCCGATGGTGGGGGCCAC-3’和第十六引物200-6：5’-GGATCCACTCGCTGGTCTGGTTAAAC-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNA聚合酶进行扩增，获得三种200bp片段，回收备用。

进一步，本发明的DNAMarker的质粒的构建方法，还可以具有如下技术特征：其中，DNAmarker片段中具有300bp的片段，300bp片段的合成方法如下：首先合成两对引物：第十七引物300-1：5’-GGATCCCACTCAGCGCACTGGTTAAG-3’和第十八引物300-2：5’-GGATCCGGCGGCGGGTCTGGTCATC-3’，第十九引物300-3：5’-GGATCCTGAAAGAGAACATGGGCAC-3’和第二十引物300-4：5’-GGATCCGCTGCTGCGCATTTTTG-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNApolymerase进行扩增，获得两种300bp片段，回收备用。

进一步，本发明的DNAMarker的质粒的构建方法，还可以具有如下技术特征：其中，DNAmarker片段中具有400bp的片段，400bp片段的合成方法如下：首先合成两对引物：第二十一引物400-1：5’-GGATCCAGAGCGATACCGAAGCGTC-3’和第二十二引物400-2：5’-GGATCCTGGCGACGTTGCGCCGCC-3’，第二十三引物400-3：5’-GGATCCGCTGTCTGCACAGGAGAAATC-3’和第二十四引物400-4：5’-GGATCCACTTTTTACCTGCGACATAC-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNApolymerase进行扩增，获得400bp片段，回收备用。

进一步，本发明的DNAMarker的质粒的构建方法，还可以具有如下技术特征：其中，DNAmarker片段中还具有500bp的片段和700bp的片段，500bp片段的合成方法如下：首先合成引物：第二十五引物500-1：5’-GGATCCGCAGCCACGCAGACCTTTG-3’和第二十六引物500-2：5’-GGATCCGGACCTATCTGCCCGTTCG-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNApolymerase进行扩增，获得500bp片段，回收备用；700bp的片段合成方法如下：首先合成引物：第二十七引物700-1：5’-GGATCCGGCTGCTCTGAAGGCGGTG-3’，第二十八引物700-2：5’-GAATTCTCCCGGTGACCATACCG-3’，然后以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNApolymerase进行扩增，获得700bp片段，回收备用。

本发明再提供一种DNAMarker的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A.利用上述方法，构建用于制备DNAMarker的质粒；

B.将该质粒转入宿主菌中进行扩增；

C.提取质粒，采用限制性内切酶将质粒切分为外源片段和骨架载体；

D.使用琼脂糖凝胶层析柱收集外源片段；

E.得到的外源片段采用与外源片段内部的酶切位点对应的限制性内切酶进行酶切，从而得到DNAMarker各条带。

发明的有益效果

本发明通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，一次性得到DNAMarker中各条带，且各条带之间的亮度基本一致，从而实现DNAMarker在凝胶上的均一性。

附图说明

图1是pMDT3700酶切后DNAMarker组成片段大小与拷贝数的关系示意图；

图2是用于制备DNAMarker的质粒DNA及其中的片段大小与拷贝数关系示意图；

图3是实施例中所述DNAMarker琼脂糖凝胶电泳效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。

参考DL2000设计出所需要的DNAMarker的片段。在原有的受体质粒上连接上含有组成目标DNAMarker的各大小不同的DNAMarker片段，先在体外将设计好的各DNAMarker片段连接成为一条单独的长链DNA片段，再将其与载体相连，随后进行转化，得到所需要的重组质粒。受体质粒本身是一个大小为2600bp的质粒，采用受体质粒上不存在的酶切位点进行构建，最终使用EcoRI、BamHI进行酶切。

本实施例将讲述用于制备DNAMarker的质粒的构建，以及利用该质粒制备DNAMarker的方法。该质粒包含了Marker中所含有的6个条带和一条2600bp的条带，利用琼脂糖凝胶层析柱将2600bp的条带去除后，3700bp酶切后可得到700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，各片段数量如图1所示。

如未特别注明，本实施例中所用的生化试剂以及PCR或核酸提取与纯化试剂盒等均来自上海同科生物科技有限公司；所有引物合成均由苏州金唯智生物科技有限公司合成；所有限制性内切酶均来自宝生物工程(大连)有限公司。

如未特别注明，本实施例中所用的各DNA片段PCR反应体系为：

反应程序为：1、94℃5min预变性

2、94℃30s变性

3、55℃30s退火

4、72℃30s延伸

其中，在延伸步骤中，100bp、200bp和500bp延伸时间为30s，700bp延伸时间为40s。

5、重复步骤2到步骤4，共30个循环

6、72℃，10min

7、4℃保存

如未特别注明，本实施例中重叠PCR反应体系为：

反应程序为：1、94℃，5min预变性

2、94℃，30s变性

3、48℃，30s退火

4、72℃，30s延伸

其中，在步骤4中，200bp-500bp延伸时间为30s，500bp-1000bp延伸时间为1min，1000bp-2000bp延伸时间为2min，2000bp-3000bp延伸时间为3min，3000bp-3700bp延伸时间为3.5min。

5、重复步骤2到步骤4，进行5个循环

6、94℃，30s变性

7、55℃，30s退火

8、72℃，30s延伸

9、重复步骤6到步骤8，进行26个循环

10、72℃，10min

11、4℃保存

如未特别注明，本实施例中所用PCR产物均用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭核酸染料染色后于紫外线下观察。用PCR产物回收试剂盒或琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，DNA定量均用Thermo公司的紫外分光光度计测定。

如未特别注明，本实施例中所用的DNA连接反应体系为：

如未特别注明，本实施例中所用的转化菌株为大肠杆菌DH5α。

1.1载体分子的设计

根据本发明的方法，本实施例中选择克隆载体pMD19-Tsimple为受体载体，载体上没有其他酶切位点，带有氨苄青霉素抗性基因；选用EcoRI、BamHI作为完全酶切法制备DNAMarker的酶；整个外源片段连接后长为3700bp，可直接连接T载体。可分批构建100×5，200×3，300×2，400×2，500+700五个片段，然后再两两重叠PCR连接，最后形成一个3700bp的片段。每个单拷贝的片段之间设计BamHI位点。

该MarkerDNA各片段的完整序列如SEQIDNO.1所示。

1.2各目标DNA前体片段的获得

1.2.1100×5前体片段

合成引物第一引物100-1：5’-CGGAATTCTTCTCATGCTGAAAACGTGG-3’，和第二引物100-2：5’-GGATCCAGGCTCTGCGGGCCCGGCGT-3’，第三引物100-3：5’-GGATCCGTTTCTGCGGGAAAGTGTTC-3’，和第四引物100-4：5’-GGATCCGACATCCCGGCAAGCATGGC-3’,第五引物100-5：5’-GGATCCATCCACGGAGTATGCCGAC-3’，和第六引物100-6：5’-GGATCCGAGCACGGTGTACGTCAGCC-3’，第七引物100-7：5’-GGATCCAGCCTGTTTTTCAGCGATC-3’，和第八引物100-8：5’-GGATCCTCTGCATCAGCACATCATC-3’，第九引物100-9：5’-GGATCCAAGCGGCAGGGCTTGCCGG-3’，和第十引物100-10：5’-GGATCCATTACGTCATCCTCCGTC-3’，分别以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNA聚合酶进行扩增，获得5种100bp片段，回收备用。再通过100-11：5’-CGCAGAGCCTGGATCCGTTTCTGCGG-3’，和100-12：5’-CCGCAGAAACGGATCCAGGCTCTGCG-3’搭配100-1和100-4以前两个100bp为模板，把它们连接起来形成片段a。再通过100-13：5’-CACCGTGCTCGGATCCAGCCTGTTTTTC-3’，和100-14：5’-GAAAAACAGGCTGGATCCGAGCACGGTG-3’，搭配100-5和100-8以第3第4个100bp片段为模板，把它们连接起来形成片段b。再通过100-15：5’-CCGCTGGATTGGATCCTCAGTCTGCT-3’和100-16：5’-AGCAGACTGAGGATCCAATCCAGCGG-3’，搭配100-5和100-10以片段b和第5个100片段为模板，把它们连接起来形成片段c。再通过100-17：5’-CCGGGATGTCGGATCCATCCACGGAG-3’，和100-18：5’-CTCCGTGGATGGATCCGACATCCCGG-3’，搭配100-1和100-10以片段a和片段c为模板，把它们连接起来形成片段100×5。该片段序列如SEQIDNO.2所示。

1.2.2200×3前体片段

合成引物：第十一引物200-1：5’-GGATCCGCTGATGACAGTATCAGAAG-3’，和第十二引物200-2：5’-GGATCCCAGCGCCTGTCGGCTCAGCG-3’，第十三引物200-3：5’-GGATCCGCTGCACAGAAAGCGGGG-3’，和第十四引物200-4：5’-GGATCCAGGGTGATCGCACCGGCAAG-3’，第十五引物200-5：5’-GGATCCGCCGATGGTGGGGGCCAC-3’，和第十六引物200-6：5’-GGATCCACTCGCTGGTCTGGTTAAAC-3’，分别以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNA聚合酶进行扩增，获得200bp片段，回收备用。再通过200-7：5’-ACAGGCGCTGGGATCCGCTGCACAG-3’，和200-8：5’-CTGTGCAGCGGATCCCAGCGCCTGT-3’，搭配200-1和200-4，以前两个200bp为模板把它们连接起来，最终形成片段d。再通过200-9：5’-CGATCACCCTGGATCCGCCGATGGTG-3’，和200-10：5’-CACCATCGGCGGATCCAGGGTGATCG-3’，搭配200-1和200-6以片段d和最后一个200bp为模板，把它们连接起来最终形成片段200×3。该片段序列如SEQIDNO.3所示。

1.2.3300×2前体片段

合成引物：第十七引物300-1：5’-GGATCCCACTCAGCGCACTGGTTAAG-3’，和第十八引物300-2：5’-GGATCCGGCGGCGGGTCTGGTCATC-3’，第十九引物300-3：5’-GGATCCTGAAAGAGAACATGGGCAC-3’，和第二十引物300-4：5’-GGATCCGCTGCTGCGCATTTTTG-3’，以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNA聚合酶进行扩增，获得300bp片段，回收备用。再通过300-5：5’-ACCCGCCGCCGGATCCTGAAAGAGAA-3’，和300-6：5’-TTCTCTTTCAGGATCCGGCGGCGGGT-3’，搭配300-1和300-4，以两个300bp为模板，把它们连接起来最终形成片段300×2。该片段序列如SEQIDNO.4所示。

1.2.4400×2前体片段

合成引物：第二十一引物400-1：5’-GGATCCAGAGCGATACCGAAGCGTC-3’，和第二十二引物400-2：5’-GGATCCTGGCGACGTTGCGCCGCC-3’，第二十三引物400-3：5’-GGATCCGCTGTCTGCACAGGAGAAATC-3’，和第二十四引物400-4：5’-GGATCCACTTTTTACCTGCGACATAC-3’，以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNA聚合酶进行扩增，获得400bp片段，回收备用。再通过400-5：5’-AACGTCGCCAGGATCCGCTGTCTGC-3’，和400-6：5’-GCAGACAGCGGATCCTGGCGACGTT-3’，搭配400-1和400-4，以两个400bp为模板，把它们连接起来最终形成片段400×2。该片段序列如SEQIDNO.5所示。

1.2.5500+700前体片段

合成引物：第二十五引物：500-1：5’-GGATCCGCAGCCACGCAGACCTTTG-3’，和第二十六引物500-2：5’-GGATCCGGACCTATCTGCCCGTTCG-3’，以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNA聚合酶进行扩增，获得500bp片段，回收备用。合成引物：第二十七引物700-1：5’-GGATCCGGCTGCTCTGAAGGCGGTG-3’，第二十八引物700-2，5’-GAATTCTCCCGGTGACCATACCG-3’，以λ噬菌体DNA为模板，用PfuDNA聚合酶进行扩增，获得700bp片段，回收备用。再通过500-3，5’-GATAGGTCCGGATCCGGCTGCTCTG-3’，和700-3：5’-CAGAGCAGCCGGATCCGGACCTATC-3’，搭配500-1和700-2，以500bp和700bp为模板，把它们连接起来最终形成片段500+700。该片段序列如SEQIDNO.6所示。

1.3前体片段的拼接

把100×5，200×3，300×2，400×2，500+700五个片段连接起来组成3700片段。

通过100-19：5’-GACGTAATGGATCCGCTGATGAC-3’，和200-11：5’-GTCATCAGCGGATCCATTACGTC-3’，搭配100-1和200-6，以100×5和200×3为模板，把它们连接起来最终形成1100片段。

通过200-12：5’-CCAGCGAGTGGATCCCACTCAGCG-3’，和300-7：5’-CGCTGAGTGGGATCCACTCGCTGG-3’，搭配100-1和300-4，以1100片段和300×2为模板，把它们连接起来最终形成1700片段。

通过400-7：5’-GTAAAAAGTGGATCCGGATCCGC-3’，和500-4：5’-GCGGATCCGGATCCACTTTTTAC-3’，搭配400-1和700-2，以400×2片段和500+700为模板，把它们连接起来最终形成2000片段。

通过300-7，5’-CAGCAGCGGATCCAGAGCG-3’，和400-7：5’-CGCTCTGGATCCGCTGCTG-3’，搭配100-1和700-2，以1700片段和2000片段为模板，用TaqDNA聚合酶进行扩增，把它们连接起来最终形成3700片段。

1.4终载体的组装

将1.3中得到的3700bp片段与pMD19-Tsimple载体进行连接，转化后挑取阳性克隆，提取质粒得到重组质粒，终质粒命名为pMDT3700，结构如图2所示。

1.5DNAMarker的制备

将pMDT3700质粒以常规方法转化大肠杆菌，将带有pMDT3700质粒的大肠杆菌菌株进行大量繁殖，用裂解法结合柱式DNA纯化法抽提质粒。首先用EcoRI对pMDT3700质粒进行单酶切，反应体系如下：

反应结束后，使用核酸蛋白检测仪及琼脂糖凝胶(sepharoseCL-2B)层析柱，将2600bp的载体除去，收集3700bp片段。

用BamHI对3700bp片段进行单酶切，反应体系如下：

反应结束后，按照1:9的比例加入10×DNALoadingBuffer(上样缓冲液)，终止三种酶切反应，使它们混合后不会产生相互作用。所制备的Marker即可用于琼脂糖凝胶电泳。如图3所示，条带由上到下的分子量由小到大排列。可以看到该DNAMarker条带分布均匀，亮度均一，符合本发明的设计要求。