两亲性聚合物及其制备方法和两亲性聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及一种两亲性聚合物、一种两 亲性聚合物的制备方法、一种两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法、由两亲性 聚合物纳米颗粒的制备方法制备得到的两亲性聚合物纳米颗粒及其应用。

背景技术

阳离子多肽因为其强有力的抗菌活性、抗菌谱广、可生物降解和生物相 容性好而得到了广泛的关注。大多数阳离子多肽能与微生物膜通过静电相互 作用在细菌表面造成细菌细胞壁/膜的破坏。然而由于其免疫原性高、体内半 衰期短和成本高，限制了阳离子多肽的临床应用。

ε-多聚赖氨酸是一种由白色链霉菌产生的天然阳离子多肽，由25-35个 赖氨酸残基组成。ε-多聚赖氨酸对革兰氏阳性(如金黄色葡萄球菌)和革兰 氏阴性菌(如大肠杆菌)显示了潜在的抗菌活性，已经被美国食品和药物管 理局(FDA)批准可作为抗菌剂添加在各式各样的产品中。

然而，由于大多数临床使用抗生素并不损伤细菌的细胞膜或细胞壁，而 是通过细胞膜和/或细胞壁渗透到细胞内来抑制蛋白质合成和DNA复制，这 种方式使得细菌容易对抗生素产生耐药性。近年来，大量的实验和临床数据 表明越来越多的细菌对传统抗生素产生耐药性，因此需要开发新型抗菌制剂 或材料来满足临床对抗菌制剂的需求。

发明内容

本发明的目的是克服在单独使用聚赖氨酸进行抗菌时由于被细菌降解 而导致的抗菌性能消失的缺陷，提供一种生物安全性高、药效发挥迅速、药 效持续时间长、抗菌谱广且成本低的两亲性聚合物及两亲性聚合物纳米颗 粒。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种两亲性聚合物，该两 亲性聚合物具有式(1)所示的结构：

其中，m为20-100的整数，n为25-35的整数。

第二方面，本发明提供了一种两亲性聚合物的制备方法，该方法包括： 在溶剂和连接剂的存在下，将式A所示的聚合物与式B所示的聚合物接触，

其中，在式A所示的聚合物中，m为20-100的整数，优选为21-30的 整数；在式B所示的聚合物中，n为25-35的整数。

第三方面，本发明提供了一种两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法，该方 法包括：在乳化反应条件下，将含有式(1)所示结构的两亲性聚合物的溶 液与含有稳定剂的水溶液接触，

其中，m为20-100的整数，优选为21-30的整数；n为25-35的整数。

第四方面，本发明提供了一种通过本发明的两亲性聚合物纳米颗粒的制 备方法制备得到的两亲性聚合物纳米颗粒。

第五方面，本发明提供了一种两亲性聚合物纳米颗粒在制备抗菌药物中 的应用。

本发明提供的两亲性聚合物纳米颗粒能够克服在单独使用聚赖氨酸进 行抗菌时由于被细菌降解而导致的抗菌性能消失的缺陷，而且，本发明提供 的两亲性聚合物纳米颗粒是一种生物安全性高、药效发挥迅速、药效持续时 间长、抗菌谱广且成本低的纳米颗粒。

另外，本发明提供的两亲性聚合物纳米颗粒对细菌，特别是枯草芽孢杆 菌抗菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有很好的抗菌活性。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与 下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在 附图中：

图1是本发明实施例1的式A所示的聚合物、式B所示的聚合物和式 (1)所示的两亲性聚合物的红外光谱图。

图2是通过透射电镜观察本发明实施例1的两亲性聚合物纳米颗粒的形 貌图。

图3是通过透射电镜观察本发明实施例1的两亲性聚合物纳米颗粒的粒 径分布图。

图4是将聚赖氨酸以浓度为10μg/mL的水溶液形式和大肠杆菌共培养2 小时后的透射电镜图。

图5是将本发明实施例1的两亲性聚合物纳米颗粒以浓度为10μg/mL 的水溶液形式和大肠杆菌共培养2小时后的透射电镜图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一种两亲性聚合物，该两亲性聚合物具有式(1) 所示的结构：

其中，m可以为20-100的整数，n可以为25-35的整数。

根据本发明所述的式(1)所示的两亲性聚合物，优选情况下，m可以 为21-30的整数，n可以为25-35的整数。

更加优选情况下，在本发明中，所述式(1)所示的两亲性聚合物的分 子量可以为5000-20000。

在本发明中，需要特别说明的是，所述20-100的整数是指包括20和100 在内的，且包括20-100之间的每一个整数，也就是说20-100之间的每一个 整数都是本发明的技术方案，本领域技术人员可以根据实际需要选择m值的 大小。同样的，针对n可以为25-35的整数以及m优选为21-30的整数也是 如上类似的解释，即n可以为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 和35中的任意一个整数，且m优选可以为21、22、23、24、25、26、27、 28、29和30中的任意一个整数。

第二方面，本发明还提供了一种两亲性聚合物的制备方法，该方法包括： 在溶剂和连接剂的存在下，将式A所示的聚合物与式B所示的聚合物接触，

其中，在式A所示的聚合物中，m为20-100的整数，优选为21-30的 整数；在式B所示的聚合物中，n为25-35的整数。

在本发明的所述两亲性聚合物的制备方法中，通过该方法制备得到的即 为本发明上述的式(1)所示的两亲性聚合物，因此，有关式(1)所示的两 亲性聚合物的相关定义和解释以及保护范围均适用于本发明的所述两亲性 聚合物的方法中。

根据本发明所述的两亲性聚合物的制备方法，其中，所述式A所示的聚 合物、式B所示的聚合物和连接剂的用量摩尔比可以为1-20：1：5-20；优 选情况下，式A所示的聚合物、式B所示的聚合物和连接剂的用量摩尔比 为2-10：1：8-15。

根据本发明所述的两亲性聚合物的制备方法，其中，所述接触的条件包 括：接触的温度为0-35℃；优选接触的温度为4-25℃。

根据本发明所述的两亲性聚合物的制备方法，其中，所述接触的条件包 括：接触的时间为2-48h；优选接触的时间为4-24h。

在本发明所述的两亲性聚合物的制备方法中，所述连接剂可以包括1- 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和/或N,N'-二环己基碳酰亚胺。

优选情况下，在本发明所述的两亲性聚合物的制备方法中，所述溶剂选 自二甲基亚砜和/或N,N-二甲基甲酰胺。

在本发明中，需要特别说明的是，对所述溶剂的用量没有特别的限定， 本领域技术人员可以根据常规用量进行选择。

在本发明中，所述溶剂可以为二氯甲烷、二甲基亚砜、乙醇和丙酮中的 至少一种。

根据本发明所述的两亲性聚合物的制备方法，该方法还可以包括：将所 述接触后得到的产物进行过滤除去固体杂质，并将过滤后得到的溶液在水中 进行透析，然后冷冻干燥，即可得到本发明所述的式(1)所示的两亲性聚 合物的固态产品。

第三方面，本发明提供了一种两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法，该方 法包括：在乳化反应条件下，将含有式(1)所示结构的两亲性聚合物的溶 液与含有稳定剂的水溶液接触，

其中，m为20-100的整数，优选为21-30的整数；n为25-35的整数。

在本发明的所述两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法中，所使用的式(1) 所示的两亲性聚合物的相关定义和解释以及保护范围均与前相同，本发明在 此不再赘述。

根据本发明所述的两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法，其中，所述含有 式(1)所示结构的两亲性聚合物的溶液可以包括所述式(1)所示结构的两 亲性聚合物与二氯甲烷形成的溶液。

根据本发明所述的两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法，其中，相对于每 mg式(1)所示结构的两亲性聚合物，所述二氯甲烷的用量可以为0.1-20mL。

根据本发明所述的两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法，其中，所述稳定 剂可以包括聚乙烯醇(PVA)、十二烷基磺酸钠(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 和吐温80中的至少一种。

优选情况下，在本发明中，所述稳定剂为聚乙烯醇，且所述聚乙烯醇的 分子量可以为1500-2000。

在本发明所述的两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法中，所述乳化反应条 件为本领域技术人员所公知，本发明在此不再赘述。例如在本发明中，可以 采用在超声条件下进行乳化反应。

在本发明中，所述稳定剂采用本领域技术人员公知的两步法加入，也即， 先将所述两亲性聚合物溶液与一部分含有稳定剂的水溶液接触混合，经过超 声乳化后，再将该乳化后的产物加入到剩余部分含有稳定剂的水溶液混合。 两部分的含有稳定剂的水溶液的浓度可以相同或不同，本领域技术人员可以 根据本领域内常规使用的浓度进行选择。本发明优选所述稳定剂水溶液的浓 度为0.3-1重量％。

根据本发明所述的两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法，对所述含有式 (1)所示结构的两亲性聚合物的溶液与含有稳定剂的水溶液接触的方式没 有特别的限定，优选情况下，本发明可以采用先将含有式(1)所示结构的 两亲性聚合物溶于溶剂中形成溶液，然后将所述溶液与一部分含有稳定剂的 水溶液进行接触。本发明的方法对接触的条件没有特别的限定，例如可以在 室温条件下接触1-60min。

根据本发明所述的两亲性聚合物纳米颗粒的制备方法，该方法还可以包 括：除去进行超声后所得到的产物中的溶剂例如二氯甲烷等，然后进行将含 有两亲性聚合物纳米颗粒的水溶液进行离心分离，收集沉淀物即可以得到高 纯度的两亲性聚合物纳米颗粒。

第四方面，本发明还提供了一种通过本发明的两亲性聚合物纳米颗粒的 制备方法制备得到的两亲性聚合物纳米颗粒。

根据本发明所示的两亲性聚合物纳米颗粒，其中，所述两亲性聚合物纳 米颗粒的粒径为50-300nm。

第五方面，本发明还提供了一种两亲性聚合物纳米颗粒在制备抗菌药物 中的应用。

在本发明中，所述两亲性聚合物纳米颗粒特别地对大肠杆菌、金黄色葡 萄球菌和枯草芽孢杆菌具有很好的抗性。

与现有抗菌聚合物相比，本发明所述的两亲性聚合物纳米颗粒具有以下 优点：本发明的两亲性聚合物制备过程简便、原料便宜，本发明的抗菌聚合 物是含有大量正电荷的氨基ε-聚赖氨酸，这种抗菌聚合物制备成的纳米颗粒 通过带正电荷的氨基发挥抗菌作用，同时纳米粒子的可以抵抗降解酶对ε- 聚赖氨酸的降解作用，提高抗菌效果和时间。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，所使用的原 料均为市售品。在以下实施例和对比例中，所述聚已内酯购自济南岱罡生物 科技有限公司；所述聚赖氨酸购自浙江银象生物科技有限公司；所述聚乙烯 醇购自国药集团化学试剂有限公司，牌号为PVA124，皂化度为85mol％，在 25℃下的粘度为700mPas。

实施例1

本实施例用于制备本发明所述的式(1)所示的两亲性聚合物和两亲性 聚合物纳米颗粒，其中，m为30，n为30。

制备两亲性聚合物：取式A所示的聚已内酯(m为30，用量1g)和式 B所示的聚赖氨酸(n为30)置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL的DMSO， 再加入N,N'-二环己基碳酰亚胺(购自百灵威化学试剂有限公司，下同)，其 中，所述聚已内酯、聚赖氨酸和N,N'-二环己基碳酰亚胺的用量摩尔比为5： 1：10，在20℃温度下反应20h，反应结束后将产物进行减压浓缩，将浓缩 后的溶液在水中进行透析，冷冻干燥后得两亲性聚合物1-1，其中，聚已内 酯、聚赖氨酸和两亲性聚合物1-1的红外光谱图如图1所示，且两亲性聚合 物1-1的分子量通过飞行时间质谱仪(购自美国布鲁克道尔顿公司，型号为 MicroflexLRFMALDI-TOF，下同)测得，平均分子量为5700。

制备两亲性聚合物纳米颗粒：称取10mg两亲性聚合物1-1，溶解于1mL 二氯甲烷中，然后将该两亲性聚合物的二氯甲烷溶液加入到2mL的1重量％ 的聚乙烯醇水溶液，在25℃下，用功率为57W且频率为23kHz的超声波辐 射5min后，加入到10mL的0.6重量％的聚乙烯醇水溶液中，磁力搅拌10min 后除去二氯甲烷，然后在12000rpm/min条件下离心10min，得到两亲性聚合 物纳米颗粒1-2，其中，通过透射电镜观察该两亲性聚合物纳米颗粒1-2的 形貌图如图2所示，粒径分布如图3所示。

实施例2

本实施例用于制备本发明所述的式(1)所示的两亲性聚合物和两亲性 聚合物纳米颗粒，其中，m为25，n为35。

制备两亲性聚合物：取式A所示的聚已内酯(m为25，用量1g)和式 B所示的聚赖氨酸(n为35)置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL的DMSO， 再加入N,N'-二环己基碳酰亚胺，其中，所述聚已内酯、聚赖氨酸和N,N'-二 环己基碳酰亚胺的用量摩尔比为8：1：8，在25℃温度下反应15h，反应结 束后将产物进行减压浓缩，将浓缩后的溶液在水中进行透析，冷冻干燥后得 两亲性聚合物2-1，其中，聚已内酯、聚赖氨酸和两亲性聚合物2-1的红外 光谱图与图1相似，且两亲性聚合物2-1的平均分子量为5500。

制备两亲性聚合物纳米颗粒：称取10mg两亲性聚合物2-1，溶解于10mL 二氯甲烷中，然后将该两亲性聚合物的二氯甲烷溶液加入到2mL的1重量％ 的聚乙烯醇水溶液，在25℃下，用功率为57W且频率为23kHz的超声波辐 射5min后，加入到10mL的0.6重量％的聚乙烯醇水溶液中，磁力搅拌10min 后除去二氯甲烷，然后在12000rpm/min条件下离心10min，得到两亲性聚合 物纳米颗粒2-2，其中，通过透射电镜观察该两亲性聚合物纳米颗粒2-2的 形貌图与图2相似，粒径分布与图3相似。

实施例3

本实施例用于制备本发明所述的式(1)所示的两亲性聚合物和两亲性 聚合物纳米颗粒，其中，m为20，n为25。

制备两亲性聚合物：取式A所示的聚已内酯(m为20，用量1g)和式 B所示的聚赖氨酸(n为25)置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL的DMSO， 再加入N,N'-二环己基碳酰亚胺，其中，所述聚已内酯、聚赖氨酸和N,N'-二 环己基碳酰亚胺的用量摩尔比为3：1：12，在30℃温度下反应15h，反应结 束后将产物进行减压浓缩，将浓缩后的溶液在水中进行透析，冷冻干燥后得 两亲性聚合物3-1，其中，聚已内酯、聚赖氨酸和两亲性聚合物3-1的红外 光谱图与图1相似，且两亲性聚合物3-1的平均分子量为4900。

制备两亲性聚合物纳米颗粒：称取10mg两亲性聚合物3-1，溶解于20mL 二氯甲烷中，然后将该两亲性聚合物的二氯甲烷溶液加入到2mL的1重量％ 的聚乙烯醇水溶液，在25℃下，用功率为57W且频率为23kHz的超声波辐 射5min后，加入到10mL的0.6重量％的聚乙烯醇水溶液中，磁力搅拌10min 后除去二氯甲烷，然后在12000rpm/min条件下离心10min，得到两亲性聚合 物纳米颗粒3-2，其中，通过透射电镜观察该两亲性聚合物纳米颗粒3-2的 形貌图与图2相似，粒径分布与图3相似。

实施例4

本实施例用于制备如实施例1所示的两亲性聚合物和两亲性聚合物纳米 颗粒，所不同的是，式A所示的聚合物、式B所示的聚合物和连接剂的用 量摩尔比不同。具体地为：

制备两亲性聚合物：取式A所示的聚已内酯(m为30，用量1g)和式 B所示的聚赖氨酸(n为30)置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL的DMSO， 再加入N,N'-二环己基碳酰亚胺(购自百灵威化学试剂有限公司，下同)，其 中，所述聚已内酯、聚赖氨酸和N,N'-二环己基碳酰亚胺的用量摩尔比为12： 1：10，在20℃温度下反应20h，反应结束后将产物进行减压浓缩，将浓缩 后的溶液在水中进行透析，冷冻干燥后得两亲性聚合物4-1，其中，聚已内 酯、聚赖氨酸和两亲性聚合物4-1的红外光谱图与图1相似，且两亲性聚合 物4-1的平均分子量为5800。

制备两亲性聚合物纳米颗粒：称取10mg两亲性聚合物4-1，溶解于1mL 二氯甲烷中，然后将该两亲性聚合物的二氯甲烷溶液加入到2mL的1重量％ 的聚乙烯醇水溶液，在25℃下，用功率为57W且频率为23kHz的超声波辐 射5min后，加入到10mL的0.6重量％的聚乙烯醇水溶液中，磁力搅拌10min 后除去二氯甲烷，然后在12000rpm/min条件下离心10min，得到两亲性聚合 物纳米颗粒4-2，其中，通过透射电镜观察该两亲性聚合物纳米颗粒4-2的 形貌图与图2相似，粒径分布与图3相似。

实施例5

本实施例用于制备如实施例2所示的两亲性聚合物和两亲性聚合物纳米 颗粒，所不同的是，式A所示的聚合物、式B所示的聚合物和连接剂的用 量摩尔比不同。具体地为：

制备两亲性聚合物：取式A所示的聚已内酯(m为25，用量1g)和式 B所示的聚赖氨酸(n为35)置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL的DMSO， 再加入N,N'-二环己基碳酰亚胺，其中，所述聚已内酯、聚赖氨酸和N,N'-二 环己基碳酰亚胺的用量摩尔比为1：1：8，在25℃温度下反应15h，反应结 束后将产物进行减压浓缩，将浓缩后的溶液在水中进行透析，冷冻干燥后得 两亲性聚合物5-1，其中，聚已内酯、聚赖氨酸和两亲性聚合物5-1的红外 光谱图与图1相似，且两亲性聚合物5-1的平均分子量为5400。

制备两亲性聚合物纳米颗粒：称取10mg两亲性聚合物5-1，溶解于10mL 二氯甲烷中，然后将该两亲性聚合物的二氯甲烷溶液加入到2mL的1重量％ 的聚乙烯醇水溶液，在25℃下，用功率为57W且频率为23kHz的超声波辐 射5min后，加入到10mL的0.6重量％的聚乙烯醇水溶液中，磁力搅拌10min 后除去二氯甲烷，然后在12000rpm/min条件下离心10min，得到两亲性聚合 物纳米颗粒5-2，其中，通过透射电镜观察该两亲性聚合物纳米颗粒5-2的 形貌图与图2相似，粒径分布与图3相似。

实施例6

本实施例用于制备本发明所述的式(1)所示的两亲性聚合物和两亲性 聚合物纳米颗粒，其中，m为35，n为25。采用实施例3所述的方法进行， 具体地为：

制备两亲性聚合物：取式A所示的聚已内酯(m为20，用量1g)和式 B所示的聚赖氨酸(n为25)置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL的DMSO， 再加入N,N'-二环己基碳酰亚胺，其中，所述聚已内酯、聚赖氨酸和N,N'-二 环己基碳酰亚胺的用量摩尔比为3：1：12，在30℃温度下反应15h，反应结 束后将产物进行减压浓缩，将浓缩后的溶液在水中进行透析，冷冻干燥后得 两亲性聚合物6-1，其中，聚已内酯、聚赖氨酸和两亲性聚合物6-1的红外 光谱图与图1相似，且两亲性聚合物6-1的平均分子量为5500。

制备两亲性聚合物纳米颗粒：称取10mg两亲性聚合物6-1，溶解于20mL 二氯甲烷中，然后将该两亲性聚合物的二氯甲烷溶液加入到2mL的1重量％ 的聚乙烯醇水溶液，在25℃下，用功率为57W且频率为23kHz的超声波辐 射5min后，加入到10mL的0.6重量％的聚乙烯醇水溶液中，磁力搅拌10min 后除去二氯甲烷，然后在12000rpm/min条件下离心10min，得到两亲性聚合 物纳米颗粒6-2，其中，通过透射电镜观察该两亲性聚合物纳米颗粒6-2的 形貌图与图2相似，粒径分布与图3相似。

测试例1：

将实施例1中制备得到的两亲性聚合物纳米颗粒以及实施例1中使用的 聚赖氨酸分别加入到1mL含有大肠杆菌的水溶液中，使得两亲性聚合物纳 米颗粒和聚赖氨酸的终浓度均为10μg/mL，在37℃下进行共培养。其中，大 肠杆菌的起始浓度为10⁸个/mL，每2小时取混合培养液检测大肠杆菌数目， 共检测8小时，结果如表1所示。其中，浓度为10μg/mL的聚赖氨酸水溶液 和大肠杆菌共培养2小时后的透射电镜图如图4所示；实施例1的浓度为 10μg/mL的两亲性聚合物纳米颗粒水溶液和大肠杆菌共培养2小时后的透射 电镜图如图5所示。

测试例2-6

测试例2-6采用测试例1的方法进行测试，不同的是，测试例2-6中使 用的两亲性聚合物纳米颗粒分别为来自实施例2-6中制备得到的两亲性聚合 物纳米颗粒，测试结果如表1所示。

通过表1的结果可以看出，采用本发明的两亲性聚合物纳米颗粒与大肠 杆菌共培养时，所取得的抑菌效果明显优于对照组中仅采用聚赖氨酸的抑菌 效果。

表1

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。