一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶

技术领域

本发明属于海洋微生物技术领域，具体涉及一株海洋细菌PseudoalteromonasspSC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶。

背景技术

硫酸鼠李聚糖是广泛存在于石莼、浒苔、礁膜等绿藻中的一种高分子量的硫酸杂多糖，主要由鼠李糖及鼠李糖硫酸酯组成，另外还含有葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、糖醛酸等。研究发现它具有多种生理活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、免疫调节、抗氧化活性等功效，是一类具有重要生物活性的非常有药用价值的化合物。但因硫酸鼠李聚糖分子量巨大，分子量分布从几万到百万不等，严重影响了它的吸收效率；同时其具有一定的粘性，也大大阻碍了它作为药物的应用。目前，降解硫酸鼠李聚糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。较之化学降解法和物理降解法，酶解法具有降解特异性、选择性好，反应过程容易控制，易于得到所需分子量范围的低聚糖产品，产物含量高，功能性强等优势，是降解硫酸鼠李聚糖的最佳方法。

据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，国内外关于硫酸鼠李聚糖酶已有一些报道，产硫酸鼠李聚糖酶的菌种主要来源于交替单胞菌属（Alteromonassp.）、Catenovulum属海洋细菌及一些真菌。酶的分子量是酶重要的性质表征，它代表了不同酶蛋白的分子大小，也是描述酶学性质的重要指标。如CN104560774A公开了一种来源于Catenovulum属的Catenovulumsp.LP214生产浒苔多糖裂解酶制备硫酸鼠李聚糖镶嵌段寡糖，其酶分子量为75.5kDa；CN103451119A公开了一种来源于交替单胞菌属的AlteromonascdwellianaA321菌株生产浒苔多糖降解酶，其酶L1的分子量约为76.4kDa，酶L2的分子量约为100kDa左右；CN1189185公开了一种来源于青霉属的产硫酸鼠李聚糖酶菌株（保藏于CNCM保藏号1-1577和1-1578），该菌所产酶具有降解鼠李半乳糖醛酸聚糖的能力。

发明内容

本发明的目的是提供了一株海洋细菌PseudoalteromonasspSC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶，本发明提供的菌株来源于海洋假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），能够生产硫酸鼠李聚糖酶，有效降解硫酸鼠李聚糖生成寡糖，克服了将硫酸鼠李聚糖应用在保健、医药、农业等方面的困难，对新型寡糖的开发、构效关系研究及应用开发都具有重要的现实意义。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株海洋细菌PseudoalteromonasspSC127，该菌株于2015年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2015422。

本发明还提供了所述的海洋细菌PseudoalteromonasspSC127产生的石莼硫酸鼠李聚糖酶，所述石莼硫酸鼠李聚糖酶通过以下制备方法制得：

（1）发酵产酶：将所述菌株SC127接种于含有硫酸鼠李聚糖的培养基中，50～250r/min，15～32℃培养20-48h，获得种子培养液，将种子培养液接种于新鲜的发酵培养基得到发酵菌液；

（2）粗酶制备：将所述发酵菌液冷冻离心，取上清液；向上清液中缓慢加入预冷丙酮，搅拌均匀，静止，冷冻离心，弃上清；沉淀部分加入蒸馏水复溶，使沉淀充分溶解，冷冻离心，去除不溶的杂蛋白，上清部分即为浓缩粗酶液；

（3）酶的纯化：将浓缩粗酶液通过Q-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析对酶进行分离纯化，最终获得纯化的石莼硫酸鼠李聚糖酶。

所述石莼硫酸鼠李聚糖酶分子量为110.6kDa。

所述步骤（3）中将浓缩粗酶液过滤后上样于Q-SepharoseFastFlow离子交换柱，洗脱液为含有NaCl的PBS缓冲液，进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱液，将有活性的蛋白合并，进行下一步纯化。

离子交换柱纯化后的活性蛋白浓缩后上样于SephadexG-100凝胶柱，洗脱液为PBS缓冲液，收集洗脱液，将有活性的蛋白合并。

本发明从海泥样品中筛选出一株高产石莼硫酸鼠李聚糖酶的菌株，依据形态学特征和16SrDNA序列分析，初步鉴定其属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，命名为Pseudoalteromonassp.SC127。

将该菌株接种到含硫酸鼠李聚糖的培养基中，50～250r/min，15～32℃培养20-48h，将发酵液4℃下8000rpm冷冻离心5min，即得含硫酸鼠李聚糖酶发酵菌液。向发酵菌液中加入1倍体积的无水乙醇或丙酮，4℃过夜，于4℃下10000r/min离心，用等体积的蒸馏水将沉淀复溶，得到粗酶液，进一步采用丙酮沉淀、Q-SepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析对酶进行分离纯化，经SDS-PAGE检验，最终收集到的活力组分呈现单一条带，该酶的相对分子质量为110.6kDa。经查阅资料、检索文献可知，该石莼硫酸鼠李聚糖酶的分子量不同于以往的报道，且为首次发现假交替单胞菌属菌株具有产硫酸鼠李聚糖酶能力。

本发明提供的具有硫酸鼠李聚糖酶生产能力的细菌，该菌株产酶活力高。1个酶活单位定义为35℃、pH7.0条件下，每分钟产生1微克还原糖需要的酶量。经测定，Pseudoalteromonassp.SC127发酵菌液酶活可达到3.5U/mL，具有在工业生产中的应用价值。

附图说明

图1Pseudoalteromonassp.SC127菌株所产硫酸鼠李聚糖酶的SDS-PAGE电泳结果。左边为标准蛋白分子量，右边为菌株Pseudoalteromonassp.SC127发酵并经纯化后的电泳纯度的硫酸鼠李聚糖酶蛋白条带，表示数量单位为：kDa。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

一、菌株Pseudoalteromonassp.SC127的筛选

对海藻泥样品进行微生物富集、初筛、复筛，获得产酶菌。对产酶菌进行液体培养，从发酵菌液中提取胞外产物，获得硫酸鼠李聚糖酶。

具体技术方案如下：

1.富集培养：无菌条件下取适量绿藻样品，加入无菌海水捣碎，取样品2.5mL接入50mL富集培养基（硫酸鼠李聚糖0.3%，蛋白胨0.5%，硝酸钠0.4%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.15%，陈海水配制，pH自然）进行培养，在25℃，150rpm的恒温培养摇床培养7天。培养结束后，取上述富集液5mL接入富集培养基重复富集两次。

2.初筛：将富集培养液适当稀释后，涂布于选择性培养基（硫酸鼠李聚糖0.3%，硝酸钠0.4%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.15%，陈海水配制，pH自然）平板上，在24℃培养2天。将平板中所有形态不同的单菌落，进行纯化培养，再接入2216E琼脂斜面培养基，于25℃培养至长满斜面，置于4℃冰箱保存。

3.复筛：将上述斜面菌种分别接种至100mL液体培养基（硫酸鼠李聚糖0.3%，硝酸钠0.4%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.15%，陈海水配制，pH自然），于24℃，150rpm摇床培养，用DNS法测定还原糖含量。结果获得一株菌Pseudoalteromonassp.SC127，培养24小时后还原糖含量最高，达到1.8mg/mL。

4.分子生物学鉴定：16SrDNA（SEQIDNO:1）分子生物学鉴定属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）。该菌株已于2015年07月02日保藏于中国武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2015422。

二、Pseudoalteromonassp.SC127产硫酸鼠李聚糖酶的制备

1.发酵产酶：将保藏编号为CGMCCNO.M2015422的细菌Pseudoalteromonassp.SC127接种于发酵培养基（硫酸鼠李聚糖0.3%，氯化钠1%，硝酸钠0.4%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.15%，pH自然）中，24℃、150rpm条件下培养24h，获得种子培养液，将种子培养液按5%接种量接种于新鲜的发酵培养基，于25℃、150rpm条件下培养48h，离心去除不溶物，即制得发酵菌液。

取发酵菌液与0.1%的硫酸鼠李聚糖（pH7.0，陈海水溶解）按照1:10（v/v）比例混合，于35℃、120rpm水浴摇床振荡反应30min，以DNS法测定还原糖含量。1个酶活单位定义为35℃、pH7.0条件下，每分钟产生1微克还原糖需要的酶量。经测定，菌株Pseudoalteromonassp.SC127培养48h后的菌液产酶活力达到3.5U/mL。

上述的实验结果表明，本发明筛选得到的产酶菌具有很高的产酶能力，所生成的酶能有效降解高分子量的硫酸鼠李聚糖，具有良好的市场推广前景。

2.粗酶制备：将上述发酵液4℃下8000rpm冷冻离心5min，取上清液。收集1000mL上清液，按照发酵液上清：丙酮=1：1(v/v)的比例向上清液中缓慢加入预冷丙酮(-20℃)，搅拌均匀，于4℃下静止2h，10000rpm冷冻离心5min，弃上清，沉淀部分加入100mL蒸馏水复溶，4℃磁力搅拌，使沉淀充分溶解，10000rpm冷冻离心5min，去除不溶的杂蛋白，上清部分即为浓缩粗酶液，用于进一步纯化。

3.纯化酶：将透过0.22μm微孔滤膜的浓缩粗酶液上样于Q-SepharoseFastFlow离子交换柱，洗脱液为含有NaCl（0-1mol/L）的0.02mol/LPBS(pH8.0)缓冲液，进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱液，在280nm下检测蛋白峰，DNS法测定洗脱液的酶活力，将有活性的部分合并，进行下一步纯化。将Q-SepharoseF.F部分纯化后的活性蛋白浓缩后上样于SephadexG-100(Φ1cm×100cm)凝胶柱，洗脱液为的0.02mol/LPBS(pH8.0)缓冲液，在280nm下检测蛋白峰，DNS法测定对应蛋白峰部分的洗脱液的酶活力，将有活性的部分合并。

4.酶分子量测定：用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）技术确定硫酸鼠李聚糖酶的分子量。具体方法是：将不同分子量标准蛋白质（proteinmarker）和加入2×SampleBuffer的硫酸鼠李聚糖酶样品在沸水浴中加热5min使其变性，取出10000rpm离心3min，冷却后上样，电泳后用考马斯亮蓝R250染色。脱色后，测定标准蛋白质和各样品的迁移距离，计算相对迁移率，以相对迁移率和各标准蛋白质分子量的对数以最小二乘法做标准曲线，计算此硫酸鼠李聚糖酶的分子量。此酶在SDS-PAGE上显示的分子量为：110.6kDa（图1）。其分子量不同于已报道的任何硫酸鼠李聚糖酶的分子量。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCELISTING

<110>青岛海洋生物医药研究院股份有限公司

<120>一种海洋细菌PseudoalteromonasspSC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶

<130>2015.12.10

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1441

<212>DNA

<213>Pseudoalteromonassp.

<400>1

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