一种测试芦苇对虉草化感效应水环境响应特性的方法

技术领域：

本发明涉及一种测试芦苇(Phargnitescommunis)对虉草(Phalaris arundinacea)化感效应水环境响应特性的方法，属于植物生理生态学和环境科学 领域。

背景技术：

虉草芦苇同为极具竞争力的根茎类禾本科克隆植物，竞争力极强。二者在北 美甚至被视为入侵种而加以控制，但在欧洲却均因极具去污能力而被广泛用以构 建人工湿地植物群落。近年来，国内也已有学者以二者为优势种群，构建人工湿 地或氮磷生态拦截沟渠的植物群落，去污效果尤为显著。这主要是因为目前国内 人工湿地去污植物仍以芦苇、美人蕉、香蒲、水葱、茭白等为主，不仅物种较为 单一，而且这些植物冬季休眠，难以实现常年持续去污。而虉草为冷季型禾草， 冬季尽管生长缓慢，但仍具有较高的去污能力，与芦苇一起构建去污工程的植物 群落，可实现高效去污和景观美化显著的周年互补性。

然而，鉴于虉草和芦苇各自极强的竞争能力，它们在自然生态系统中常通过 抑制其他物种而演化为群落的单优种群。对于运行时间较长的去污人工湿地，芦 苇和虉草被共同配置在同一片人工湿地，其结果将如何？国际水协“人工湿地污 水处理”专家委员会主席、欧洲湿地科学家协会主席JanVymazal教授曾指出芦苇 在多数情况下处于竞争优势，但有时情况却相反。近年来，本技术发明人在研究 以虉草和芦苇为优势种的长江下游滨江湿地植被演替规律时发现，由远离岸边的 浅滩至岸边，湿地基底高程逐渐抬升，土壤含水量随之降低，湿地植被呈现由裸 滩→虉草群落→芦苇-虉草共优群落→芦苇群落的演替进程，其中芦苇-虉草共优 群落在整个滨江湿地中仍占据着广大区域，两物种可维持较长时间相对稳定的竞 争共存状态。事实上，这种共存状态在某些河漫边、湖边、低洼地和沼泽地亦常 出现。另有研究显示，尽管湿生环境为虉草的适宜生境，但虉草又极其耐旱，在 土壤绝对含水量仍较高的近岸区域本应正常生长，但却被芦苇完全替代。那么， 芦苇又是通过何种生态策略与虉草由起始共存至最终替代呢？

众所周知，芦苇是一种典型的强化感植物，强度之大可从其对一枝黄花和互 花米草等入侵植物竟具有明显的化感抑制效应得到体现。因此，对其他植物的化 感抑制效应已成为其主要竞争手段之一。有研究表明，芦苇的组织浸提液和枯落 腐解物对虉草种子萌发和植株生长确实存在明显的化感抑制效应。那么，虉草和 芦苇为何又能在长江下游滨江湿地维持较大范围、且较长时间的竞争共存状态 呢？这就需要从化感效应本身具有明显的环境响应特性行分析，即化感植物所处 的环境因子可影响乃至决定化感效应的强弱。在长江下游滨江湿地，随着湿地基 底的抬升，植被演替序列更迭，环境因子中土壤水分因子变化最为显著，芦苇化 感效应必对水环境因子作出显著的响应特性。鉴于化感水环境响应特性主要表现 为“随着土壤水分含量降低，化感抑制效应逐渐增强”。因此，滨江湿地芦苇与虉 草由起始共存至最终替代的演替过程，定是源于“芦苇的化感抑制效应随基底土 壤水分降低而逐步增强”这一化感效应的水环境响应特性。其中必存在某一特定 的土壤水分梯度范围，虉草和芦苇因处于竞争平衡状态而维持着较为稳定的共存 格局。本技术方法提供的测试芦苇对虉草化感效应水环境响应特性的方法则是确 定这一特定土壤水分梯度范围的前提。因此，本技术方法不仅可丰富不同物种间 的竞争共存理论，而且还可指导虉草芦苇人工湿地植物群落的稳定维护，理论意 义和实践应用价值巨大。

发明内容：

技术问题：通过测量分析不同水分梯度环境下芦苇-虉草共存群落中芦苇根 际土壤中化感物质数量及其对虉草的诸多抑制效应，测试芦苇对虉草化感效应的 水环境响应特性。该发明将为不同物种间的竞争共存理论的丰富和人工湿地虉草 芦苇共存群落的稳定维护提供技术方法。

技术方案：为实现以上目的，本发明一种测试芦苇对虉草化感效应水环境响 应特性的方法，按照下述步骤进行：

(1)测试样地的选择

于长江下游滨江湿地选择基底平缓抬升的虉草芦苇共存区域，由滩至岸方向 自下而上每隔一定距离设置一样地，面积1m²，累计设置样地4-5个。由于随着 湿地基底平缓抬升，土壤水分含量逐渐下降，于是自下而上便构成了具有一定土 壤水分梯度的各类样地，每一样地对应某一特定土壤水分含量。设置的样地距离 恰当，过小，土壤水分梯度范围将过窄，土壤水分含量对化感效用的影响难以区 分；过大，除土壤水分因子外的其他环境因子差异将会加大，势必也会影响化感 效用。理想的样地间距应该是在确保其他环境因子差异最小化的前提下，力争扩 大样地间的水分梯度范围。本技术方法提供的土壤水分梯度范围为70％-100％的 土壤相对含水量，此范围基本涵盖一般湿地土壤含水范围。

(2)测定指标选择

测定指标主要包括化感供体释放的化感物质成分、化感受体的诸多生长生理 指标和不同样地的土壤含水量。

化感供体释放的化感物质：化感物质多为植物向环境释放的一些次生代谢产 物，主要包括酚酸类、萜类以及糖苷和生物碱等物质，而研究表明芦苇的化感物 质以酚酸类物质为主，其中，芦苇根际土壤中酚酸物质主要来自芦苇根系分泌、 枯落物腐解释放和活体组织淋溶等途径进入土壤。因此，本技术方法化感物质指 标选择芦苇根际土壤中的总酚酸含量。

化感受体生长和生理指标：受体的植株高度和生物量是判断化感抑制效应最 明显指标；受体的生理指标包括净光合速率(Pn)、气孔导度(Cond)、胞间CO₂浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)等光合气体交换参数；叶绿素含量；超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等抗氧化酶及丙二醛(MDA) 含量。其中，

Pn表示光合产物合成量抵消呼吸消耗量后的净合成量；Cond表示叶片气孔 的开闭程度；Ci表示叶片细胞间隙内CO₂的浓度大小，一方面反映气孔的开闭 程度，另一方面反映叶片叶肉细胞光合能力的大小；Tr表示叶片蒸腾失水的速 率。当植物承受逆境胁迫时，Pn、Cond、Tr和叶绿素含量常随胁迫程度加重呈 逐渐降低趋势，而Ci则呈既可能增加也可能减小的变化趋势。

SOD、CAT和POD等抗氧化酶的活性通常随植物承受的胁迫程度的增强呈 现先升高后降低的趋势，而MDA含量则常随胁迫程度的增强持续升高。

(3)指标测定

各指标的测定选择在4月底5月初进行，此时虉草处于生长中后期，而芦苇 处于生长旺盛期，二者的生态位重叠最高，竞争也最为强烈。

株高和生物量测定首先在每个样地筛选一定株数长势均匀的虉草，测其株 高后收割地上部分称其鲜重，然后分别取均值。这样便得到不同水分梯度下生长 的虉草株高和地上部分生物量。

光合气体交换参数测定利用美国Ci-COR公司生产的Li-6400便携式光合 作用系统，选择晴朗天气上午，测试环境中的大气CO₂浓度和空气湿度依照自 然环境下状况，温度和光照强度由便携式光合作用系统设置，具体数值以被测试 植物的适宜生长条件确定。在每个样地筛选3-5株数长势均匀的虉草，对其旗叶 分别测定Pn、Cond、Ci和Tr等相关指标，每个叶片3次重复取值，最后分别取 均值。

抗氧化酶保护系统和叶绿素含量同样于每一个样地筛选3-5株数长势均匀 的虉草，测定其旗叶抗氧化酶保护系统各指标和叶绿素含量，其中，SOD、CAT 和POD等抗氧化酶的活性分别采用氮蓝四唑(NBT)法、紫外吸收法和硫代巴 比妥酸法测定，而MDA含量则采用愈创木酚法测定；叶绿素含量的测定采用丙 酮法。

以上生长生理指标测定结束后，于每一个样地芦苇根下挖取一定量的根际土 壤，测定其土壤的相对含水量后，采用磷钼酸-磷钨酸盐比色法测定芦苇根际土 壤中化感物质总酚酸含量，从而得出不同水分梯度环境下芦苇根际土壤化感物质 总酚酸的含量。

(4)化感效应水环境响应分析

分析随着土壤水分含量降低，虉草株高和地上部分生物量等生长指标以及叶 片内叶绿素含量、Pn、Cond、Ci、Tr、SOD、CAT、POD和MDA等生理指标的 变化趋势和变化量，从而明确化感抑制效应的水环境响应特征；分析随着土壤水 分含量降低，芦苇根际土壤中总酚酸含量的变化趋势和变化量，从而明确化感物 质释放的水环境响应特征；分析不同土壤水分含量、化感物质根际土壤总酚酸量 以及反映化感抑制效应的虉草系列生长生理指标间的相关关系。

筛选具有代表性指标，其主要特征为既与土壤含水量和化感供体化感物质 释放量均显著相关，又能从本质上反映化感受体受抑制状态，且有理想方程将其 与土壤含水量进行拟合的各指标，构建这些指标随土壤含水量下降而升/降变化 的拟合方程。譬如，选择指标虉草地上部分生物量，该指标与土壤含水量极显著 相关(r＝0.9706^**)，与芦苇根际土壤中的总酚酸含量也显著相关(r＝-0.9492^*)， 地上部分生物量随土壤含水量下降而下降的趋势可很好反映出虉草承受的抑制 状态，选用理想方程拟合二者下降趋势，结果发现，S型曲线方程：Y ＝-0.3306+19.1663/{1+exp[-(X-11.2494)/2.5557]}拟合效果理想(R²＝0.9931)，式 中X为样地土壤水分下降率，Y为虉草地上部分生物量下降率。

另如虉草净光合速率指标，该指标与土壤含水量和芦苇根际总酚酸含量均 极显著相关(r分别为0.9901^**和-0.9938^**)，叶片净光合速率随土壤含水量下降 而下降的趋势也可很好反映出虉草所承受的抑制状态，选用理想方程拟合二者下 降趋势，结果发现，一元三次方程：Y＝-0.0036X³+0.1632X²-0.0552X-0.2278拟 合效果理想(R²＝0.9978)，式中X为样地土壤水分下降率，Y为虉草叶片净光合 速率下降率。

综上所述，本发明的有益效果：

本发明不仅可测算芦苇对虉草系列生长生理指标化感抑制效应的水环境响 应特性，而且可进一步溯源，测算出芦苇根际土壤中化感抑制物质总酚酸释放量 的水环境响应特性，并明确不同土壤含水量、化感物质根际土壤总酚酸量以及反 映化感抑制效应的虉草系列生长生理指标间的相关关系，继而构建了具有代表性 指标随土壤含水量下降而升/降变化的拟合方程，化感效应的水环境响应特性得 以完美揭示。

芦苇对虉草化感抑制效应的水环境响应测试方法的利用，既可以丰富不同物 种间竞争共存理论，又可为人工湿地芦苇和虉草群落稳定共存提供技术指导，从 而有效地实现该类湿地周年高效去污和景观美化的互补性。

附图说明

图1芦苇根际土壤总酚酸上升率随样地土壤水分下降率变化趋势；拟合方程：Y ＝0.0716X²+1.0451X-0.9904；判定系数：R²＝0.9977。

图2虉草株高下降率随样地土壤水分下降率变化趋势；拟合方程：Y＝0.0237X²+0.2975X+0.2366，判定系数：R²＝0.9981。

图3虉草地上部分生物量下降率随样地土壤水分下降率变化趋势；拟合方程：Y ＝-0.3306+19.1663/{1+exp[-(X-11.2494)/2.5557]}，判定系数：R²＝0.9931。

图4虉草叶绿素含量下降率随样地土壤水分下降率变化趋势；拟合方程：Y ＝-0.5869+47.0172/{1+exp[-(X-14.7260)/3.1219]}，判定系数：R²＝0.9999。

图5虉草净光合速率下降率随样地土壤水分下降率变化趋势；拟合方程：Y＝ -0.0036X³+0.1632X²-0.0552X-0.2278，判定系数：R²＝0.9978。

图6虉草叶片内丙二醛含量上升率随样地土壤水分下降率变化趋势，拟合方程： Y＝-0.0056X³+0.2794X²-0.2391X-0.3835，判定系数：R²＝0.9982。

具体实施方式

实施地点位于长江下游沿江城市镇江市滨江湿地，该区域属于季风气候，四 季分明，气候温暖湿润，年均气温15.4℃，年均降水量1074.0mm。滨江湿地是 由长江江水携带泥沙常年淤积形成。由远离岸边的浅滩至岸边，湿地基底高程逐 渐抬升，植被呈现由裸滩→虉草群落→芦苇-虉草共优群落→芦苇群落的演替进 程，本技术方法的实施地点设置在芦苇-虉草共优群落内。具体步骤为：

1、样地选择

时间为2013年11月3日，选择基底平缓抬升的虉草芦苇共存区域，由滩至 岸方向自下而上每隔2m的坡长设一面积为1m²样地，样地数5块，分别计为 S1、S2、S3、S4和S5，分别代表不同的5个土壤水分梯度样地。在样地确定至 次年测量或测试期间，定期进行人工看管，防止样地遭到破坏。

2、指标测定

2014年4月27日上午9：00-10：30，于每块样地选择5株长势均匀的虉草， 利用Li-6400便携式光合作用系统，分别测定每株旗叶光合气体交换参数。首先 开启机器，将旗叶夹入叶室中，Pn、Cond、Ci和Tr等数据稳定显示后，由仪器 记录保存，每张叶片三次取值，然后对5株取均值。测试环境中的大气CO₂浓 度和空气湿度依照自然环境下状况未作设置，仪器设置的测量温度和光照强度分 别为25℃和1200μmolm^-2s^-1。以上测试结果表1所示：

表1不同水分梯度下虉草叶片的光合气体交换参数

4月29日上午，于每块样地选取一定数量长势均匀的虉草，采摘其旗叶后 置于保鲜袋内保存至生化实验室，分别测量其叶绿素含量和抗氧化酶活性及丙二 醛的含量。其中，

叶绿素含量利用丙酮法测定，其浓度为测得的叶绿素a和叶绿素b的浓度之 和；SOD活性采用氮蓝四唑法测定，活性单位以抑制NBT光还原的50％为一个 酶活单位表示，SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(Ug^-1)；CAT酶活性采用紫 外吸收法测定，以每分钟OD变化0.01定义为1个活力单位，单位以鲜重单位 每克每分钟(Ug^-1min^-1)表示；POD酶活性采用愈创木酚法测定，以每分钟OD₄₇₀增加0.01定义为1活力单位，活性以鲜重单位每克每分钟(Ug^-1min^-1)表示；丙二 醛含量(nmolg^-1FW)采用硫代巴比妥酸法测定。以上各指标每块样地5次取 样，作5次重复，后取均值。其结果如表2所示：

表2不同水分梯度下虉草叶片的叶绿素含量和抗氧化酶系统指标

4月30日，于每块样地选取20株长势均匀的虉草植株，测量其株高后，刈 割地上部分并称量其鲜重。然后，挖取与相应虉草共存芦苇的根际土壤，放入保 鲜袋后带回生化实验室，部分立即用烘干法测量其土壤相对含水量，用以表示不 同样地的土壤含水量；其他部分于5月初采用磷钼酸-磷钨酸盐比色法测定土壤 总酚酸含量，其过程包括制备待测液及对照品标准溶液、确定测定波长、制作标 准曲线和测定样品数据四个步骤，从而根据待测样吸光度计算出总酚酸含量。所 测定结果如表3所示：

表3不同样地下土壤水分、总酚酸含量及虉草株高和地上部分鲜重

3、化感效应水环境响应分析

首先，进行土壤含水量、芦苇根际土壤总酚酸量和虉草生长生理指标间的相关关系分 析，其结果(表4)显示，样地土壤含水量与除抗氧化酶中的SOD、POD和CAT三指标外的 其他指标均极显著相关(正或负)，与以上三指标相关性较低是由于它们均随着土壤含水量 的降低呈先增后减的变化趋势。这表明本技术方法中选取的多数指标均能较好地表征化感抑 制效应。

表4土壤含水量、芦苇根际土壤总酚酸量和虉草生长生理指标间的相关性分析

R.05＝0.8780，R.01＝0.9590，^**、^*分别表示极显著和显著相关。

样地S1土壤相对含水量达到近乎最大值，即100％，这将利于本技术方法以S1样地土 壤含水量为基准，计算其他各样地土壤含水量的下降率，继而再以S1样地芦苇土壤根际中 总酚酸量和虉草各生长生理指标为基准，计算其他各样地相应指标的上升/下降率。以上结 果将表达出芦苇根际总酚酸和虉草生长生理指标随样地土壤含水量变化的动态响应(表4)， 这一动态响应表明随着土壤水分含量的降低，虉草承受的化感抑制胁迫愈为明显。

表4芦苇根际总酚酸和虉草生长生理指标随样地土壤含水量变化的动态响应

鉴于本技术方法是测试芦苇对虉草化感效应的水环境响应特性，结合不同指标间相关 性大小，本方法选择具有代表性的土壤中总酚酸含量、虉草的株高、地上部分生物量、叶绿 素含量、净光合速率和丙二醛含量等指标，分别以其上升率或下降率为因变量(Y)，以土 壤含水量的下降率为自变量(X)，构建化感抑制效应水环境响应特性最佳拟合方程，拟合结 果如图1-6所示。

经由判别系数判定，芦苇根际土壤总酚酸含量的上升率(Y)和虉草株高下降率(Y)与样 地土壤水分的下降率(X)之间的关系均可用Y＝aX²+bx+c方程拟合。其中，对于土壤总酚 酸，式中a＝0.0716，b＝1.0451，c＝-0.9904；对于虉草株高，式中a＝0.0237，b＝0.2975，c＝0.2366。

芦苇地上部分生物量的下降率(Y)和虉草叶绿素下降率(Y)与样地土壤水分的下降率 (X)之间的关系均可用Y＝a0+a1/{1+exp[-(X-a2)/a3]}的S型曲线方程拟合。其中，对于地 上部分生物量，式中a0＝-0.3306,a1＝19.1663,a2＝11.2494,a3＝2.5557；对于叶绿素，式中 a0＝-0.5869,a1＝47.0172,a2＝14.7260,a3＝3.1219。

虉草净光合速率的下降率(Y)和虉草丙二醛的上升率(Y)与样地土壤水分的下降率(X) 之间的关系均可用Y＝aX³+bX²+Cx+d方程拟合。其中，对于净光合速率，式中a＝-0.3306, b＝0.1632,c＝-0.0552,d＝-0.2278；对于丙二醛，式中a＝-0.0056,b＝0.2794,c＝-0.2391, d＝-0.3835。