一种基于介孔铂钛负载中性红构建的生物传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明一种基于介孔铂钛负载中性红构建的生物传感器的制备方法及应用。具体是采用具有良好催化性能和大的比表面积的介孔铂钛，制备一种检测甲胎蛋白的传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

甲胎蛋白甲胎蛋白是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，但当肝细胞发生癌变时，会产生大量甲胎蛋白，而且随着病情恶化，甲胎蛋白在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标，因此对甲胎蛋白的早期诊断很重要。目前已有的甲胎蛋白的临床检测方法很多，如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。电化学免疫传感器是将免疫学方法与电化学方法相结合的一种生物传感器，利用抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。因此本发明制备了一种基于介孔铂钛负载中性红构建的生物传感器，实现了对甲胎蛋白的检测。

本发明利用介孔铂钛具有良好的电化学催化性能和大的比表面积，能够在负载大量的中性红的同时，有效地催化中性红的氧化还原过程，从而在检测甲胎蛋白的过程中产生放大的电化学信号，有效地增强了电化学免疫传感器的灵敏度。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测甲胎蛋白提供了新途径。

发明内容

本发明的目的之一是基于介孔铂钛负载中性红构建了一种无酶、快速且超灵敏的夹心型生物传感器。

本发明的目的之二是将该夹心型生物传感器应用于甲胎蛋白的高灵敏、特异性检测。

本发明的技术方案如下

1.一种基于介孔铂钛负载中性红构建的生物传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6μL浓度为1~2mg/mL的金杂化石墨烯水溶液，干燥；

（3）继续将6μL浓度为5~20μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（4）用3μL浓度为5~20mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（5）将6μL浓度为0.0001~10ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原用于和捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净；

（6）将6μL浓度为1~3mg/mL的介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液的制备

将铂钛铝合金薄片置入浓度为0.5mol/L的NaOH溶液中，室温下放置36~60h，随后放入浓度为2mol/L的HNO₃溶液中，室温下放置2~3h，用超纯水清洗多次后，干燥得到介孔铂钛；

将1mL的1~3mg/mL介孔铂钛水溶液和1mL的1~3mg/mL中性红溶液混合，震荡12h后离心，重新分散在1mL的水中，得到介孔铂钛负载中性红水溶液；

将1mL的1~3mg/mL的介孔铂钛负载中性红溶液和1~2mL浓度为10μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，震荡12h，离心洗涤后分散于1mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。

甲胎蛋白的检测方法

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）选择差分脉冲伏安法对甲胎蛋白抗原进行检测，选择在-0.8~-0.4V电压下进行扫描，记录电流变化；

（3）将待测样品溶液代替甲胎蛋白抗原标准溶液进行检测。

本发明的有益成果

（1）本发明采用的介孔铂钛具有大的比表面积，能够负载大量中性红。

（2）本发明采用的介孔铂钛具有良好的生物相容性，能够有效固定抗体。

（3）本发明采用的介孔铂钛具有良好的催化性能，能够有效催化中性红的氧化还原过程，提高传感器的灵敏度。

（4）本发明将制备的夹心型生物传感器用于甲胎蛋白的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。

具体实施方式

实施例1一种基于介孔铂钛负载中性红构建的生物传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6μL浓度为1mg/mL的金杂化石墨烯水溶液，干燥；

（3）继续将6μL浓度为5μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（4）用3μL浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（5）将6μL浓度为0.0001~10ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原用于和捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净；

（6）将6μL浓度为1mg/mL的介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例2一种基于介孔铂钛负载中性红构建的生物传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6μL浓度为1.5mg/mL的金杂化石墨烯水溶液，干燥；

（3）继续将6μL浓度为10μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（4）用3μL浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（5）将6μL浓度为0.0001~10ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原用于和捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净；

（6）将6μL浓度为2mg/mL的介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例3一种基于介孔铂钛负载中性红构建的生物传感器的制备方法

（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加6μL浓度为2mg/mL的金杂化石墨烯水溶液，干燥；

（3）继续将6μL浓度为20μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（4）用3μL浓度为20mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；

（5）将6μL浓度为0.0001~10ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原用于和捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净；

（6）将6μL浓度为3mg/mL的介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。

实施例4介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液的制备

将铂钛铝合金薄片置入浓度为0.5mol/L的NaOH溶液中，室温下放置36h，随后放入浓度为2mol/L的HNO₃溶液中，室温下放置2h，用超纯水清洗多次后，干燥得到介孔铂钛；

将1mL的1mg/mL介孔铂钛水溶液和1mL的1mg/mL中性红溶液混合，震荡12h后离心，重新分散在1mL的水中，得到介孔铂钛负载中性红水溶液；

将1mL的1mg/mL的介孔铂钛负载中性红溶液和1mL浓度为10μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，震荡12h，离心洗涤后分散于1mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。

实施例5介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液的制备

将铂钛铝合金薄片置入浓度为0.5mol/L的NaOH溶液中，室温下放置48h，随后放入浓度为2mol/L的HNO₃溶液中，室温下放置2.5h，用超纯水清洗多次后，干燥得到介孔铂钛；

将1mL的2mg/mL介孔铂钛水溶液和1mL的2mg/mL中性红溶液混合，震荡12h后离心，重新分散在1mL的水中，得到介孔铂钛负载中性红水溶液；

将1mL的2mg/mL的介孔铂钛负载中性红溶液和1.5mL浓度为10μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，震荡12h，离心洗涤后分散于1mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。

实施例6介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液的制备

将铂钛铝合金薄片置入浓度为0.5mol/L的NaOH溶液中，室温下放置60h，随后放入浓度为2mol/L的HNO₃溶液中，室温下放置3h，用超纯水清洗多次后，干燥得到介孔铂钛；

将1mL的3mg/mL介孔铂钛水溶液和1mL的3mg/mL中性红溶液混合，震荡12h后离心，重新分散在1mL的水中，得到介孔铂钛负载中性红水溶液；

将1mL的3mg/mL的介孔铂钛负载中性红溶液和2mL浓度为10μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，震荡12h，离心洗涤后分散于1mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到介孔铂钛负载中性红标记的甲胎蛋白检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。

实施例7甲胎蛋白的检测方法

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

（2）选择差分脉冲伏安法对甲胎蛋白抗原进行检测，选择在-0.8~-0.4V电压下进行扫描，记录电流变化；

（3）将待测样品溶液代替甲胎蛋白抗原标准溶液进行检测。

（4）该生物传感器对甲胎蛋白抗原检测线性范围为0.0001~10ng/mL，检测限0.01pg/mL。