一株过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶的重组高山被孢霉、其构建方法及应用

【技术领域】

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一株过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的高山被孢霉，还涉及其构建方法及用途。

【背景技术】

高山被孢霉(Mortierellaalpina)是一种脂质积累可以达到细胞干重50％的产油真菌，是脂质生物化学基础研究的重要模式生物。高山被孢霉已经被应用于工业化生产花生四烯酸(Arachidonicacid,AA,C20:4)，其生产的食用油脂已经通过美国食品药品监督管理局(FDA)的安全性评估。除了合成AA之外，高山被孢霉也具有一定的合成二十碳五烯酸(Eicosapentanoicacid,EPA,C20:5)的能力。EPA属于ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)，具有重要的生理功能，如：促进哺乳动物大脑发育以及神经组织形成和修复的能力，预防哮喘、癌症、抑郁、肥胖、免疫紊乱以及心血管疾病等。但是人体自身不能合成这些脂肪酸，需要从富含ω-3LC-PUFAs的食物(如深海鱼油)中摄取。由于大肆捕捞和环境污染破坏，深海鱼类提供的ω-3LC-PUFAs已无法满足日益增长的市场需求，所以利用微生物生产ω-3LCPUFAs已经成为当前的研究热点。

由AA合成EPA的反应是通过ω-3脱饱和酶催化完成的。不同物种来源的ω-3脱饱和酶对催化的底物具有明显的偏好性，其中偏好催化20碳PUFAs的ω-3脱饱和酶可以较高效的催化AA生成EPA，对于EPA的生产有十分重要的作用。2004年，Pereira等人发现来源于异枝水霉的ω-3脂肪酸脱饱和酶sdd17，对18碳的多不饱和脂肪酸没有催化活性，却能将20碳的AA催化为EPA，转化率为25.9％。同样的，来源于致病疫霉的ω-3脱饱和酶OPIN17也不能以18碳的多不饱和脂肪酸为底物，但是对AA的转化率达到了30.94％。

近年来，Xue等人从瓜果腐霉、大豆疫霉菌、栎树猝死病菌中分离出三种ω-3脱饱和酶—PaD17、PsD17、PrD17，这三种酶对18碳和20碳的ω-6多不饱和脂肪酸都具有催化能力，但偏好催化20碳的AA，转化率分别达到了56％、47％和36％。上述几种ω-3脱饱和酶可以直接、高效的催化AA生成EPA，且催化反应均可在常温下进行，因此对EPA的工业化生产具有十分重要的作用。其中PaD17是目前已知的对AA转化率最高的ω-3脱饱和酶。

申请人在前期研究中将优化后的PaD17转化入高山被孢霉，得到的高山被孢霉重组菌可以在28℃下生产EPA，且EPA含量达到总脂肪酸含量的18.7％，具有高于当时其他现有技术的产率。

然而，获得具有更优秀的EPA产率的产油真菌特别是高山被孢霉依然是本领域技术人员的期望。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一株能在常温环境下高产EPA的重组高山被孢霉工程菌株，借助根瘤土壤杆菌介导的方法、通过过表达其他来源的ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因得到一株重组高山被孢霉，还涉及将所述重组高山被孢霉工程菌株用于工业生产脂肪酸、特别是生产EPA。

本申请人在中国发明专利申请CN2015109025795中公开了三种常温偏好20C的ω-3脱饱和酶，其中涉及来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶，并公开了依据酿酒酵母特性将其优化得到oPpFADS17序列，通过化学法转入酿酒酵母INVSc1中并成功表达，验证了所得工程菌株对ARA具有良好的转化效率。

经过上述前期研究，申请人期望验证在比高山被孢霉中过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶能够提高高山被孢霉的EPA产量，并期望从中获得一株产量突出的工程菌株。

为了实现上述目的，本发明在现有研究的基础上，对来自寄生疫霉的ω-3脱饱和酶进行优化，得到经过优化的oPpFADS17，其与天然的来源于瓜果腐霉的PaD17具有相似的催化特性，且对20C底物的偏好性更强。所以，将oPpFADS17转化入高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，构建常温下EPA产量更高的高山被孢霉。

具体地，本发明提供一株过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的重组高山被孢霉(Mortierellaalpina)MA-oPpFADS17-4，该菌株于2016年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11820。

在本发明中，所述ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因是经过优化的来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶基因，其核酸序列如SEQNO.1(GenbankaccessionNo:KT372001)所示，其氨基酸序列如SEQNO.2所示。

在本发明中，所述高山被孢霉菌株是用含有ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的重组质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17转化根瘤土壤杆菌后，再以含转化质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17的根瘤土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。

根据一种优选的实施方式，所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是一株使高山被孢霉ATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因失活的高山被孢霉菌株。更优选地，所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是中国发明专利申请CN201310347934.8中公开的高山被孢霉MAU1，该菌株于2013年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.8414。该菌株也保存于江南大学的实验室，被命名为CCFM501。

为了获得上述重组高山被孢霉，本发明还提供所述菌株的构建方法，包括以下步骤：

a)根据天然的来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶序列(GenbankaccessionNo:XM_008906963)，根据高山被孢霉密码子使用偏好性，人工合成优化后的ω-3脱饱和酶基因oPpFADS17，如SEQNO.1(GenbankaccessionNo:KT372001)所示；

b)构建重组质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17；

c)用构建获得的重组质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17转化根瘤土壤杆菌；

d)用含重组质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17的根瘤土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；

e)筛选鉴定转化菌株，获得一株特别高产EPA的过表达ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的重组高山被孢霉菌株MA-oPpFADS17-4。

其中，步骤c)的根瘤土壤杆菌为根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1。

步骤d)的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是重组高山被孢霉MAU1(CGMCCNo.8414)，或按照江南大学的实验室的命名称为CCFM501。

其中，步骤e)中筛选鉴定转化菌株的方法包括以下步骤：

1)用3mL生理盐水冲刷GY表面，收集液体于一个无菌1.5mL离心管中。

过25μm滤膜；

2)用血球计数器计数，调整为三种孢子浓度梯度10⁸个每100μL、10⁶个每100μL、10⁴个每100μL，各取200μL涂布于含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟的GY-CS平板上，25℃避光培养2-3d；

3)随时用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝于含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟的SC-CS平板上，25℃培养2-3d；

4)观察高山被孢霉在平板上的生长情况，挑出在SC-CS平板上生长的菌丝接种于GY斜面上；

5)将上述步骤4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次；

6)将稳定遗传的菌株鉴定为过表达ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY斜面上；

7)提取含有ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，设计一对与启动子和终止子特异性结合的引物进行PCR验证：

P1(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT

P2(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；

8)所述重组菌株保藏于GY斜面上。

本发明还提供上述重组高山被孢霉菌株或根据上述方法得到的重组高山被孢霉在生产脂肪酸、特别是EPA中的用途。

在本发明中，重组质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17的构建可参考中国专利申请CN201310524221.4中公开的内容。根据该申请的记载，首先用PCR的方法从pD4质粒上获得HPH表达单元，将HPH表达单元用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，插入到EcoRI和XbaI酶切过的pET28a(+)的多克隆位点(MCS)中，得到质粒pET28a-HPHs。利用PCR从高山被孢霉cDNA中获得ura5(乳清酸磷酸核糖转移酶；OPRTase)基因，并利用限制性内切酶BspHI和BamHI酶切ura5基因，将酶切过的ura5基因插入到NcoI和BamHI酶切过的质粒pET28a-HPHs中，以替换hpt基因，构建质粒pET28a-ura5s。用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切质粒pET28a-ura5s得到ura5s表达单元。将ura5s表达单元替换质粒pBIG2RHPH2中的HPH表达单元，进一步构建质粒转化质粒pBIG2-ura5s。更进一步地在质粒pBIG2-ura5s和质粒pET28a-HPHs的基础上，构建高山被孢霉基因操作通用载体。用PCR的方法从高山被孢霉基因组中获得非编码的内含子DNA片段IT。用限制性内切酶NcoI和BamHI分别对IT基因片段和质粒pET28a-HPHs进行酶切，并通过连接反应将IT片段取代质粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到质粒pET28a-ITs。用限制性内切酶SpeI和XbaI双酶切质粒pET28a-ITs得到ITs表达单元。将ITs表达单元插入到XbaI酶切过的质粒pBIG2-ura5s中，得到高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs。然后通过基因工程技术将ω-3脱饱和酶基因插入高山被孢霉通用载体pBIG2-ura5s-ITs中，构建二元表达载体pBIG2-ura5s-oPpFADS17。

在本发明中，所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是已公开的重组高山被孢霉MAU1(CCFM501)，其保藏编号为CGMCCNo.8414，该菌株已在中国专利申请CN201310347934.8中公开。

根据CN201310347934.8说明书记载，重组高山被孢霉CCFM501是通过失活高山被孢霉ATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。其中，ura5基因的失活是通过缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而实现的，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为：首先获得ura5敲除基因片段，并进一步构建敲除质粒pBIG4KOura5，然后用重组质粒pBIG4KOura5转化根癌农杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG4KOura5的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型高山被孢霉MAU1(CCFM501)菌株。

在本发明中，应用于转化高山被孢霉的根瘤土壤杆菌为：根瘤土壤杆菌AgrobacteriumtumefaciensC58C1(TsujiG,FujiiS,FujiharaN,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationforrandominsertionalmutagenesisinColletotrichumlagenarium[J].JournalofGeneralPlantPathology,2003,69(4):230-239.)，为本领域技术人员可以公开获得的菌株，在某些文献中，它也可能被称为根癌农杆菌。

本发明所涉及的Broth培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L磷酸二氢钾，0.25g/L七水硫酸镁，10g/L硝酸钾，余量为水，pH6.0。

本发明所涉及的MM固体培养基，其组成为：1.74g/L磷酸氢二钾，1.37g/L磷酸二氢钾，0.146g/L氯化钠，0.49g/L七水硫酸镁，0.078g/L氯化钙，0.0025g/L七水硫酸亚铁，0.53g/L硫酸铵，1.8g/L葡萄糖，0.5％甘油，20g/L琼脂，余量为水，pH6.8。

本发明所涉及的IM培养基是在MM培养基的基础上添加了200μM的乙酰丁香酮(AS)构成的。

本发明所涉及的SC-CS培养基是添加了浓度为100μg/mL壮观霉素奇霉素(Spectinomycin)和浓度为100μg/mL头孢噻肟抗生素(CefotaximeSodium)的SC固体培养基。SC固体培养基组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母氮源无氨基酸和硫酸铵，1.7g/L硫酸铵，60mg/L异亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L苏氨酸，40mg/L赖氨酸，30mg/L酪氨酸，20mg/L腺嘌呤，20mg/L精氨酸，20mg/L组氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L琼脂，余量为水，pH6.8。

本发明所涉及的GY-CS培养基是添加了浓度为100μg/mL壮观霉素奇霉素和浓度为100μg/mL头孢噻肟抗生素的GY固体培养基。GY固体培养基组成为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸钾，1g/L磷酸二氢钠，3g/L七水硫酸镁，20g/L琼脂，余量为水，pH6.8。

本发明在现有的高山被孢霉转化系统的基础上，采用根瘤土壤杆菌介导的基因转化方法，构建了在高山被孢霉中过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶基因oPpFADS17的工程菌株。获得的重组高山被孢霉经过多次传代，经鉴定oPpFADS17片段仍稳定存在基因组中，且菌株的生长特性与原养型菌株无明显差别，但重组菌的EPA产量达到总脂肪酸的31.5％，对AA的转化率高达77.6％，而原始菌株几乎检测不到EPA，较其他异源表达ω-3脱饱和酶基因的重组高山被孢霉、甚至在先申请的过表达来源于瓜果腐霉的ω-3脱饱和酶基因的高山被孢霉MA-oPaFADS17-3菌株在EPA产量上均得到了显著提高，进一步推动了产油真菌产业进步和EPA的工业化生产。

本发明的重组高山被孢霉菌株MA-oPpFADS17-4于2016年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11820。

【附图说明】

图1为二元表达载体pBIG2-ura5s-oPpFADS17的构建示意图；

图2为过表达oPpFADS17基因的高山被孢霉重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为marker；1：代表阴性对照；2-6：代表1-5号转化子；

图3为高山被孢霉野生型菌株与5株基因工程菌株ω-3脱饱和酶基因(oPpFADS17)RT-qPCR的结果分析图。其中，M.alpina为高山被孢霉野生型对照；1-5代表重组菌株MA-oPpFADS17-1，MA-oPpFADS17-2，MA-oPpFADS17-3，MA-oPpFADS17-4，MA-oPpFADS17-5。

【具体实施方式】

实施例1：酶切反应

根据高山被孢霉的密码子使用偏好性，对来源于天然寄生疫霉的ω-3脱饱和酶基因的核酸序列(GenbankaccessionNo:XM_008906963)进行密码子优化，并且人工合成了优化后的基因序列oPpFADS17，如SEQNo.1和2所示。然后与PUC57载体连接得PUC57-oPpFADS17。

在37℃条件下，先用限制性内切酶HindIII过夜酶切质粒PUC57-oPpFADS17及载体pBIG2-ura5s-ITs片段，HindIII酶切体系(100μL)为：2μLHindIII-HF，30μL质粒或载体，10μLCutsmartBuffer，58μL去离子水，37℃孵育12h。

其中，载体pBIG2-ura5s-Its是根据中国专利申请CN201310524221.4直接获得的。

通过PCR的方法从pD4质粒上获得HPH表达单元，将HPH表达单元用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，插入到EcoRI和XbaI酶切过的pET28a(+)的多克隆位点(MCS)中，得到质粒pET28a-HPHs。利用PCR从高山被孢霉cDNA中获得ura5(乳清酸磷酸核糖转移酶；OPRTase)基因，并利用限制性内切酶BspHI和BamHI酶切ura5基因，将酶切过的ura5基因插入到NcoI和BamHI酶切过的质粒pET28a-HPHs中，以替换hpt基因，构建质粒pET28a-ura5s。用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切质粒pET28a-ura5s得到ura5s表达单元。将ura5s表达单元替换质粒pBIG2RHPH2中的HPH表达单元，进一步构建质粒转化质粒pBIG2-ura5s。更进一步地在质粒pBIG2-ura5s和质粒pET28a-HPHs的基础上，构建高山被孢霉基因操作通用载体。用PCR的方法从高山被孢霉基因组中获得非编码的内含子DNA片段IT。用限制性内切酶NcoI和BamHI分别对IT基因片段和质粒pET28a-HPHs进行酶切，并通过连接反应将IT片段取代质粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到质粒pET28a-ITs。用限制性内切酶SpeI和XbaI双酶切质粒pET28a-ITs得到ITs表达单元。将ITs表达单元插入到XbaI酶切过的质粒pBIG2-ura5s中得到高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs。

回收酶切产物，进一步使用限制性内切酶XhoI单酶切，切胶纯化回收目的基因(ω-3脱饱和酶基因片段oPpFADS17)和载体pBIG2-ura5s-ITs片段。酶切体系为(100μL)：2μLXhoI，30μL质粒或载体pBIG2-ura5s-ITs片段，10μLcutsmartBuffer，58μL去离子水，37℃水浴酶切12h。

其中，内切酶缓冲液Cutsmartbuffer：50mM乙酸，20mMTris-乙酸，10M乙酸镁，100μg/mL牛血清白蛋白，pH7.9。

实施例2：连接反应

用T4连接酶将酶切纯化后的ω-3脱饱和酶基因片段oPpFADS17与载体pBIG2-ura5s-ITs连接，4℃连接12h，得到重组表达载体pBIG2-ura5s-oPpFADS17。连接体系为(10μL)：2μL目的基因酶切后片段，3μL载体酶切后片段，1μL连接酶buffer，1μLT4连接酶，3μL无菌水，4℃连接12h。

连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化方法如下：

⑴无菌状态下取100μL感受态细胞，加入1-2μL连接产物，吹吸混匀。

⑵将混匀的感受态细胞移入预冷过的电转杯中，避免产生气泡。

⑶将电转杯放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，电转。电压条件为1.8kv。

⑷加入1mLSOC复苏培养基于电转后的感受态细胞中，混匀转移至1.5mL离心管中，37℃，150rpm孵育1h。

⑸取200μL涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板。倒置37℃培养过夜。

挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得二元表达载体pBIG2-ura5s-oPpFADS17。

其中，SOC复苏培养基的组成为：20g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g/L氯化钠，2.5mM氯化钾，10mM氯化镁，20mM葡萄糖；LB固体培养基的组成是：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L琼脂。

二元表达载体pBIG2-ura5s-oPpFADS17电击转化根瘤土壤杆菌的方法参照转化大肠杆菌TOP10的方法。得到含有质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17的根瘤土壤杆菌C58C1。

实施例3：根瘤土壤杆菌介导转化高山被孢霉

在已有的国内外文献有关根瘤农杆菌转化方法报道的基础上，做了适当的优化调整，具体如下：

⑴取保存于-80℃的含有质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17的根瘤农杆菌C58C1于含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线。28℃倒置避光培养48h。

⑵挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体YEP培养基中28℃，200rpm避光培养24-48h。

⑶4000×g离心5min收集菌体，倒掉上清。加5mLIM培养基重悬菌体，4000×g离心5min，倒掉上清。加2mLIM培养基重悬菌体。

⑷用IM培养基调整菌浓度至OD₆₀₀为0.3。置于28℃，200rpm摇床避光培养至OD₆₀₀到1.0。

⑸用500μL灭菌的生理盐水冲刷在GY-U斜面培养1个月以上的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷性菌株CCFM501(即CN201310347934.8公开的尿嘧啶营养缺陷型菌株MAU1)，收集孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到10⁷个每100μL。

⑹取100μL根瘤土壤杆菌与100μL孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸的IM固体培养基上。23℃避光培养36-48h。

⑺将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟抗生素的SC平板(SC-CS)上。18℃避光培养12h，随后转移至25℃培养。

⑻持续观察菌落在SC-CS平板上的生长情况，若长出明显菌落，及时用尖头镊子将菌落外沿挖出，接种于SC-CS平板上，继续正置于25℃培养箱中培养。

⑼待SC-CS平板上的转化子长出后，挑菌丝转接于SC-CS平板，重复筛选3次，排除阴性转化子。

⑽将筛选3次后生长的菌落接种至GY平板，28℃培养至产生大量孢子，保藏在4℃。

其中，MM培养基成分是：1.74g/L磷酸氢二钾，1.37g/L磷酸二氢钾，0.146g/L氯化钠，0.49g/L七水硫酸镁，0.078g/L氯化钙，0.0025g/L七水硫酸亚铁，0.53g/L硫酸铵，1.8g/L葡萄糖，0.5％甘油。

IM培养基是在MM培养基的基础上添加了200μM的乙酰丁香酮(AS)构成的。

SC培养基的组分是：5g/L酵母氮源(无氨基酸与硫酸铵)，1.7g/L硫酸铵，20g/L葡萄糖，20mg/L腺嘌呤，30mg/L络氨酸，1mg/L甲硫氨酸，2mg/L组氨酸，4mg/L赖氨酸，4mg/L色氨酸，5mg/L苏氨酸，6mg/L异亮氨酸，6mg/L亮氨酸，6mg/L苯丙氨酸，2mg/L精氨酸为组分构成的。

GY固体培养基是以组分20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸钾，1g/L磷酸二氢钠，3g/L七水硫酸镁，20g/L琼脂构成的。

YEP培养基的组分是：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化钠，余量为水。涉及到固体培养基时添加20g/L琼脂。

实施例4：高山被孢霉过表达oPpFADS17工程菌株筛选和鉴定

1)用3mL生理盐水冲刷GY表面，收集液体于一个无菌1.5mL离心管中。过25μm滤膜；

2)用血球计数器计数，调整为三种孢子浓度梯度10⁸个每100μL、10⁶个每100μL、10⁴个每100μL，分别取200μL涂布于含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的GY-CS平板上，25℃避光培养2-3d；

3)随时用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝SC-CS平板上，25℃培养2-3d；

4)观察高山被孢霉在平板上的生长情况，挑出在SC-CS平板上生长的菌丝接种于GY斜面上；

5)将上述步骤4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次；

6)将稳定遗传的菌株鉴定为异源表达oPpFADS17基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY斜面上；

7)提取鉴定正确的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，用一对与启动子和终止子特异性结合的引物进行PCR验证：

P1(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT

P2(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；

重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳分析结果见图2，M为marker；泳道1为阴性对照；泳道2-6为1-5号MA-oPpFADS17重组菌株。结果可见，5株阳性转化子均可扩增出两条大小分别为818bp和1086bp的产物条带，电泳结果说明1-5号转化子均为二元表达载体成功整合到高山被孢霉基因组中的阳性转化子。

8)所得重组菌株分别保藏于GY斜面上。

实施例5：阳性转化子MA-oPpFADS17总RNA提取

1.取出适量在液氮中冻存的菌体，于预冷的无菌无酶研钵中加入液氮充分研磨。

2.加入1mLTRIzol(购自Invitrogen公司,Carlsbad,CA,USA)继续研磨至粉末，室温放置至溶解。

3.用无酶枪头吸取1mL上述步骤中液体于无酶离心管中，加入200μL三氯甲烷混匀。

4.13200×g，4℃，离心15min吸上清于新的无酶离心管中。

5.加入200μL三氯甲烷混匀，13200×g，4℃，离心15min吸上清于新的无酶离心管中。

6.加入等体积的异丙醇，静置15min，13200×g，4℃，离心15min。弃上清，室温晾干。

7.加入1mL的70vol％乙醇，13200×g，4℃，离心15min。用无酶枪头吸去乙醇，室温放置干燥。

8.加入50μL无酶水溶解RNA，-80℃储存。

9.浓度测定：取1μLRNA用Nanodrop2000测定浓度。

10.变性胶电泳检测RNA完整性：取1μgRNA在1.2vol％的变性胶中电泳，观察RNA完整性。

11.取1μg总RNA为模板，根据PrimeScriptRTreagentkit(TaKaRa,Otsu,Shiga,Japan)试剂盒说明进行操作，获得重组菌株的cDNA。

实施例6：阳性转化子MA-oPpFADS17转录水平的RT-qPCR检测

根据oPpFADS17序列和内参18SrRNA序列设计引物：

q-oPpFADS17F：TCTTCCCCACCCTCACCG

q-oPpFADS17R：CAAGCCACGAGCGTAGTTCA

18SRTF：CGTACTACCGATTGAATGGCTTAG

18SRTR：CCTACGGAAACCTTGTTACGACT

取0.5-1μgcDNA为模板，使用Bio-RadCFXConnectTMsystem按照iTaqUniversalSYBRGreenSupermix的说明进行RT-qPCR反应。反应体系为：8μL无酶水，10μLiTaqUniversalSYBRGreenSupermix，0.5μLq-oPpFADS17F，0.5μLq-oPpFADS17R，1μL模板，总体积20μL。PCR循环设置为50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃30s，30个循环。以高山被孢霉的18SrRNA作为内参基因，各转化子取三个平行。结果如图3所示，高山被孢霉野生型对照ω-3脱饱和基因(oPpFADS17)无转录，而5株基因工程菌ω-3脱饱和基因(oPpFADS17)的转录量有显著提高，-ΔΔCt值达到8左右。这说明使用农杆菌介导的方法能够使外源ω-3脱饱和酶基因(oPpFADS17)在高山被孢霉中转录和表达。

实施例7：阳性转化子脂肪酸提取

⑴将高山被孢霉原养型菌株与实施例3筛选获得的高山被孢霉过表达oPpFADS17工程菌株接种于Broth培养基中，28℃，200rpm摇床培养7d。

⑵收集菌体，真空冷冻干燥至恒重，称量菌体重量，计算生物量。

⑶将菌体研磨成粉末，称取50mg，加入2mL4M盐酸。

⑷80℃水浴1h，-80℃放置15min。重复一次。80℃水浴1h。

⑸冷却至室温，加入1mL甲醇，混匀。

⑹加入1mL氯仿，震荡10min。3000×g离心3min。收集氯仿。

⑺重复⑹两次。

⑻合并氯仿(3mL)，加入1mL饱和氯化钠，混匀，3000×g离心3min。收集氯仿层于新瓶。剩余液体继续加入1mL氯仿，3000×g离心3min。合并氯仿(4mL)。

⑼氮吹干燥，加入1mL乙醚，转移至洁净的已经称重的瓶中。氮吹干燥。

实施例8：阳性转化子脂肪酸检测

脂肪酸组成及含量的测定方法：①向上述粗脂中分别加入100μL2.02mg/mL内标C15:0和1mL10wt％的盐酸甲醇，60℃水浴3h，每隔30min振荡1min；②冷却至室温后加入1mL正己烷和1mL饱和氯化钠溶液，震荡混匀，3000×g离心3min，吸出正己烷层，再加入1mL正己烷，震荡混匀，3000×g离心3min，吸出并合并正己烷；③37℃氮气吹干后，加入1mL正己烷，混匀，转入气相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液；④脂肪酸甲酯分析采用GC-2010(ShimadzuCo.,Japan)，色谱柱为DB-Waxetr(30m×0.32mm,0.22μm)。氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样1μL，分流比10:1，载气为氮气。程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min。通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品(37种脂肪酸甲酯混标，Supelco，USA)和加入内标C15:0的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分，其中总脂肪酸含量用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。

表1是高山被孢霉野生型(原养型)菌株与五株基因工程菌株脂肪酸产量的比较，表2是高山被孢霉野生型菌株与五株基因工程菌株脂肪酸组成的比较。由表1和表2的结果可以看出五株基因工程菌株与野生型菌株生物量没有显著差异，而脂肪酸组成却发生了明显变化。其中，5株重组菌株中AA(C20:4)的产量较野生型有不同程度的减少，且有大量EPA(C20:5)产生，且AA的减产与EPA的增产有明显的规律，而其余各种脂肪酸(C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3)的产量没有显著变化，这说明5株重组菌株都能不同程度地将AA催化为EPA。其中，MA-oPpFADS17-4表现出特别优秀的EPA产量，其EPA的产量达到1197.3mg/L，占总脂肪酸(TFA)含量的31.5％，同时其AA产量仅为326.8mg/L，表示能够将大部分AA催化转化为EPA，对AA的转化率达77.6％(转化率＝EPA/(AA+EPA)×100％)，此外其总脂肪酸绝对值也有一定幅度提高。

此外，其余四株重组菌株(MA-oPpFADS17-1、2、3和5)也表现出不同程度的EPA产量的提高，以明显区别于野生型菌株。这表明异源表达的ω-3脱饱和酶基因oPpFADS17在高山被孢霉中能够成功表达，通过本发明的构建方法得到的重组菌能够将AA转化为EPA并具有相当转化率。其中，以MA-oPpFADS17-4效果最为明显，较其他MA-oPpFADS17转化子菌株有意想不到的提高，也显著高于其他现有技术的记载。

表1高山被孢霉野生型菌株与五株基因工程菌株脂肪酸产量比较

表2高山被孢霉野生型菌株与五株基因工程菌株脂肪组成比较

结果表明，通过本发明的方法获得的过表达ω-3脱饱和酶基因(oPpFADS17)的重组高山被孢霉具有多次传代的遗传稳定性，且通过常温培养获得的产物中，其脂肪酸分析结果与野生型菌株无明显差别，所得菌株中EPA产量均有提高，其中菌株MA-oPpFADS17-4中EPA含量达到脂肪酸总量的31.5％，相比于野生型菌株EPA产量显著提高，优于经过相同方法得到的其他重组菌株，也显著高于其他已知的过表达ω-3脱饱和酶基因的重组高山被孢霉通过常温培养工艺得到的EPA产量。用此方法构建的基因工程菌株及构建方法为后续工业化奠定了理论及应用基础。

虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。