激酶Akt和/或激酶AMPK及其激活剂在降血糖方面的应用

技术领域

本发明属于药理学领域，涉及降血糖相关药物靶标和药物分子的发现，具体涉及激酶Akt 和/或激酶AMPK及其激活剂在降血糖方面的应用。

背景技术

PI3K/Akt通路广泛存在细胞中，是参与细胞生长、增殖、分化调节的信号转导通路。PI3K 由一个相对分子质量为110×10³的催化亚基p110和一个相对分子质量为85×10³的调节亚基 p85构成。p85的氨基端含有SH3结构域和能与SH3结构域结合的脯氨酸富集区，其羧基端 含有2个SH2结构域及1个与p110结合的区域。PI3K的p110亚基与蛋白激酶具有同源性， 本身既具有Ser/Thr激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。根据PI3K的p110结构特点 和底物分子不同可将其分为三大类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个亚型。Ⅰ型分为ⅠA和ⅠB亚类，ⅠA 亚类包括p110α、p110β、p110δ，能与p85形成二聚体；ⅠB亚类包括p110γ，它并不与p85 结合，而是与1个相对分子质量为101×10³的接头蛋白结合，此接头蛋白可介导G蛋白的β、 γ亚基活化p110；Ⅱ型PI3K是含有C2结构域的PI3K；Ⅲ型PI3K是在哺乳动物细胞内发现 的与酵母的VPS34分子结构同源的蛋白。Akt，又称蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)， 是1种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。目前发现至少存在3种Akt家族成员：Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ、 Akt3/PKBγ。Akt/PKB的催化区与PKA有65％同源性，与PKC有75％同源性，不同的是， Akt氨基端含有1个特异性作用于底物中丝氨酸/苏氨酸残基并使其磷酸化的血小板-白细胞C 激酶底物同源结构区域(PH)，可介导脂质-蛋白质和(或)蛋白质-蛋白质之间的相互作用， Akt羧基端是疏水区，富含脯氨酸。Akt的PH区在进化中是高度保守的，表明其可能具有重 要的功能。PI3K可被G蛋白偶联受体和(或)蛋白酪氨酸激酶受体激活，也可被Ras蛋白激 活。PI3K对磷脂酰肌醇环上的3位羟基进行磷酸化产生磷酸化的磷脂酰肌醇：包括3-磷酸磷 脂酰肌醇(PI-3P)、3，4-二磷酸磷脂酰肌醇(PI-3，4-P2)、3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PI-3， 4，5-P3)多种生长因子主要通过PI3K/Akt信号转导通路而发挥作用。Akt/PKB是PI3K信号 传导途径中一个重要的下游靶激酶，分子量为60KD，PI3K激活后的产物PI-3，4-P2及PI-3， 4，5-P3与Akt的PH区结合，不仅导致Akt发生从细胞质到细胞膜的转位，还可促使其构象 发生改变，从而得以在Ser473和Thr308位点磷酸化激活，而Ser473和(或)Thr308位点的 磷酸化是Akt激活的必要条件。另外，Akt的激活尚需要磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶(PDK) 参与，PDK21只能使Thr308位点磷酸化，而对Ser473位点无直接作用，但Akt的PH区与 脂质产物的高亲和力结合，促进了PDK-1/PDK-2复合体的形成，后者具有Ser473位点磷酸 化的能力。活化的Akt，进一步激活其下游的因子，如bcl-2家族、E2F、叉头转录因子(FKHR) 和S6蛋白激酶等，对细胞周期、凋亡等产生调节作用。PI3K活化产生的PIP3不能直接使 Akt磷酸化，能够使Akt磷酸化的是磷酸肌醇依赖性激酶-1(PDK-1)，当细胞受到细胞外信 号的刺激后，PI3K活化产生PIP3使Akt/PKB转位到细胞膜后，不仅使Akt/PKB本身获得催 化活性，催化其自身的Ser124和Thr450磷酸化，并且使Akt/PKB和PDK-1同时定位在细胞 膜上，PDK-1就能催化Akt/PKB的Ser473和Thr308磷酸化，使Akt/PKB完全活化，从而引 起信号传导通路的级联反应。

目前，尚未见激酶Akt及其激活剂与降血糖的相关报道，更未见激酶Akt与其他靶标(如 激酶AMPK)联合用于降血糖的相关报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于筛选降血糖药物的药物靶标，包括激酶Akt；

本发明的第二目的在于提供上述激酶Akt的激活剂在制备降血糖药物中的应用；

本发明的第三目的在于提供一种基于激酶Akt激活剂的降血糖药物制剂；

本发明的第四目的在于提供一种药物靶标组合物，包括激酶Akt和激酶AMPK；

本发明的第五目的在于提供上述激酶Akt激活剂和激酶AMPK激活剂的组合物在制备降 血糖药物中的应用；

本发明的第六目的在于提供一种基于激酶Akt激活剂和激酶AMPK激活剂组合物的药物 制剂。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种筛选降血糖药物的药物靶标，包括激酶Akt。激酶Akt的激活剂可以提高脂肪细胞 的糖消耗，激酶Akt的抑制剂可以阻断激活剂的这种作用，说明激酶Akt是降血糖靶标。

上述激酶Akt的激活剂在制备降血糖药物中的应用。激酶Akt的激活剂可以提高脂肪细 胞的糖消耗，激酶Akt的抑制剂可以阻断激活剂的这种作用，说明激酶Akt是降血糖药物的 作用靶标，激酶Akt的激活剂可以用于制备降血糖药物。

进一步地，所述的激酶Akt的激活剂为野黄芩苷。野黄芩苷可以提高脂肪细胞激酶Akt 的磷酸化水平，进而提高脂肪细胞的糖消耗和糖摄取；激酶Akt的抑制剂MK-2206可以阻 断野黄芩苷的这种作用，说明野黄芩苷是激酶Akt的激活剂。

一种用于降血糖的药物制剂，包含如上所述的激酶Akt的激活剂和药学上可以接受的载 体。药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收 促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。激酶Akt的激活剂可以提高脂肪细胞的糖消耗和 糖摄取进而发挥降血糖作用。

一种筛选降血糖药物的药物靶标组合物，包括如上所述的激酶Akt，还包括激酶AMPK。

上述药物靶标组合物的激活剂在制备降血糖药物中的应用，包括激酶Akt的激活剂和激 酶AMPK的激活剂。激酶Akt的激活剂和激酶AMPK的激活剂可以协同提高脂肪细胞的糖 消耗和糖摄取，效果优于激酶Akt的激活剂或激酶AMPK的激活剂单独作用的效果。

一种用于降血糖的药物制剂，包括上述的激酶Akt的激活剂和激酶AMPK的激活剂，以 及药学上可以接受的载体。基于激酶Akt的激活剂和激酶AMPK的激活剂之间的协同作用， 可以制备降血糖药物组合物，包括激酶Akt的激活剂和激酶AMPK的激活剂，实现多靶增效、 降低单药给药剂量的目标。

进一步地，所述激酶Akt的激活剂为野黄芩苷。野黄芩苷可以提高脂肪细胞激酶Akt的 磷酸化水平，进而提高脂肪细胞的糖消耗和糖摄取；激酶Akt的抑制剂MK-2206可以阻断野 黄芩苷的这种作用，说明野黄芩苷是激酶Akt的激活剂。

进一步地，所述激酶AMPK的激活剂为黄芩苷。黄芩苷可以升高脂肪细胞基础AMPK 的磷酸化水平，进而提高脂肪细胞的糖消耗和糖摄取；激酶AMPK的抑制剂Compound-C可 以阻断黄芩苷的这种作用，说明黄芩苷是激酶AMPK的激活剂。

野黄芩苷和黄芩苷可以协同提高脂肪细胞的糖消耗和糖摄取，协同效果优于野黄芩苷或 黄芩苷单独作用的效果，可以开发成降血糖的药物。

进一步地，所述药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。

本发明的优点：

1、本发明提供的激酶Akt的激活剂野黄芩苷可以提高脂肪细胞的糖消耗糖摄取，激酶 Akt的抑制剂MK-2206可以阻断野黄芩苷的这种作用，说明激酶Akt是降血糖药物的作用靶 标，野黄芩苷可以通过提高激酶Akt的磷酸化水平发挥降血糖作用，可用于制备降血糖药物；

2、激酶Akt的激活剂野黄芩苷和激酶AMPK的激活剂黄芩苷可以协同提高脂肪细胞的 糖消耗和糖摄取，协同效果优于野黄芩苷或黄芩苷单独作用的效果，说明激酶Akt的激活剂 和激酶AMPK的激活剂之间存在协同降血糖的作用，激酶Akt和激酶AMPK可以作为降血 糖药物开发的协同靶标，野黄芩苷和黄芩苷的组合物可以开发成降血糖药物。

附图说明

图1为野黄芩苷及阻断剂MK-2206对脂肪细胞葡萄糖消耗量的影响；

图2为黄芩苷及阻断剂Compound-C对脂肪细胞葡萄糖消耗量的影响；

图3为野黄芩苷对激酶Akt磷酸化水平的影响；

图4为黄芩苷对激酶AMPK磷酸化水平的影响；

图5为野黄芩苷、黄芩苷单用以及联用对脂肪细胞糖摄取量影响的量效关系图；

图6为野黄芩苷联用黄芩苷对脂肪细胞糖摄取量的效应(Fa)与合用指数(CI)的关系。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽 管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明 的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：野黄芩苷对激酶Akt的激活作用和对脂肪细胞糖消耗的促进作用

1、材料与方法

1.1动物或细胞来源

3T3-L1小鼠成纤维细胞，购自于ATCC。

1.2试剂和样品

DMEM不完全高糖培养液，江苏凯基生物技术股份有限公司；巴西血清，ThermoFisher Scientific；野黄芩苷(>98％)，成都曼思特生物科技有限公司；2NBDG，invitrogen公司； MK-2206，selleck公司；IBMX，地塞米松，胰岛素，Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒，上海 荣盛生物药业有限公司。KRHB:(Krebs-Ringerphosphate-HEPESbuffer)液：NaCl118 mmol/L,KCl5mmol/L,CaCl₂1.3mmol/L,KH₂PO₄1.2mmol/L,MgSO₄·7H₂O1.2mmol/L, HEPES30mmol/Land0.5％BSA,pH7.4。

1.3仪器

酶标仪(MultiskanSpectrum，型号1500，ThermoElectromLorporation)；超低温冰箱， 型号702，ThermoElectronCorporation；低温离心机，型号1-15K，SigmaCorporation；XSZ-Dz 倒置显微镜，重庆光学仪器厂；细胞培养箱，型号3111，ThermoElectronCorporation；超净 台，型号：SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术有限公司；Bio-rad；稳压稳流电泳仪，型号EPS2200， 南京科宝仪器研究所；垂直电泳槽：型号MiniProtean3Cell，Bio-Rad；电转仪：型号Trans-Blot SDCell，Bio-Rad；塑料薄膜封口机，型号FS-200，温州康成南浦利波机械设备厂。

1.4分组与给药

3T3-L1细胞的分化

细胞分化：按照本领域常规分化3T3-L1前脂肪细胞的方法，诱导其分化成脂肪细胞。在 3T3-L1前脂肪细胞生长至细胞融合时，将10％FBS的高糖DMEM换成分化液(含0.5mM 的IBMX，1μM地塞米松，10μg/mL胰岛素，10％FBS的高糖DMEM培养基)培养2d，更 换新鲜分化液(含10μg/mL胰岛素)再分化2d，随后以含10％FBS的高糖DMEM培养基 继续培养，每2d更换一次培养基，诱导分化8～12天后，待3T3-L1细胞呈成熟脂肪细胞表 形即可用于试验。

1)糖消耗实验

选用生长状态良好且分化好的脂肪细胞，以2×10⁵cell/孔接种于48孔培养板，待细胞生 长至80-90％融合时，换用不含糖的KRHB液培养4h，使细胞同步化。PBS轻洗两遍后， 每孔加入200μLKRHB。实验分组如下：

空白对照组：纯KRHB液；

二甲双胍组(阳性对照)：KRHB液中含1mM二甲双胍；

野黄芩苷组：KRHB液中含10μM野黄芩苷；

MK-2206阻断组：KRHB液中含10μM野黄芩苷和10μMMK-2206；

上述各组37℃温浴30min后，再加入葡萄糖(终浓度为11mM)于37℃继续孵育4h。

2)糖摄取实验

选用生长良好的细胞，以2×10⁵个细胞/ml接种于48孔培养板，每孔加入细胞悬液400μl。

实验分组如下：

空白对照组(Blank)；野黄芩苷组；MK-2206阻断组；二甲双胍组。

待细胞融合后，换用无血清培养基使细胞同步化4h。换为KRH液，其中：二甲双胍组 的KRH液含1mM二甲双胍；野黄芩苷组KRH液中含10μM野黄芩苷；MK-2206阻断组KRHB 液中含10μM野黄芩苷和10μMMK-2206。37℃温浴30min后，用PBS清洗细胞两次，加100μl 浓度为500μM的2-NBDG探针，37℃避光孵育1h。

3)WesternBlot

选用生长良好的成熟的脂肪细胞，以2×10⁵cell/孔接种于6孔培养板，待细胞生长至 80-90％融合时，换用无血清的DMEM培养基同步化4h。实验分组如下：

空白对照组：纯无血清的DMEM培养基于37℃继续孵育2h；

二甲双胍组：无血清的DMEM培养基中含1mM二甲双胍，于37℃温育2h；

野黄芩苷组：无血清的DMEM培养基中含10μM野黄芩苷，于37℃温育2h；

MK-2206阻断组：无血清的DMEM培养基中含10μM野黄芩苷和10μMMK-2206；

1.5指标测定

1)糖消耗实验

孵育4h后，用葡萄糖测定试剂盒测定加入葡萄糖4h后细胞上清液中剩余葡萄糖的含量， 通过计算葡萄糖浓度差值即为脂肪细胞对葡萄糖的消耗量。

2)糖摄取实验

30min后，弃去孔内的液体，回收探针，用冷的PBS洗3次，每孔加入100μl的KRHB， 最后于荧光显微镜495nm激发波长、515nm发射波长处观察各组的荧光，并拍摄图片。

3)WesternBlot

冰上终止反应，吸弃上清液，用冰预冷的PBS清洗细胞3次，收集细胞至2mLEP管中， 4℃、3000rpm离心5min，弃去PBS后加入适量的细胞裂解液，冰上裂解细胞30min后于4℃、 13,000g离心15min，将上清液移入2mL离心管中，备用。取少量的上清液按照BCA蛋白 含量测定试剂盒说明书的步骤进行蛋白定量。剩余的上清液加入1/2体积的1.5倍上样缓冲液， 标记，用生料带缠好管口，沸水煮15min，放入-80℃冰箱保存备用。

1.6统计学方法

所有数据均以mean±SD表示，采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，分析差异的 显著性，并进一步用Student’s-twotailed-t检验，比较组间差异。*p<0.05表示显著差异。

2、试验结果

2.1野黄芩苷对脂肪细胞糖消耗量和糖摄取的影响

结果表明野黄芩苷能有效地促进脂肪细胞对葡萄糖的消耗和摄取，与阳性药二甲双胍的 药理作用相似。野黄芩苷对脂肪细胞葡萄糖消耗的促进作用可以被激酶Akt的抑制剂 MK-2206阻断，但不能被激酶AMPK的抑制剂Compound-C阻断。

试验结果见表1和图1(*表示p<0.05，差异显著)。

表1对脂肪细胞中葡萄糖消耗量的影响

2.2野黄芩苷对激酶Akt的激活作用

在生理状态下，与空白对照组相比，野黄芩苷能显著增加磷酸化Akt的表达。见图3。

实施例2：黄芩苷对激酶AMPK的激活作用和对脂肪细胞糖消耗的促进作用

1、材料与方法

1.1动物或细胞来源

3T3-L1小鼠成纤维细胞，购自于ATCC。

1.2试剂和样品

DMEM不完全高糖培养液，江苏凯基生物技术股份有限公司；巴西血清，ThermoFisher Scientific；黄芩苷(>98％)，成都曼思特生物科技有限公司；2NBDG，invitrogen公司； Compound-C，selleck公司；IBMX，地塞米松，胰岛素，Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒， 上海荣盛生物药业有限公司。KRHB:(Krebs-Ringerphosphate-HEPESbuffer)液：NaCl118 mmol/L,KCl5mmol/L,CaCl₂1.3mmol/L,KH₂PO₄1.2mmol/L,MgSO₄·7H₂O1.2mmol/L, HEPES30mmol/Land0.5％BSA,pH7.4。

1.3仪器

酶标仪(MultiskanSpectrum，型号1500，ThermoElectromLorporation)；超低温冰箱， 型号702，ThermoElectronCorporation；低温离心机，型号1-15K，SigmaCorporation；XSZ-Dz 倒置显微镜，重庆光学仪器厂；细胞培养箱，型号3111，ThermoElectronCorporation；超净 台，型号：SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术有限公司；Bio-rad；稳压稳流电泳仪，型号EPS2200， 南京科宝仪器研究所；垂直电泳槽：型号MiniProtean3Cell，Bio-Rad；电转仪：型号Trans-Blot SDCell，Bio-Rad；塑料薄膜封口机，型号FS-200，温州康成南浦利波机械设备厂。

1.4分组与给药

3T3-L1细胞的分化

细胞分化：按照本领域常规分化3T3-L1前脂肪细胞的方法，诱导其分化成脂肪细胞。在 3T3-L1前脂肪细胞生长至细胞融合时，将10％FBS的高糖DMEM换成分化液(含0.5mM 的IBMX，1μM地塞米松，10μg/mL胰岛素，10％FBS的高糖DMEM培养基)培养2d，更 换新鲜分化液(含10μg/mL胰岛素)再分化2d，随后以含10％FBS的高糖DMEM培养基 继续培养，每2d更换一次培养基，诱导分化8～12天后，待3T3-L1细胞呈成熟脂肪细胞表 形即可用于试验。

1)糖消耗实验

选用生长状态良好且分化好的脂肪细胞，以2×10⁵cell/孔接种于48孔培养板，待细胞生 长至80-90％融合时，换用不含糖的KRHB液培养4h，使细胞同步化。PBS轻洗两遍后， 每孔加入200μLKRHB。实验分组如下：

空白对照组：纯KRHB液；

二甲双胍组(阳性对照)：KRHB液中含1mM二甲双胍；

黄芩苷组：KRHB液中含10μM黄芩苷；

Compound-C阻断组：KRHB液中含10μM黄芩苷和25μMCompound-C；

上述各组37℃温浴30min后，再加入葡萄糖(终浓度为11mM)于37℃继续孵育4h。

2)糖摄取实验

选用生长良好的细胞，以2×10⁵个细胞/ml接种于48孔培养板，每孔加入细胞悬液400μl。

实验分组如下：

空白对照组(Blank)：黄芩苷组；Compound-C阻断组；二甲双胍组。

待细胞融合后，换用无血清培养基使细胞同步化4h。换为KRH液，其中：二甲双胍组 的KRH液含1mM二甲双胍；黄芩苷组KRH液中含10μM黄芩苷；Compound-C阻断组KRHB 液中含10μM黄芩苷和25μMCompound-C。37℃温浴30min后，用PBS清洗细胞两次，加 100μl浓度为500μM的2-NBDG探针，37℃避光孵育1h。

3)WesternBlot

选用生长良好的成熟的脂肪细胞，以2×10⁵cell/孔接种于6孔培养板，待细胞生长至 80-90％融合时，换用无血清的DMEM培养基同步化4h。实验分组如下：

空白对照组：纯无血清的DMEM培养基于37℃继续孵育2h；

二甲双胍组：无血清的DMEM培养基中含1mM二甲双胍，于37℃温育2h；

黄芩苷组：无血清的DMEM培养基中含10μM黄芩苷，于37℃温育2h；

Compound-C阻断组(C-C阻断组)：无血清的DMEM培养基中含10μM黄芩苷和25μM Compound-C；

1.5指标测定

1)糖消耗实验

孵育4h后，用葡萄糖测定试剂盒测定加入葡萄糖4h后细胞上清液中剩余葡萄糖的含量， 通过计算葡萄糖浓度差值即为脂肪细胞对葡萄糖的消耗量。

2)糖摄取实验

30min后，弃去孔内的液体，回收探针，用冷的PBS洗3次，每孔加入100μl的KRHB， 最后于荧光显微镜495nm激发波长、515nm发射波长处观察各组的荧光，并拍摄图片。

3)WesternBlot

冰上终止反应，吸弃上清液，用冰预冷的PBS清洗细胞3次，收集细胞至2mLEP管中， 4℃、3000rpm离心5min，弃去PBS后加入适量的细胞裂解液，冰上裂解细胞30min后于4℃、 13,000g离心15min，将上清液移入2mL离心管中，备用。取少量的上清液按照BCA蛋白 含量测定试剂盒说明书的步骤进行蛋白定量。剩余的上清液加入1/2体积的1.5倍上样缓冲液， 标记，用生料带缠好管口，沸水煮15min，放入-80℃冰箱保存备用。

1.6统计学方法

所有数据均以mean±SD表示，采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，分析差异的 显著性，并进一步用Student’s-twotailed-t检验，比较组间差异。*p<0.05表示显著差异。

2、试验结果

2.1黄芩苷对脂肪细胞糖消耗量和糖摄取的影响

结果表明黄芩苷能有效地促进脂肪细胞对葡萄糖的消耗和摄取，与阳性药二甲双胍的药 理作用相似。黄芩苷对脂肪细胞葡萄糖消耗的促进作用可以被激酶AMPK的抑制剂 Compound-C阻断，但不能被激酶Akt的抑制剂MK-2206阻断。

结果见表2和图2(*表示p<0.05，差异显著)。

表2对脂肪细胞中葡萄糖消耗量的影响

2.2黄芩苷对激酶AMPK的激活作用

在生理状态下，与空白对照组相比，黄芩苷能显著增加磷酸化AMPK的表达。见图4。

实施例3：中效原理评价野黄芩苷和黄芩苷联合应用效应

1、材料与方法

1.1动物或细胞来源

3T3-L1小鼠成纤维细胞,购自于ATCC。

1.2试剂和样品

DMEM不完全高糖培养液，江苏凯基生物技术股份有限公司；巴西血清，ThermoFisher Scientific；野黄芩苷，黄芩苷(>98％)，成都曼思特生物科技有限公司；2NBDG，invitrogen 公司；2-Deoxyglucoseuptakemeasurementkit，CosmoBioCo.公司。KRHB:(Krebs-Ringer phosphate-HEPESbuffer)液：NaCl118mmol/L,KCl5mmol/L,CaCl₂1.3mmol/L,KH₂PO₄1.2 mmol/L,MgSO₄·7H₂O1.2mmol/L,HEPES30mmol/Land0.5％BSA,pH7.4。

1.3仪器

酶标仪(MultiskanSpectrum，型号1500，ThermoElectromLorporation)；超低温冰箱， 型号702，ThermoElectronCorporation；低温离心机，型号1-15K，SigmaCorporation；XSZ-Dz 倒置显微镜，重庆光学仪器厂；细胞培养箱，型号3111，ThermoElectronCorporation；超净 台，型号：SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术有限公司。

1.4分组与给药

1)3T3-L1细胞的分化

细胞分化：按照本领域常规分化3T3-L1前脂肪细胞的方法，诱导其分化成脂肪细胞。在 3T3-L1前脂肪细胞生长至细胞融合时，将10％FBS的高糖DMEM换成分化液(含0.5mM 的IBMX，1μM地塞米松，10μg/mL胰岛素，10％FBS的高糖DMEM培养基)培养2d， 更换新鲜分化液(含10μg/mL胰岛素)再分化2d，随后以含10％FBS的高糖DMEM培养 基继续培养，每2d更换一次培养基，诱导分化8～12天后，待3T3-L1细胞呈成熟脂肪细胞 表形即可用于试验。

2)糖摄取实验

选用生长状态良好且分化好的脂肪细胞，以2×10⁵cell/孔接种于48孔培养板，待细胞生 长至80-90％融合时，换用不含糖的KRHB液培养4h，使细胞同步化。PBS轻洗两遍后， 每孔加入200μLKRHB。实验分组如下：

空白对照组：纯KRHB液；

二甲双胍组：KRHB液中含1mM二甲双胍；

黄芩苷组：KRHB液中分别含2，5，10，20，40，80μM黄芩苷；

野黄芩苷组：KRHB液中分别含2，5，10，20，40，80μM野黄芩苷；

野黄芩苷+黄芩苷组：KRHB液中分别含2+2，5+5，10+10，20+20，40+40，80+80μM 的野黄芩苷+黄芩苷；

各组温育30min后，再加入2DG(终浓度为1mM)于37℃继续孵育0.33h。

1.5指标测定：糖摄取实验

孵育20min后，按2-Deoxyglucoseuptakemeasurementkit试剂盒步骤测定脂肪细胞中葡 萄糖的含量。

1.6统计学方法

所有数据均以mean±SD表示，采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，分析差异的 显著性，并进一步用Student’s-twotailed-t检验，比较组间差异。*p<0.05表示显著差异。两 种药物降糖效果的联用指数用CompuSyn(ComboSynInc.,USA)软件进行计算。

2、试验结果

2.1各单药对脂肪细胞糖摄取的影响

糖摄取法实验结果显示两种药物均有促进脂肪细胞糖摄取作用，并呈剂量依赖性。

2.2两药联合效应分析

根据糖摄取法实验所得单药或联合用药作用于脂肪细胞的效应，绘制剂量－效应曲线， 如图5所示，并进一步绘制不同效应(Fa)下的合用指数(CI)关系曲线，如图6所示。当 Fa＝0.45时，CI≈1；当Fa>0.45时，CI＜1，两药合用效应为协同。

联合效应试验结果表明，野黄芩苷和黄芩苷联用对脂肪细胞糖摄取促进效应达到一定强 度时，存在明显的协同作用，野黄芩苷和黄芩苷的降血糖作用相互促进、相互支撑，发挥1+1 ＞2的药理作用，与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步，可以开发成治疗 糖尿病的药物组合物。糖消耗试验同样证明野黄芩苷和黄芩苷之间存在协同作用。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。 本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱 离本发明技术方案的实质和保护范围。