乙型脑炎减毒活疫苗株SA14-14-2在人二倍体细胞2BS上的适应株及其疫苗

技术领域

本发明属于病毒疫苗领域，特别是以生物学技术选育高度减毒而且免疫原性 良好的乙型脑炎活疫苗株。将乙型脑炎减毒活疫苗株SA14-14-2通过单层、混悬 的方式接种2BS细胞，传代适应后蚀斑法测定病毒滴度，确定病毒最佳收获时 间和接种量。选取病毒滴度较高的三代建立原始毒种、主代毒种和工作毒种库， 对毒种库病毒按照《中国药典》三部中进行无菌检查、支原体检查、免疫原性检 查，小鼠脑内致病力试验，皮下感染入脑试验、乳鼠传代返祖试验、免疫保护性 试验等项目的全面检定。另外还对其进行全基因序列测定并与已上市的原代地鼠 肾细胞(PHK)传代的疫苗株SA14-14-2疫苗株的序列进行比对。

背景技术

流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis，乙脑)是亚洲最常见的一种病毒性 脑炎，是一种经蚊虫传播的人兽共患病。乙脑病毒属黄病毒科黄病毒属，为单股 正链RNA有包膜病毒，全长11kb左右。乙脑病毒有5个基因型，目前我国的乙 脑流行病毒为基因Ⅲ型和基因Ⅰ型。据估计，乙脑病毒每年至少造成50,000例 临床病例，其中多数为10岁以下儿童，导致约10,000人死亡，另有约15,000 例病例留有长期的神经-精神性后遗症。乙脑几乎在所有的亚洲国家都有发生， 无论其位于温带、亚热带或热带。近几十年来，乙脑在一些以前无地方性流行的 地区出现了爆发。全球有近30亿人口生活在乙脑流行区，这些流行区每年新生 儿约7千万。乙脑病毒感染通过蚊子传播，而蚊子从有病毒血症的动物、人获得 感染。目前还没有针对乙脑的特异性抗病毒治疗方法，疫苗接种仍是唯一最重要 的控制措施。

目前，大规模使用的乙脑疫苗有三种：(1)Nakayama株或北京株纯化鼠 脑灭活疫苗，主要日本等几个亚洲国家生产；(2)Vero细胞培养的北京P3株乙 脑灭活疫苗；(3)原代地鼠肾细胞培养的SA14-14-2株减毒活疫苗。纯化鼠脑乙 脑疫苗的缺点有：诱导保护性免疫力的持续时间过短，需多剂次接种；对多数国 家来说，每剂疫苗的价格相对较高。细胞培养的疫苗上世纪90年代前曾经在中 国生产并广泛使用。1989年，SA14-14-2株减毒活疫苗上市后，因其安全、有效、 免疫接种次数少、保护时间长的优点，在国内大面积接种，市场占有率已达到 90％以上，并出口韩国、印度、泰国、尼泊尔等十多个国家。

人二倍体细胞是指正常人体组织在体外培养的细胞，其来源于正常人胚胎， 在传代过程中保持二倍体核型，无外源因子污染，无致瘤性，没有传代细胞和原 代动物细胞的缺点，在培养病毒和制备病毒类疫苗方面价值很大，是WHO倡导 用于人用疫苗生产的理想细胞。60年代初人二倍体细胞问世，70年代用于多种 疫苗生产。近来年成为甲肝疫苗、水痘疫苗、风疹减毒活疫苗、脊髓灰质炎疫苗、 成纤维细胞干扰素等产品的生产用细胞。WHO认为疫苗的生产应首先考虑采用 人源性二倍体细胞，因其与其他动物传代细胞相比，在理论上不存在致肿瘤的危 险性，其生产疫苗的安全性及有效性远优于其他细胞基质制备的疫苗。

乙型脑炎减毒活疫苗是我国自主知识产权疫苗，自1989年经卫生部批准生 产上市以来，迄今为止已经使用超过6亿剂次，显著降低了流行区乙脑的发病 率和病死率，为儿童的健康提供了有效的免疫保护作用。2013年10月9日，乙 型脑炎减毒活疫苗通过世界卫生组织疫苗预认证，成为中国通过世界卫生组织预 认证的首个疫苗产品。但是，Vero细胞和原代地鼠肾细胞都是动物源性细胞， Vero细胞的优点在于其质量和外源因子可以高度控制，繁殖速度快，持续时间 长，易于标化，但疫苗中残余的Vero细胞DNA对接种者潜在的致癌性风险，因 此在疫苗制备过程中必须严格控制残余含量。而原代地鼠肾细胞来源于地鼠，地 鼠种群不仅难于控制，对生产工艺要求比较高，而且容易受到细菌、病毒、寄生 虫等外源物质污染，目前中国成都生物制品研究所有限公司生产的乙型脑炎减 毒活疫苗采用SPF地鼠肾细胞作为疫苗生产细胞基质，能较好解决上述人们担 心的外源因子污染的问题，但是增加了疫苗成本。因此，现在许多疫苗企业也在 积极应用人二倍体细胞研究开发人用疫苗。本申请拟采用人二倍体细胞研发乙型 脑炎减毒活疫苗，进一步提高疫苗质量。

发明内容

人二倍体细胞2BS细胞株是由1973年中国一个流产的3月龄女性胎儿肺组 织建立的一株人胚肺二倍体细胞，有限生命为63-65代，具有来源清晰、传代历 史清楚、无外源因子污染的特点，也是我国目前批准可用于人用疫苗生产的两个 人二倍体细胞株之一。人二倍体细胞2BS细胞株已经用于人风疹疫苗、水痘疫 苗等疫苗的生产，经过几十年和大量人体接种使用，证明了该细胞是安全、良好 的细胞基质。

目前国内市场上使用的乙脑疫苗主要是原代地鼠肾(PHK)细胞疫苗和Vero 细胞疫苗。PHK细胞容易受细菌、病毒、寄生虫等外源物质污染，比较难以控 制，Vero细胞对接种人群有潜在的致癌性。为了进一步提高乙脑疫苗的质量， 能够出口到更多国际市场，让更多受到乙脑病毒威胁的人群特别是儿童能健康的 成长，我们将流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2适应到人二倍体细胞2BS，使病 毒能在人二倍体细胞上很好的适应和增值，并研究该疫苗生产的稳定工艺，以便 提高了乙脑疫苗的安全性和有效性，为全世界的人民特别是受到乙型脑炎的危害 人群的健康服务。

本发明的目的在于提供能够达到WHO标准的高度减毒、免疫原性好、遗传 稳定性高的乙型脑炎病毒株及其培育方法，提供疫苗生产用毒种，制备乙型脑炎 减毒人二倍体细胞活疫苗。

本发明的目的是这样实现的：乙型脑炎减毒活疫苗株在人二倍体细胞2BS 上的适应株的选育方法，其特征在于：选用我国流行性乙型脑炎减毒活疫苗 SA14-14-2毒株作为亲本株，培育步骤至少包含：

(1)乙脑病毒SA14-14-2在人二倍体细胞2BS上的适应性传代；

(2)对收获的每一代病毒株滴定；

(3)筛选出滴度最高的病毒株建立病毒的三级毒种库，三级毒种库分别为 原始毒种库：病毒株为SA14-14-2-2BSP34，病毒滴度是7.00lgPFU/mL；主代毒 种库：病毒株为SA14-14-2-2BSP36，病毒滴度是7.25lgPFU/mL；工作毒种库： 病毒株为SA14-14-2-2BSP38，病毒滴度是7.15lgPFU/mL；

(4)对三级毒种库进行全基因组序列测定，获得全基因组序列； SA14-14-2-2BSP34株、SA14-14-2-2BSP36株、SA14-14-2-2BSP38株全基因序 列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3所示。

(5)对三级毒种库进行安全性检定和免疫检定。

乙型脑炎减毒活疫苗株在人二倍体细胞2BS上的适应株的选育方法，还可 以这样实现：通过单层、混悬的方式接种2BS细胞，传代适应后蚀斑法测定病 毒滴度，确定病毒最佳收获时间和接种量。

具体接种传代方法是：

SA14-14-2-PHKC5按0.2MOI接种于2BS细胞悬液中，获得P1；

培养5天后收获病毒，带毒细胞连续传代至第5代，获得P2-P5；

继续培养5天，将带毒细胞悬液和正常细胞悬液等量混合连续传代至第10 代，获得P6-P10；

第10代病毒按MOI0.1混悬于2BS细胞悬液中，获得P11；

再培养4天，将带毒细胞悬液和正常细胞悬液等量混合传代至第50代，获 得P12-P50；

筛选出滴度最高的P34、P36、P38病毒分别建立原始毒种库、主代毒种库 和工作毒种库。

所述的乙型脑炎减毒活疫苗株在人二倍体细胞2BS上的适应株的选育方法 获得的三级毒种库，包括原始毒种库：病毒株SA14-14-2-2BSP34全基因序列如 SEQIDNO：1；主代毒种库：病毒株SA14-14-2-2BSP36，全基因序列如SEQID NO：2；工作毒种库：病毒株SA14-14-2-2BSP38，全基因序列如SEQIDNO： 3所示。

本发明所述的乙型脑炎减毒活疫苗株在人二倍体细胞2BS上的适应株的选 育方法获得的三级毒种库用于制备出的乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2-2BS。

本发明通过将流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2(JEVSA14-14-2-PHKC)接种 于人二倍体细胞上，通过不同的方式连续传代，使病毒能够在细胞上很好的适应 和稳定的增殖，获得较高滴度的病毒。按照《中国药典》三部(2010版)，对 病毒进行有效性和安全性检查，符合规定的乙型脑炎减毒活疫苗的标准。同时， 研究了已适应于人二倍体细胞的乙脑病毒的生物学特性，包括免疫原性、免疫保 护力和弱毒力稳定性等，最终获得安全有效质量可控的人二倍体细胞乙型脑炎减 毒活疫苗。

本发明的优点和显著效益：人二倍体细胞为正常核型细胞，在传代过程中保 持二倍体核型，无外源因子污染，无致癌性，没有传代细胞和原代动物细胞的缺 点，具有的高免疫原性和良好的耐受性，是WHO倡导的用于人用疫苗生产的理 想细胞，目前已经成功应用于多种疫苗的生产，如甲肝疫苗、水痘、脊髓灰质炎 疫苗等。中国作为乙型脑炎的流行区，乙脑疫苗的研发走在前列，虽然乙脑减毒 活疫苗的安全性和有效性已经得以证实，但是原代地鼠肾细胞疫苗存在动物容易 受细菌、病毒、寄生虫等外源物质污染，难于控制。虽然中国采用SPF地鼠肾 细胞作为乙型脑炎减毒活疫苗生产用细胞基质，且2013年9月WHO已宣布中 国成都所生产的乙型脑炎减毒活疫苗符合WHO要求，进入了国际采购目录，可 以为世界上尤其是受到乙脑严重威胁的国家儿童健康服务，但是发达国家对我国 采用地鼠肾细胞生产乙型脑炎减毒活疫苗仍心存疑虑，担心生产用细胞被目前尚 未知晓的外源因子污染。所以，本研究将JEVSA14-14-2–PHKC适应到2BS 细胞中即可解决这些有人担心的疫苗安全性问题，既无异种DNA及异种蛋白残 留的隐患,又可以避免其他动物源性病毒和有害微生物对人类的影响。因此,安 全性优于非人源性原代及传代细胞制备的疫苗，促进了工艺改革，有望弥补我国 在人二倍体细胞乙脑疫苗方面的空白，使中国乙型脑炎减毒活疫苗可以服务于世 界上更多的人群健康。

附图说明

图1是SA14-14-2-2BS病毒株筛选流程图；

图2是SA14-14-2-2BS株基因组结构示意图；

图中标明数字由上到下分别表示：

基因组全长(10976)；

一个长开放阅读框核苷酸(96～10394)；

结构区域和非结构区域分别编码的氨基酸数目(127，167，500，415，164， 131，619，267，137，905)；

在其5’端有3个结构蛋白，即衣壳蛋白C、前膜蛋白prM和包膜蛋白E，3’ 端有7个非结构蛋白，即NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。

图3是在显微镜下观察第10代SA14-14-2在2BS细胞上的病变情况；

图中显示SA14-14-2病毒在2BS细胞上适应到P10，4天时的病变形态(A) 和正常2BS细胞对照(B)；

图4是不同MOI和培养时间下P10病毒在2BS细胞上的滴度曲线。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限 制本发明的保护范围。

一、JEV(乙脑减毒疫苗株SA14-14-2)在2BS细胞上的适应传代

1.细胞和毒种来源

本工作中使用的细胞为2BS细胞(27～37代)，为中国食品药品检定研究院 细胞保藏中心提供。细胞培养液为含10％胎牛血清的Eagle’sMEM。乙脑减毒疫 苗株SA14-14-2病毒为本室保存的乙脑病毒(JEV)SA14-14-2-PHKC5。

2.SA14-14-2在2BS细胞上的适应传代

(1)用0.25％胰蛋白酶消化已形成单层的2BS细胞，并以Eagle’sMEM-10％ 胎牛血清培养液重悬细胞，按0.2MOI接种量接种病毒于混悬细胞中，将病毒和 细胞充分混合均匀，37℃孵箱中培养，每天吸取0.5ml病毒液测其滴度。5天后， 收获培养上清为乙脑病毒2BS细胞适应株——SA14-14-2-2BS第1代，记作P1， 冻存于-70℃冰箱备用。将带毒细胞继续原瓶传代，每5天传代一次，这样将病 毒连续传代5次，收获SA14-14-2-2BSP5，每一代收获的病毒液均冻存于-70℃ 冰箱。

(2)第5代病毒液收获后，带毒细胞在传代时，与未感染病毒的新鲜2BS 细胞按1:1混合传代，置于37℃孵箱中培养，5天后收获乙脑病毒在2BS细胞上 适应株第六代，带毒细胞与未感染病毒的新鲜2BS细胞悬液等量混合传代，每5 天传代一次，将病毒液传至第10代。传代过程中，每天吸取0.5ml病毒液测其 滴度，每一代收获的病毒液均冻存于-70℃冰箱。

在显微镜下观察第10代SA14-14-2在2BS细胞上的病变情况见图1。图1 显示SA14-14-2病毒在2BS细胞上适应到P10，4天时的病变形态(A)和正常 2BS细胞对照(B)。

(3)用噬斑法对每一代收获的病毒进行滴定：

BHK-21细胞接种于6孔细胞培养板，间隔48h待细胞长成单层，将待测病 毒株10倍系列稀释，从10^-1～10^-5，取稀释后的病毒0.2mL接种到6孔板细胞中， 每个稀释度做一个副孔，37℃吸附60min，加终浓度为1％甲基纤维素营养覆盖 物，37℃孵箱中培养5天后吸去覆盖物，结晶紫染色30min，自来水冲洗计数空 斑数，计算空斑减少率。

(4)P1～P10收获的病毒滴度测定。

计算方法为两孔噬斑数的平均数×5(因每孔接种0.2mL，×5后得出每mL 的对数)，即病毒滴度＝(该稀释度的对数值)+(平均斑数×5的对数值)lgPFU/mL。

P1～P10病毒滴度见下表1。

表1收获的前10代病毒的滴度

(5)选择第10代适应毒株(SA14-14-2-2BSP10)按0.1、0.01、0.001、0.0001 的MOI病毒量接种于2BS细胞悬液进行病毒培养，分别于1d、2d、3d、4d、5d、 6d取病毒上清，用噬斑法检测病毒滴度。不同MOI、不用培养时间下病毒滴度 见下表2。

表2不同MOI和培养时间下P10病毒在2BS细胞上的滴度

参见图2不同MOI和培养时间下P10病毒在2BS细胞上的滴度曲线。

(6)将长成单层的2BS细胞用0.25％胰酶消化分散，取收获的乙脑病毒 SA14-14-2-2BS第10代按0.1MOI病毒量加入至2BS细胞中，37℃吸附60分钟， 置于37℃孵箱中培养，4天后将带毒细胞悬液与健康细胞悬液等量混合后传代， 37℃培养；4天后收获病毒上清，标记为P11，继续再将带毒细胞悬液和健康细 胞悬液等量混合传代，37℃培养4天后收获第12代病毒培养上清。重复带毒细 胞和健康细胞混合传代至50代，直至收获病毒上清P50。P11～P50收获的病毒 滴度见下表3。

表3收获的P11～P50病毒的滴度

二、三级毒种库的建立

本研究通过将(JEV)SA14-14-2接种在混悬2BS细胞上，通过带毒细胞 连续传代、带毒细胞和健康细胞混合连续传代的方法使乙脑病毒稳定适应于2BS 细胞上，筛选出乙脑病毒SA14-14-2二倍体细胞2BS适应株，且病毒达到较高 的滴度，从20代到50代，病毒滴度可稳定在较高滴度范围。通过对病毒在2BS 细胞上的传代适应分析总结分析，我们选取了适应株病毒滴度较高的代次，即第 34代病毒((7.00lgPFU/mL)作为原始毒库，第36代病毒(7.25lgPFU/mL)作为 主代毒种，第38代病毒(7.15lgPFU/mL)作为工作毒种。

三、三级毒种库的安全性检查和生物学特性的研究

1.脑内致病力试验：

(1)用(JEV)SA14-14-2-2BS第34、36、38代病毒原液分别接种12～14g 昆明(KM)小鼠20只，每只脑内注射0.03mL，观察14天。接种后3天内死亡 者不计(动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20％)。3天后如有小鼠发病， 应处死后取脑，测定致病力。小鼠脑内毒力不高于3.0lgLD50/0.03mL，同时以 10-1病毒脑悬液皮下注射体重为10～12g小鼠10只，每只0.1mL，观察14天。

(2)结果：14天后，无小鼠死亡。

2.皮下感染入脑试验：

(1)用(JEV)SA14-14-2-2BS第34、36、38代病毒原液分别接种10～12g 昆明小鼠10只，每只皮下注射0.1mL，同时右侧脑内空刺，观察14天。

(2)结果：14天后，所有小鼠全部健存。

3.乳鼠传代返祖试验：

(1)用(JEV)SA14-14-2-2BS第34、36、38代病毒原液分别接种3～5日 龄昆明乳鼠10只，每只脑内注射0.02ml。将发病的乳鼠处死3只，解剖取脑， 用体重12～14g昆明小鼠测其致病力，脑内毒力应不高于3.0lgLD50/0.03ml，同 时以10-1的发病乳鼠脑悬液皮下注射体重为10～12g昆明小鼠10只，每只0.1ml， 观察14天。

(2)结果：14天后，所有小鼠均健存。

4.三级毒种库的免疫保护力

(1)免疫：取乙脑疫苗SA14-14-2(6.5lgPFU/mL)、P34(7.0lgPFU/mL)、 P36(7.25lgPFU/mL)、P38(7.15lgPFU/mL)分别稀释到10³PFU/0.1mL、 10²PFU/0.1mL、10PFU/0.1mL(即10⁴PFU/mL、10³PFU/mL、10²PFU/mL)，分别 皮下10～12gKM小鼠，0.1mL/只，每个稀释度免疫10只。同时设稀释液免疫组 为对照组，与上述方法平行免疫一组，用于免疫保护的观察。

(2)攻毒：免疫14天后，将攻击毒P3强毒株稀释至10^-6(其毒力不低于 1000LD₅₀)，腹腔攻击免疫组和对照组，0.3mL/只，同时对每只小鼠进行脑腔空 刺，以破坏血脑屏障。接种后3天内死亡不计，攻击14天后判定结果，比较其 保护力，攻击对照组小鼠死亡率不应低于80％。

(3)结果：

按下列公式计算保护率：

保护率＝(对照组小鼠死亡率－实验组小鼠死亡率)/对照组小鼠死亡率

经皮下免疫10³PFU病毒量对P3毒株致死性攻击可达100％保护，与疫苗 SA14-14-2的保护率相同，见下表4。

表4试验病毒、免疫剂量、小鼠死亡情况和保护率

5.三级毒种库的血清中和抗体水平

(1)免疫：取乙脑疫苗SA14-14-2(6.5lgPFU/mL)、P34(7.0lgPFU/mL)、 P36(7.25lgPFU/mL)、P38(7.15lgPFU/mL)分别稀释到10⁵PFU/0.1mL、 10³PFU/0.1mL，皮下免疫10～12g昆明小鼠，0.1mL/只。每株每个稀释度10只。 同时平行免疫稀释液小鼠10只作对照，用于采血，测定血清中抗体水平。

(2)采血：免疫后14天，每只小鼠从眼部采血0.5～1mL，分别收集于1.5mL 无菌离心管中，4℃过夜保存。

(3)血清的分离：从每只小鼠分离血清(100～200μL)，每只小鼠血清单独 一管，不进行合并。56℃水浴灭活30min后保存在-20℃冰箱备用。

(4)血清中抗体水平检测(PRNT)：BHK-21细胞接种于24孔细胞培养 板，间隔48h待细胞长成单层，将P3病毒株稀释成每孔约25个空斑的病毒量， 小鼠血清分别按1：5、1：10、1：20、1：40稀释，血清与病毒等体积混合， 37℃水浴作用90min后，取血清病毒混合物0.1mL接种到24孔板细胞中，每个 稀释度做一个副孔，37℃吸附60min，加终浓度为1％甲基纤维素营养覆盖物， 37℃孵箱中培养5天后吸去覆盖物，结晶紫染色30min，自来水冲洗计数空斑数， 计算血清中和效价。

(5)结果：

在PRNT试验中，能使噬斑数减少50％的血清稀释度即为该血清的中和效 价。

经皮下免疫10³或10⁵PFU病毒量时，所有小鼠血清都100％阳转。免疫剂量 为10³PFU时，病毒几何平均效价1：65、1：71、1：71，SA14-14-2为1：71； 免疫剂量为10⁵PFU时，病毒和与疫苗SA14-14-2的血清中和抗体水平均达到1： 80，见下表5。

表5实验组病毒、免疫剂量、几何平均效价和阳转率

四、三级毒种库全基因组测序

1.引物设计及合成

根据Genbank中已发表的SA14-14-2的全基因组序列，应用PrimerPremier 5.0软件设计7段引物，由上海英骏生物技术有限公司合成，见下表6。

表6SA14-14-2分段测序扩增用引物

2.病毒RNA的提取，RT-PCR

取冻存的细胞上清病毒收获液，按TIANGEN公司的病毒RNA提取试剂盒 说明提取病毒总RNA。用ReverseTranscriptionSystem合成cDNA，然后用各片 段特异性引物进行目的片段的PCR扩增。反应条件为：预变性95℃，15min； 变性94℃，30s；退火52℃，30s；延伸72℃，3.5min，27个循环后，72℃延伸 10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后用GelExtractionKit纯化回收。

3.克隆连接及菌液测序

将PCR胶回收纯化产物连接到pGEM-TEasy载体中，转化感受态E.coli DH5α，挑选阳性克隆增菌培养后送上海英骏生物技术有限公司测序，每个片段 测5-8个克隆结果。

3.序列拼接及生物信息学比对分析

用DNAstar软件中的SeqMan功能将各片段拼接；运用MegAlign进行基因 序列及氨基酸序列的比对分析。

4.结果

(1)基因结构结果

SA14-14-2-2BS病毒株从5'端第96位开始至3'端10392位终止是一个长开 放式阅读框，约10.3kb，能转录和翻译出一个多聚蛋白前体，这种多聚蛋白再通 过病毒和宿主细胞蛋白酶的作用而分裂形成多种蛋白，主要包括3个结构蛋白 (衣壳蛋白、前膜蛋白和包膜糖蛋白)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、 NS3、NS4A、NS4B、NS5)。

(2)基因突变位点分析

与乙型脑炎减毒活疫苗株SA14-14-2全基因序列对比，SA14-14-2-2BSP34、 SA14-14-2-2BSP36、SA14-14-2-2BSP38核苷酸变化如下表：

表7疫苗株在2BS细胞培养P34、P36、P38与减毒活疫苗核苷酸比较

结果显示，SA14-14-2P34、P36、P38和Genbank中乙型脑炎减毒活疫苗株 SA14-14-2的E基因蛋白核苷酸完全相同，而全基因一共有12个核苷酸位点发 生变化。

由上述实验可以证明：

1.本发明筛选的乙型脑炎病毒SA14-14-2-2BS传代背景清楚、来源明确、增殖 良好且检定合格，达到作为疫苗生产用毒种的要求。

2.经安全性、免疫原性、遗传稳定性三方面的验证表明：SA14-14-2-2BSP34， SA14-14-2-2BSP36，SA14-14-2-2BSP38株安全性符合《中国药典》第三部(2010 版)的要求；并且免疫原性良好，能有效的免疫攻击保护和诱导保护中和抗体产 生。

3.根据文献报道，乙脑减毒活疫苗SA14-14-2与E蛋白基因与其减毒和免疫原 性起最重要作用，本研究中基因组测序表明，SA14-14-2-2BSP34，SA14-14-2-2BS P36，SA14-14-2-2BSP38株全基因组与亲本株SA14-14-2相比，E基因核苷酸序 列完全一致，基因全长的比对共发生了12个核苷酸变化。