一种基于罗丹明B类识别Fe3+、Al3+和Cr3+离子多功能荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光分子探针领域，特别涉及一种基于罗丹明B类识别Fe³⁺、Al³⁺和Cr³⁺离子多功能荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

三价金属离子尤其是Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺在生命活动中发挥着非常重要的作用。Fe³⁺是构成蛋白、细胞色素和多种酶的基本元素，参与细胞的新陈代谢。人体内Fe³⁺失衡会引起新陈代谢紊乱导致贫血、肝损伤、肾衰竭等疾病。Cr³⁺的缺少会引发糖尿病和动脉硬化等多种疾病，但是当Cr³⁺含量过高时会破坏细胞结构和组成，对人体造成伤害。Al³⁺不属于人体所必需的微量元素。平时过多摄入Al³⁺会引发老年痴呆，对人体的中枢神经系统、造血系统、免疫系统、肝、肾造成不良影响。因此，开发快速、廉价、方便的监测以上三种金属离子的方法势在必行。

荧光分子探针因具有选择性好、灵敏度高、简单快速并且不需要借助昂贵仪器的优点而被广泛应用与各种金属离子的检测。罗丹明类染料由于其摩尔吸光系数较大，荧光量子产率高、结构易于修饰、吸收波长范围广等优势，已经被广泛应用于分子探针设计。目前，罗丹明类荧光探针多用于检测一种金属离子如Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺，作用和功能单一；同时Fe³⁺和Cr³⁺具有顺磁性特点，使得很多荧光探针与Fe³⁺和Cr³⁺作用后，通常表现为荧光淬灭，严重影响了检测的灵敏度。Al³⁺具有逆磁性，与荧光探针结合后通常表现为荧光增强。而检测Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺需要采用不同的荧光探针，增加了检测成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有良好灵敏度、强抗干扰能力、可同时识别三价金属离子Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺的基于罗丹明B类识别Fe³⁺、Al³⁺和Cr³⁺离子多功能荧光探针及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是：

一种基于罗丹明B类识别Fe³⁺、Al³⁺和Cr³⁺离子多功能荧光探针，其具体结构式如下：

其中R为或

该多功能荧光探针具体结构式如下：

该多功能荧光探针具体结构式如下：

一种基于罗丹明B类识别Fe³⁺、Al³⁺和Cr³⁺离子多功能荧光探针的制备方法，其反应式如下：

具体步骤是：

取化合物2吗啡啉、KI和二异丙基乙胺按照摩尔比28:0.35:0.18:2.9溶于乙腈中，在氮气保护下，搅拌回流反应10h；反应完成后，冷却至室温，减压蒸馏掉溶剂，采用硅胶柱层析分离，得到荧光探针L1。

回流反应温度为70℃。

一种基于罗丹明B类识别Fe³⁺、Al³⁺和Cr³⁺离子多功能荧光探针的制备方法，其反应式如下：

具体步骤是：

将化合物3化合物6五水硫酸铜和抗坏血酸钠按照摩尔比1:1.5：(0.1～2)：(0.1～2)，溶解在二氯甲烷和水的溶剂中，其中，二氯甲烷和水的体积比为1:1，在室温条件下反应12h，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋干溶剂，硅胶柱层析得到荧光探针L2。

一种基于罗丹明B类识别Fe³⁺、Al³⁺和Cr³⁺离子多功能荧光探针的应用，所述罗丹明类功能荧光探针能够选择性识别三价金属离子Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺。

一种基于罗丹明B类识别Fe³⁺、Al³⁺和Cr³⁺离子多功能荧光探针的应用，所述罗丹明B类多功能荧光探针识别Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺的溶剂是体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲盐溶液(PBS)，其中，磷酸缓冲盐溶液的pH为7.4。

本发明的有益效果：

1)该荧光探针L1具有罗丹明类荧光团，螺内酰胺与Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺作用后开环，由无荧光变为强荧光，实现了对Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺的荧光增强识别，检测灵敏度高。

2)该荧光探针L2通过三唑环将罗丹明类荧光团和苯并噻唑荧光团连接起来，三唑环中的N及苯并噻唑中的N、S元素为金属离子提供了结合位点，螺内酰胺与Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺作用后开环，由无荧光变为强荧光，实现了对Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺的荧光增强识别，检测灵敏度高。

3)该荧光探针L1和荧光探针L2对三价金属离子Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺的识别都有优良的选择性，与其它常见金属离子如Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni⁺、Cr³⁺、Ag⁺、Na⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺作用荧光信号基本没有变化，抗干扰能力强，可以用于二价金属离子和三价金属离子的识别。

4)该荧光探针L1和荧光探针L2可以同时检测三种金属离子的存在，既可以节约检测费用，又节省了检测时间。

附图说明

图1是本发明荧光探针L1的¹HNMR谱图；

图2是本发明荧光探针L1的¹³CNMR谱图；

图3是本发明荧光探针L1的质谱谱图；

图4是本发明荧光探针L1在甲醇溶液中加入不同金属离子的荧光光谱；

图5是本发明荧光探针L1在甲醇溶液中Cr³⁺的荧光滴定光谱；

图6是本发明荧光探针L1在甲醇溶液中Al³⁺的荧光滴定光谱；

图7是本发明荧光探针L1在甲醇溶液中Fe³⁺的荧光滴定光谱；

图8是本发明荧光探针L1在Al³⁺及其它金属离子存在下的荧光发射强度变化图；

图9是本发明荧光探针L1在Cr³⁺及其它金属离子存在下的荧光发射强度变化图；

图10是本发明荧光探针L1在Fe³⁺及其它金属离子存在下的荧光发射强度变化图；

图11是本发明荧光探针L2的¹HNMR谱图；

图12是本发明荧光探针L2的¹³CNMR谱图；

图13是本发明荧光探针L2的质谱谱图；

图14是本发明荧光探针L2在甲醇溶液中加入不同金属离子的荧光光谱；

图15是本发明荧光探针L2在甲醇溶液中Cr³⁺的荧光滴定光谱；

图16是本发明荧光探针L2在甲醇溶液中Al³⁺的荧光滴定光谱；

图17是本发明荧光探针L2在甲醇溶液中Fe³⁺的荧光滴定光谱；

图18是本发明荧光探针L2在Al³⁺及其它金属离子存在下的荧光发射强度变化图；

图19是本发明荧光探针L2在Cr³⁺及其它金属离子存在下的荧光发射强度变化图；

图20是本发明荧光探针L2在Fe³⁺及其它金属离子存在下的荧光发射强度变化图。

具体实施方式

本发明可以通过以下的实施例进一步说明，但不仅仅局限于实施例。

实施例1

合成化合物2其反应式如下：

(1)化合物1的合成

将(3.0g,6.8mmol)罗丹明B置于圆底烧瓶中，加入100mL无水乙醇使其充分溶解，再加入7.5mL水合肼，回流搅拌4h，反应结束后，减压蒸馏除去溶剂乙醇，剩余固体用过量1mol/LHCl进行酸化，0.5mol/LNaOH调节pH值为7，此时析出大量沉淀，抽滤，用去离子水洗涤滤饼，真空干燥得土黄色固体化合物1

(2)化合物2的合成

将化合物1(0.5g,1mmol)放入100mL烧瓶中，加入30mL二氯甲烷使其完全溶解。再将0.1mL氯乙酰氯溶解在少量的二氯甲烷(5mL)中。冰浴下，将氯乙酰氯的混合溶液滴加到化合物1溶液中，搅拌2h。反应完成后，将所得物升至室温，减压蒸馏除掉溶剂。将0.1mol/LHCl(40mL)加入剩余固体中，充分振荡至其溶解，0.1mol/LNaOH调节pH值到7，将沉淀过滤收集，干燥，采用柱层析分离得到化合物2

实施例2

合成荧光探针L1，其反应式如下：

具体步骤是：

取化合物2(0.15g，28mmol)溶于20mL乙腈中，加入吗啡啉(0.031g，0.35mmol)、KI(0.03g，0.18mmol)和二异丙基乙胺(0.5mL，2.9mmol)，在氮气保护下，70℃搅拌回流反应10h；反应完成后，冷却至室温，减压蒸馏掉溶剂，采用柱层析分离，得到白色固体荧光探针L1，收率为85％。

该罗丹明类多功能荧光探针的基本数据：

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.25(s,1H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),7.51-7.49(m,2H),7.33(t,J＝7.5Hz,1H),7.15(d,J＝6.7Hz,1H),6.65(d,J＝8.8Hz,2H),6.32(m,4H),3.48(br,4H),4.53(s,2H),3.38-3.28(m,8H),2.96(s,2H),2.32(br,4H),1.17(t,J＝7.0Hz,12H)(如图1)。

¹³CNMR(100.6MHz,CDCl₃)167.3,165.1,153.5,151.3,148.9,133.1,129.4,128.4,124.1,123.4,108.1,104.0,97.2,66.9,66.0,60.8,53.4,44.3,12.6(如图2)。

高分辨质谱(MALDI-TOF/TOF质谱仪)的计算值C₃₄H₄₁N₅O₄Na[M+Na]⁺:m/z606.3056实测值606.3051(如图3)。

荧光探针L1的荧光光谱测定：

荧光探针L1的荧光光谱测定溶液配制，以DMSO为溶剂，配制1.0×10^-3mol/L的荧光探针L1的溶液，然后再用体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲(PBS,10mM,pH7.4)为溶剂，稀释成1.0×10^-5mol/L；取2ml浓度为1.0×10^-5mol/L的荧光探针L1的体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲(PBS,10mM,pH7.4)溶液，然后分别加入20μl浓度为1.0×10^-3mol/L的各种离子(Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Ag⁺、Na⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺)溶液，摇匀，后在λ＝530nm的激发波长下测定其荧光发射光谱(如图4)，结果发现荧光探针L1荧光强度很弱；加入Al³⁺、Cr³⁺、Fe³⁺后，荧光探针L1在590nm处荧光强度显著增强(λ＝530nm)，在λ＝265nm照射下发出红光(如图4)可以通过肉眼识别，而其它离子没有发现类似变化。

荧光探针L1的荧光光谱滴定实验及检测限的测定：

取2ml浓度为1.0×10^-5mol/L的荧光探针L1的体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲(PBS,10mM,pH7.4)溶液，加入不同浓度的金属离子可发现，随着Al³⁺、Cr³⁺、Fe³⁺浓度的增加，荧光探针L1在590nm处荧光强度逐渐增强，当Cr³⁺浓度为荧光探针L2浓度的40倍(图5)、Al³⁺浓度为荧光探针L1浓度的30倍(图6)和Fe³⁺浓度为荧光探针L1浓度30倍(图7)时达到最高值，说明了达到最高饱和倍数。通过离子浓度与荧光强度的关系曲线呈现良好的线性关系。其中荧光探针L1对Al³⁺的检测限为1.3×10^-5mol/L，R＝0.9941；对Cr³⁺的检测限为1.1×10^-4mol/L，R＝0.9902；对Fe³⁺的检测限为9.4×10^-5mol/L，R＝0.9955。

荧光探针L1的对Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺离子识别的选择性和抗干扰性：

取2ml浓度为1.0×10^-5mol/L的荧光探针L1的体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲(PBS,10mM,pH7.4)溶液，然后分别加入40μl浓度为1.0×10^-3mol/L的离子Al³⁺溶液，摇匀，后在λ＝530nm的激发波长下测定其荧光发射光谱，结果显示加入其它金属离子如：Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Ag⁺、Na⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺，对其荧光发射和可见吸收强度影响很小，这就表明了荧光探针L1对Al³⁺识别具有较高的选择性和较好的抗干扰能力(图8)。同样，加入相同于Cr³⁺、Fe³⁺浓度的共存金属离子，荧光探针L1对Cr³⁺、Fe³⁺识别具有较高的选择性和较好的抗干扰能力(图9、图10)。

实施例3合成化合物3和化合物6

其反应式如下：

(1)化合物3的合成

罗丹明B(444mg,1.0mmol)和炔丙胺(82.5mg,1.5mmol)，溶解于干燥的二氯甲烷中，加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(568mg,1.5mmol))和三乙胺(152mg,1.5mmol)，在室温下反应15h，减压旋干，硅胶柱层析得到白色固体359mg，产率为75％。

(2)化合物4的合成

2-氨基苯并噻唑(1g,6.8mmol)和(0.65g,8.2mmol)吡啶溶解于干燥的二氯甲烷中，在冰浴条件下，滴加溴乙酰溴(1.7g,8.2mmol)的二氯甲烷溶液。TLC跟踪，硅胶柱层析，得到黄色固体化合物4产率为85％。

(3)化合物6的合成

向100mL的烧瓶中加入化合物4(270mg，1mmol)和叠氮化钠(650mg，10mmol)，溶解于干燥的DMF，在室温条件下反应12h。TLC跟踪，结束反应。乙酸乙酯萃取，多次水洗，干燥，过滤减压旋干，硅胶柱层析，得到黄色固体221mg，产率为95％。

实施例4

合成荧光探针L2，其反应式如下：

具体步骤是：

将化合物3(240mg，0.5mmol)、化合物6(173mg，0.75mmol)、五水硫酸铜(125mg，0.5mmol)和抗坏血酸钠(198mg，1mmol)，溶解在50mL溶剂中，溶剂为体积比为1:1的二氯甲烷和水，在室温条件下反应12h，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋干溶剂；硅胶柱层析得到白色固体荧光探针L2，231mg，产率为65％。

该罗丹明类多功能荧光探针的基本数据：

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.17(d,J＝8.0Hz,1H),7.84(t,J＝8.0Hz,2H),7.49–7.39(m,3H),7.33(t,J＝7.5Hz,1H),7.16(d,J＝7.5Hz,1H),6.82(s,1H),6.46(s,1H),6.43(s,1H),6.32(dd,J₁＝2.4HzJ₂＝9.2Hz,2H),4.83(s,2H),4.53(s,2H),3.34(q,J＝6.8Hz,8H),1.18(t,J＝6.8Hz,12H).(如图11)。

¹³CNMR(400MHz,CDCl₃)167.3,165.9,157.9,154.1,153.0,148.6,143.7,133.3,130.3,128.8,128.7,126.7,125.3,124.3,124.0,122.2,108.4,104.8,97.6,64.7,52.5,44.1,35.1,12.9.(如图12)。

高分辨质谱(MALDI-TOF/TOF质谱仪)的计算值C₄₀H₄₀N₈O₃S的计算值[M⁺],712.3；实测值712.3(如图13)。

荧光探针L2的荧光光谱测定：

荧光探针L2的荧光光谱测定溶液配制，以DMSO为溶剂，配制1.0×10^-3mol/L的荧光探针L2的溶液，然后再用体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲(PBS,10mM,pH7.4)为溶剂，稀释成1.0×10^-5mol/L；取2mL浓度为1.0×10^-5mol/L的荧光探针L2的体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲(PBS,10mM,pH7.4)溶液，然后分别加入20μL浓度为1.0×10^-3mol/L的各种离子(Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Ag⁺、Na⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺)溶液，摇匀，后在λ＝530nm的激发波长下测定其荧光发射光谱(如图14)，结果发现化合物1荧光强度很弱；加入Al³⁺、Cr³⁺、Fe³⁺后，化合物1在590nm处荧光强度显著增强(λ＝530nm)，在λ＝365nm紫外线照射下发出红光可以通过肉眼识别，而其它离子没有发现类似变化。

荧光探针L2的荧光光谱滴定实验及检测限的测定：

取2mL浓度为1.0×10^-5mol/L的荧光探针L2的体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲(PBS,10mM,pH7.4)溶液，加入不同浓度的金属离子可发现，随着Al³⁺、Cr³⁺、Fe³⁺浓度的增加，荧光探针L2在590nm处荧光强度逐渐增强，当Cr³⁺浓度为荧光探针L2浓度的30倍(图15)、Al³⁺浓度为荧光探针L2浓度的30倍(图16)和Fe³⁺浓度为荧光探针L2浓度25倍(图17)时达到最高值，说明了达到最高饱和倍数。通过离子浓度与荧光强度的关系曲线呈现良好的线性关系。其中荧光探针L2对Al³⁺的检测限为1.374×10^-4mol/L，R＝0.99454；对Cr³⁺的检测限为6.945×10^-5mol/L，R＝0.99223；对Fe³⁺的检测限为9.739×10^-5mol/L，R＝0.99697。

荧光探针L2的对Fe³⁺、Cr³⁺和Al³⁺离子识别的选择性和抗干扰性

取2mL浓度为1.0×10^-5mol/L的荧光探针L2的体积比为1:1的甲醇和磷酸缓冲(PBS,10mM,pH7.4)溶液，然后分别加入20μL浓度为1.0×10^-3mol/L的离子Al³⁺溶液，摇匀，后在λ＝530nm的激发波长下测定其荧光发射光谱，结果显示加入其它金属离子如：Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Ag⁺、Na⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺，对其荧光发射和可见吸收强度影响很小，这就表明了荧光探针L2对Al³⁺识别具有较高的选择性和较好的抗干扰能力(图18)。同样，加入相同于Cr³⁺、Fe³⁺浓度的共存金属离子，荧光探针L2对Cr³⁺、Fe³⁺识别具有较高的选择性和较好的抗干扰能力(图19、图20)。

实施例5

合成荧光探针L2，其反应式如下：

具体步骤是：

将化合物3(240mg，0.5mmol)、化合物6(173mg，0.75mmol)、五水硫酸铜(12.5mg，0.05mmol)和抗坏血酸钠(99mg，0.5mmol)，溶解在50mL溶剂中，溶剂为体积比为1:1的二氯甲烷和水，在室温条件下反应12h，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋干溶剂；硅胶柱层析得到白色固体荧光探针L2；该罗丹明类多功能荧光探针L2的¹HNMR谱图如图11所示，¹³CNMR谱图如图12，高分辨质谱(MALDI-TOF/TOF质谱仪)的计算值C₄₀H₄₀N₈O₃S的计算值[M⁺],712.3；实测值712.3(如图13)。

实施例6

合成荧光探针L2，其反应式如下：

具体步骤是：

将化合物3(240mg，0.5mmol)、化合物6(173mg，0.75mmol)、五水硫酸铜(250mg，1mmol)和抗坏血酸钠(0.99mg，0.05mmol)，溶解在50mL溶剂中，溶剂为体积比为1:1的二氯甲烷和水，在室温条件下反应12h，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸镁干燥，过滤，旋干溶剂；硅胶柱层析得到白色固体荧光探针L2；该罗丹明类多功能荧光探针L2的¹HNMR谱图如图11所示，¹³CNMR谱图如图12，高分辨质谱(MALDI-TOF/TOF质谱仪)的计算值C₄₀H₄₀N₈O₃S的计算值[M⁺],712.3；实测值712.3(如图13)。