一种曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物、其制备方法以及在HER2阳性乳腺癌诊治中的应用

技术领域

本发明涉及一种曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物，还涉及该纳米棒复合物的制 备方法及其在HER-2阳性乳腺癌诊治中应用，本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

随着新药和新方法的临床开发和应用，早期乳腺癌的治疗效果有了很大的提 高，但是三期和四期乳腺癌的5年生存率仍然只有57％和20％，其中表皮生长因 子2受体(HER2)阳性表达的乳腺癌患者复发转移风险很高，预后尤其差。2006 年瑞士罗氏公司研发出了针对乳腺癌细胞HER2靶点的第一个分子靶向药物——曲 妥珠单抗，它可与HER2结合，阻断HER2相关的肿瘤生长信号通路，抑制HER2 过度表达的肿瘤细胞的增殖。目前曲妥珠单抗已被FDA批准用于各期HER2阳性 乳腺癌的治疗，但一些患者在开始曲妥珠单抗治疗时出现原发性耐药，还有许多患 者在接受曲妥珠单抗治疗后一年内相继出现耐药。如何克服这个治疗瓶颈是乳腺癌 治疗面临的一大难题。

曲妥珠单抗耐药与许多机制相关，包括糖蛋白MUC4过表达、胰岛素样生长因 子过表达和固有的P13K/Akt活性等，至于HER2受体胞外区突变的情况非常少见， 在大多数情况下HER2受体本身并无变化，同时控制这些与耐药相关的多个因素非 常困难，于是我们想到了以曲妥珠单抗为载体精确靶向到病灶部位进行热疗，通过 光热治疗杀死残余耐药肿瘤细胞。

在众多可应用于生物医学方面的纳米材料中，金纳米家族具有良好的生物相容 性和易被修饰特性，因此在肿瘤的诊断与治疗中有较好的应用前景，并取得了一些 具有实际应用价值的研究成果。例如，EGFR抗体修饰的金纳米粒子用于肿瘤的早 期诊断，可以明显的区分肿瘤细胞与正常细胞。YangJ等人将EGFR特异性抗体－ 西妥昔单抗Cetuximab连接在金纳米粒子上，利用金纳米粒子的光学特性通过光学 图像得以使肝癌细胞区别于正常细胞。MukherjeeP等人研究发现，金纳米粒子可 以特异性地结合VEGF-165和bFGF，发挥抑制肿瘤血管生成的作用；AgastiSS等 人通过O-硝基苄基(O-nitrobenzyl，ONB)将5-FU连接于金纳米粒子的表面，研制 了一种“光反应”性的金纳米粒子-抗肿瘤药物控释系统。

在这些国内外前期研究的基础上，本发明结合曲妥珠单抗的特异靶向性和金纳 米粒子在肿瘤治疗中的应用特征，将通过化学合成制备由曲妥珠单抗键连的金纳米 粒子。但肿瘤热疗是一个复杂的过程，由于不同波长的光对组织的穿透能力不同， 对组织穿透能力增强的光其热效率就降低，而穿透力不足就无法到达准确病灶部 位。由于常用的金纳米壳的径向调节范围单一(仅有球半径可调)，无法满足治疗 不同大小肿瘤和体内不同深度肿瘤的需求，我们将金纳米棒键连曲妥珠单抗，同时 在结合曲妥珠单抗前通过半胱氨酸-卟啉键连金纳米棒，利用卟啉近红外荧光显像识 别肿瘤病灶部位，到达影像定位和靶向性热疗的效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够用于HER2阳性乳腺癌诊治的曲妥 珠单抗键联金纳米棒复合物以及制备方法和用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

(1)制备出长径比不同的金纳米棒，纵向吸收峰为650-850nm，可满足穿透 人体组织的最佳光波长，并在少量的CTAB包裹下稳定存在；

(2)制备出键联不同数量的半胱氨酸的卟啉类荧光分子，从而可能有效控制 金纳米棒上键联曲妥珠单抗的量；

(3)通过戊二醛化学交联的方法，将金纳米棒-半胱氨酸-卟啉复合物和药物曲 妥珠单抗键连，得到的金纳米棒-半胱氨酸-卟啉-曲妥珠单抗复合物，能很好地分散 在DMF溶液中。

本发明的一种曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物，其是通过Au-S键的作用，将 金纳米棒和半胱氨酸-卟啉类荧光分子复合物键连，然后通过戊二醛化学交联的方 法，将金纳米棒-半胱氨酸-卟啉类荧光分子复合物和药物曲妥珠单抗键连得到，其 由以下依次相连的各部分组成：金纳米棒、半胱氨酸、卟啉类荧光分子以及曲妥珠 单抗。

其中，优选的，所述的卟啉类荧光分子为对氯乙氧基苯基卟啉。

一种制备以上所述的曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物的方法，包括以下步骤：

1)金纳米棒的制备

a.金种子液的制备：向烧杯中加入7.5ml0.1M的CTAB溶液，在轻微搅拌的 条件下加入250μl0.01M的氯金酸溶液，然后加入新鲜配制的0℃的0.01M的硼氢 化钠溶液60μl，在22-28℃的温度下轻微搅拌1-5min，待用；

b.生长液的制备：向另一个烧杯里依次加入以下溶液：0.1M的CTAB溶液 10ml，0.01M的氯金酸溶液425μl，0.01M的硝酸银溶液60μl-100μl，0.1M的抗坏 血酸溶液67μl，混合均匀后得到生长液；

c.金纳米棒的制备：将金种子液105μl加入到生长液中，整个过程均在轻微搅 拌以及温度为22-28℃的条件下进行，加完药品后持续搅拌，待溶液变色后，将烧 杯移入温度为27-28摄氏度的恒温水浴中，静止过夜处理；反应完后得到金纳米棒 溶液，将金纳米棒溶液移入离心管中，离心前将溶液进行加热处理，待溶液中的 CTAB全部溶解后，将药品配平后放入离心机，离心，离心完后用吸管将上清液吸 出，沉淀用去离子水重新溶解，重复以上离心过程2次，将收集的金纳米棒重悬于 适量体积的去离子水中，将收集的金纳米棒溶液放在4℃的冰箱里保存，用于之后 的表征和再反应；

2)卟啉金纳米棒键连

d.卟啉-半胱氨酸溶液的制备：烧瓶中加入25ml的DMF溶液，50mg的对氯乙 氧基苯基卟啉，0.75g-1.25g半胱氨酸，搅拌混合均匀后，加入2～3滴三乙胺，加热 反应24h，加入饱和食盐水和二氯甲烷进行产物分离，将溶解有目标物质的二氯甲 烷相通过柱层析进行提纯，得到卟啉-半胱氨酸溶液；

e.金纳米棒-半胱氨酸-卟啉的制备：在烧杯中依次加入甲醇，上述步骤c得到 的金纳米棒溶液和步骤d得到的卟啉-半胱氨酸溶液，常温搅拌18-24h，反应结束后 离心，倒掉上面溶液，加入甲醇再次离心，倒掉上面溶液，然后加入DMF分散沉 淀，超声处理使沉淀更好地分散在溶液中，得到金纳米棒-半胱氨酸-卟啉复合物；

3)曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物的制备

先将金纳米棒-半胱氨酸-卟啉复合物分散在0.005M的CTAB溶液中，使得金纳 米棒-半胱氨酸-卟啉复合物的浓度为100nM，然后用戊二醛交联法，将10ml的金纳 米棒-半胱氨酸-卟啉复合物溶液分散在浓度为0.01M的PBS溶液中，常温放置 0.5-2h，离心处理，沉淀重新分散在配制好的0.01M的PBS溶液中，然后加入过量 的曲妥珠单抗，4℃下孵育12h，离心除去多余的曲妥珠单抗，得到金纳米棒-半胱 氨酸-卟啉-曲妥珠单抗复合物，将得到的复合物分散在0.01M的PBS溶液中，温度 4℃保存，即得。

其中，优选的，所述的0.01M的PBS溶液为含有1.38MNaCl，0.0027MKCl, 0.05％(v/v)吐温-20以及5％(v/v)戊二醛的0.01M的PBS溶液，pH7.4。

进一步的，本发明还提出了所述的曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物在制备 HER2阳性乳腺癌诊治试剂中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种可显像的肿瘤靶向性治疗金纳米 棒，这种金纳米棒具有更加优越的性能，主要表现它在横向和纵向上具有光学异性 特征(横径和纵径均可调)，在径向长度上，其波长范围可以调节到1400nm以上， 从而对组织具有更好的穿透能力；在横向上，我们可以将其共振波长调节到 600-800nm之间，这个波长范围非常适合肿瘤的光热治疗。因此我们结合曲妥珠单 抗对HER2阳性乳腺癌的特异靶向性和金纳米棒在肿瘤治疗中的应用优势及卟啉光 动力学诊断的灵敏度，通过化学合成制备由曲妥珠单抗和卟啉修饰的金纳米棒，利 用曲妥珠单抗对HER2阳性乳腺癌的特异靶向性，将卟啉和金纳米棒定点靶向到病 灶部位，通过适当波长的光照射，利用卟啉的光动力反应对肿瘤进行定位诊断，可 以检测到普通方法很难检测到的原位癌或微转移病灶，同时利用金纳米棒特有的光 热特征，对检测到的乳腺癌病灶进行靶向性光热治疗。这种靶向性热疗通过物理方 法破坏耐药的肿瘤细胞，可有效解决分子靶向药物耐药的难题。

附图说明

图1为合成的金纳米棒卟啉复合物在透射电镜下的图像；

图2为不同比例卟啉-半胱氨酸的金纳米棒复合物与HER2高表达肿瘤细胞结合 的荧光显像；

图3为金纳米棒复合物对BT474细胞的光热治疗效果；

图4为金纳米棒复合物靶向肿瘤病灶成像。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限 制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明 技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范 围内。

实施例1曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物的制备

本发明的实施方案和步骤：

1)金纳米棒的制备

a.金种子液的制备：向50ml的烧杯中加入7.5ml0.1M的CTAB溶液，在轻微 搅拌的条件下加入250μl0.01M的氯金酸溶液，然后加入新鲜配制的0℃的0.01M 的硼氢化钠溶液60μl，在25℃左右的温度下轻微搅拌2min，待用。

b.生长液的制备：取50ml的烧杯若干个，向烧杯里依次加入以下溶液：0.1M的 CTAB溶液10ml，0.01M的氯金酸溶液425μl，0.01M的硝酸银溶液60μl，80μl或 100μl(不同量的硝酸银可生成不同长径比的金纳米棒)，0.1M的抗坏血酸溶液67μl， 得到生长液；

c.金纳米棒的制备：将金种子液105μl加入到生长液中，整个过程均在轻微搅 拌以及温度为25℃的条件下进行，加完药品后持续搅拌，待溶液变色后，将烧杯移 入温度为27-28摄氏度的恒温水浴中，静止过夜处理。反应完后得到金纳米棒溶液， 将金纳米棒溶液移入离心管中，离心前将溶液加热处理，待溶液中的CTAB全部溶 解后，将药品配平后放入离心机，离心条件为：25摄氏度，10000r/min，20min，离 心完后用吸管将上清液吸出，沉淀用去离子水重新溶解，重复以上离心过程2次， 将收集的金纳米棒重悬于适量体积的去离子水中，将收集的金纳米棒溶液放在4℃ 的冰箱里保存，用于之后的表征和再反应。

2)卟啉金纳米棒键连

d.卟啉-半胱氨酸溶液的制备：250ml的烧瓶中加入25ml的DMF溶液，50mg 的对氯乙氧基苯基卟啉，0.75g半胱氨酸，搅拌混合均匀后，加入2～3滴三乙胺， 加热反应24h，加入适量的饱和食盐水和二氯甲烷进行分离产物，将溶解有目标产 物的二氯甲烷相通过柱层析进行提纯，应用200目硅胶柱，二氯甲烷与甲醇按体积 比100:2.5混合的溶液作为洗脱液，收集色谱带。增加半胱氨酸量至1g和1.25g， 重复上述过程，得到键联不同数量半胱氨酸的卟啉-半胱氨酸溶液。

e.金纳米棒-半胱氨酸-卟啉的制备：在50ml的烧杯中加入15ml的甲醇，1ml 的上述步骤c得到的金纳米棒溶液和步骤d得到的1ml的键联不同数量半胱氨酸的 卟啉-半胱氨酸溶液，常温搅拌18-24h，反应结束后离心，倒掉上面溶液，加入甲醇 再次离心，倒掉上面溶液，然后加入DMF分散沉淀，超声处理使沉淀更好地分散 在溶液中，得到金纳米棒-半胱氨酸-卟啉复合物。

3)曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物的制备

分别将键联不同数量半胱氨酸的金纳米棒-半胱氨酸-卟啉分散在0.005M的 CTAB溶液中，使得金纳米棒-半胱氨酸-卟啉的浓度为100nM，然后用戊二醛交联 法，将10ml的金纳米棒-半胱氨酸-卟啉溶液分散在浓度为0.01M的PBS(NaCl1.38M, KCl,0.0027M,吐温-200.05％(v/v)，pH7.4，5％(v/v)戊二醛)溶液中，常温 放置1h(设置不同时间，找到最优)，离心处理，沉淀重新分散在配制好的0.01M 的PBS溶液中，加入0.25ml-0.75ml过量的曲妥珠单抗，4℃下孵育12h，离心除去 多余的曲妥珠单抗，将得到的金纳米棒-半胱氨酸-卟啉-曲妥珠单抗分散在 PBS(PH7.4)缓冲液中，温度4℃保存，即得。

图1为硝酸银溶液的加入量为80μl，半胱氨酸的加入量为0.75g时合成的金纳 米棒卟啉复合物在透射电镜下的图像。

实施例2曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物在HER2阳性乳腺癌诊治中的应用

1、应用六孔板培养HER2高表达BT474乳腺癌细胞系，每孔分别加入100ug/ml 实施例1制备得到的键联不同数量半胱氨酸的曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物(硝 酸银溶液的加入量为80μl)，37℃5％CO₂孵育24小时，通过荧光显微镜观察金纳 米棒复合物与乳腺癌细胞表面受体结合情况和荧光显像，结果如图2所示，可见随 着半胱氨酸比例增加(从左到右分别为0.75g、1g和1.25g)，卟啉红色荧光更强(箭 头所示)，细胞结合曲妥珠单抗也更多，药物靶向性更好。

2、应用96孔板培养BT474乳腺癌细胞，分别加入PBS液(对照组)、25ug/ml 曲妥珠单抗(曲妥珠单抗组)、100ug/ml金纳米棒(金纳米棒组)、100ug/ml曲妥珠- 卟啉-半胱氨酸(1.25g)-金纳米棒(荧光靶向金纳米棒组)，每孔重复三次，给予 808nm近红外激光照射5分钟，应用Live/Deadviability/cytotoxicity试剂盒染色，评 价金纳米棒复合物的细胞毒性和金纳米棒介导的光热治疗效果，结果图如图3所示， 箭头所指部位为红色荧光部位，可见荧光靶向金纳米棒复合组具有较强的杀伤肿瘤 细胞作用，较曲妥珠单抗组和金纳米棒组效果更显著，提示这种曲妥珠单抗键联金 纳米棒复合物对HER2高表达肿瘤细胞具有较好的治疗效果。

3、将BT474乳腺癌细胞接种于SCID小鼠乳腺脂肪垫，建立乳腺癌裸鼠模型， 尾静脉注射曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物后，进行观察，结果如图4所示，可见 曲妥珠单抗键联金纳米棒复合物可特异性结合肿瘤病灶，通过显像可标明肿瘤病灶 部位和浸润程度，以实现对肿瘤病灶进行定位和靶向治疗。