一种六味地黄丸浓缩丸生药粉多指标快速检测方法

技术领域

本发明属于近红外检测领域，具体涉及一种六味地黄丸浓缩丸生药粉的快速检测方法。

背景技术

六味地黄丸浓缩丸收载在《中国药典》2010版一部中，其生药粉为山茱萸科植物山茱萸 CornusoffficinalisSieb.etZucc.干燥成熟果肉和薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThumb.干 燥根茎以2:3比例混合得到的粉末。2010版《中国药典》中记载六味地黄丸浓缩丸具有滋阴 补肾的功效，用于肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴。由于六味 地黄丸浓缩丸生药粉是山茱萸和山药的混合物，其化学成分非常复杂，主要包括多糖、有机 酸、环烯醚萜、薯蓣皂苷等。近年来国内外学者对山茱萸和山药的药理作用、化学成分进行 了大量研究，六味地黄丸浓缩丸生药粉作为六味地黄丸浓缩丸生产中重要的原药材，需要建 立质量评价指标，来保证制剂的质量与功效。但是传统检测方法费时、费力，难以广泛地应 用于生产实践，故开发一种能快速检测六味地黄丸浓缩丸生药粉质量的方法，用于现场药材 筛选和质量的全面控制具有必要性及发展前景。

近红外光谱(NIR)技术是一种间接分析技术，是通过定标模型的建立来实现对未知样 本的定性或定量分析，具有快速、无损、原位与无污染等特点。近年来，近红外光谱技术作 为一种间接分析技术，已应用于中药质量控制及生产应用领域中，包括药材、复方中药和中 药各种剂型的定性定量，以及利用光纤探头技术实现对中药生产工艺的在线连续监控等。将 近红外光谱技术应用于六味地黄丸浓缩丸生药粉的快速检测，从六味地黄丸浓缩丸生产的源 头上控制其质量，从而保证最终产品质量的安全性、稳定性和有效性，达到快速、高效的目 的。

发明内容

本发明目的在于提供一种六味地黄丸浓缩丸生药粉多指标快速检测方法。采用近红外光 谱技术能够快速测定六味地黄丸浓缩丸生药粉中水分含量、浸出物含量以及马钱苷的含量， 实现六味地黄丸浓缩丸生药粉质量的快速评价。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

(1)采集不同生产批次的六味地黄丸浓缩丸生药粉

采集不同生产批次的六味地黄丸浓缩丸生药粉样本，药材经粉碎后，过80～120目筛，得 到粒度均匀的六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末。

(2)测定六味地黄丸浓缩丸生药粉的关键检测指标

选取水分含量、浸出物含量、马钱苷含量作为六味地黄丸浓缩丸生药粉的关键检测指标； 采用《中国药典》中烘干法测定水分含量，采用《中国药典》中冷浸法测定浸出物含量，六 味地黄丸浓缩丸生药粉经过预处理后，采用高效液相色谱法测定马钱苷含量。

(3)采集六味地黄丸浓缩丸生药粉校正集样品和验证集样品的近红外原始光谱数据

精密称取六味地黄丸浓缩丸生药粉药材粉末1～5g，置于培养皿中，保持粉末表面平整， 采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为1-640次，分辨率为2-16cm^-1， 扫描光谱范围为4000-12000cm^-1。

(4)近红外原始光谱的预处理

步骤(3)采集的近红外原始光谱进行预处理，以筛选信息，减少噪音，采用一阶导数、 二阶导数、多元散射校正、Norris平滑、减去一条直线、SNV中1至2种方法的结合对剔除 了光谱异常值的光谱进行预处理，包括：

1)六味地黄丸浓缩丸生药粉水分含量模型采用减去一条直线预处理；

2)六味地黄丸浓缩丸生药粉浸出物含量模型采用消除常数偏移量光谱预处理；

3)六味地黄丸浓缩丸生药粉的马钱苷含量模型采用矢量化归一(SNV)光谱预处理。

(5)选择六味地黄丸浓缩丸生药粉的关键检测指标建模波段，建立近红外校正模型

将六味地黄丸浓缩丸生药粉校正集样品的近红外光谱经过光谱预处理后，其建模波段选 择如下：水分模型建模波段为9403.7-7498.3cm^-1和6102-4246.7cm^-1；浸出物模型建模波段为 7502.1-4597.7cm^-1；马钱苷含量模型建模波段为7502.1-4246.7cm^-1，采用偏最小二乘法(PLS) 建立近红外光谱与上述各检测指标之间的定量校正模型。

所建立的校正模型采用相关系数(R)、相对分析误差(RPD)、交叉验证均方根(RMSECV) 主成分数(Factor)四个参数考察模型性能，同时采用预测均方差(RMSEP)、相对偏差(RSEP) 来评价模型对未知样品的预测能力，当R值接近于1，当RPD值大于2.5且越大评价模型性能越 好，预测准确度高，当RMSEP越小，RSEP值小于10％时评价模型具有较好的预测能力，能够 满足六味地黄丸浓缩丸生药粉快速检测的要求。

(6)校正模型的验证

用步骤(3)所述的验证集样品对步骤(5)所述的校正模型进行验证，采用和步骤(4) 所述校正集样品近红外原始光谱相同的预处理方法后，导入步骤(5)所述校正模型，验证校 正模型的性能。

(7)测定待测的六味地黄丸浓缩丸生药粉样品的近红外光谱数据，导入步骤(5)所述 校正模型，经模型计算得到待测样品中水分、浸出物、马钱苷的预测含量。

本发明所述检测方法步骤(2)中所述高效液相色谱法测定马钱苷含量方法为：1)预处 理方法为：取六味地黄丸浓缩丸生药粉(过80-120目筛)约0.5-1g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，精密加30-100mL的80％甲醇，加热回流0.5-2h，再称重，用80％甲醇补足失重；提 取液离心10min，转速为10000-15000r·min^-1，取上清液，既得；2)液相色谱条件：色谱柱： WatersCORTECSC18分析柱(4.6×150mm，2.7μm)；流动相为乙腈(B)：水(A)，梯度洗 脱0～10min：10～17％B，10～15min：17～90％B；检测波长220-260nm，流速为0.8-1mL·min^-1， 进样量为5-25μL，柱温25-35℃。

上述高效液相色谱法测定马钱苷含量方法优选为：1)预处理方法为：取六味地黄丸浓缩 丸生药粉(过100目筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50mL的80％甲醇， 加热回流1h，再称重，用80％甲醇补足失重；提取液至1.5mL的离心管中离心10min，转 速为13000r·min^-1，取上清液，既得；2)液相色谱条件：色谱柱：WatersCORTECSC18分析 柱(4.6×150mm，2.7μm)；流动相为乙腈(B)：水(A)，梯度洗脱0～10min：10～17％B， 10～15min：17～90％B；检测波长240nm，流速为0.8mL·min^-1，进样量为10μL，柱温30℃。

本发明所述检测方法步骤(3)中采集近红外光谱时，所述扫描次数优选为32次，分辨 率优选为8cm^-1。

使用本发明所述的六味地黄丸浓缩丸生药粉多指标快速检测方法测定六味地黄丸浓缩丸 生药粉中的关键检测指标的预测含量，当测得的待测六味地黄丸浓缩丸生药粉的关键检测指 标的预测含量中水分含量≤16.0％、浸出物含量≥24.0％、马钱苷含量≥0.24％，则判断该六 味地黄丸浓缩丸生药粉为合格样品，符合质量要求，可以投入提取等后续生产环节。

本发明将近红外分析技术引入到六味地黄丸浓缩丸生药粉检测中，实现对各检测指标(水 分、浸出物、马钱苷含量)的快速测定，在中药生产中从源头上控制了原材料的质量，缩短 检测时间，节约生产成本，提高生产效率和经济效益，充分保证六味地黄丸浓缩丸产品质量 稳定、可靠。

附图说明

附图1是六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末近红外原始吸收光谱图

附图2是六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末水分含量实测值与近红外预测值的相关图

附图3是六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末浸出物含量实测值与近红外预测值的相关图

附图4是六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末马钱苷含量实测值与近红外预测值的相关图

附图5是六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末水分实测值与近红外预测值的比较图

附图6是六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末浸出物实测值与近红外预测值的比较图

附图7是六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末马钱苷含量实测值与近红外预测值的比较图

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1：

(1)采集不同生产批次的六味地黄丸浓缩丸生药粉

将不同生产批次的六味地黄丸浓缩丸生药粉经粉碎后，过100目筛，得到粒度较均匀的 六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末。

(2)六味地黄丸浓缩丸生药粉关键检测指标的测定

①水分测定方法：六味地黄丸浓缩丸生药粉的水分测定根据药典的烘干称重法，取烘干 至恒重(连续两次称重差异小于5mg)的扁形瓶(X₀)，取2g六味地黄丸浓缩丸生药粉药材， 精密称重(X₁)，置真空烘箱中105℃烘5h，取出置干燥器中冷却30min，称重，再置真空 烘箱中烘1h，称重(X₂)，重量差异5mg以上者继续置烘箱中烘，直至差异小于5mg。根 据减失的重量，计算供试品中含水量(％)。

水分含量(％)＝(X₁－X₂+X₀)/X₁×100。

②浸出物测定方法：取约2g六味地黄丸浓缩丸生药粉，置250mL锥形瓶中，加水50mL， 密塞，冷浸并称定质量。前6h时时振摇，再静置18h，称定质量，用水不足减失的质量， 摇匀。置于15mL离心管中离心30min，转速为3800r/min，精密量取上清液10mL，置已 干燥至恒重的扁形瓶中(X₀)，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3h，置干燥器中冷却30min， 迅速精密称定重量(X₂)。以干燥品计算供试品中浸出物的含量(％)。

浸出物的含量(％)＝(X₂－X₀)×5/X₁×100。

③马钱苷含量采用高效液相色谱测定：a.预处理方法为：取六味地黄丸浓缩丸生药粉(过 100目筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50mL的80％甲醇，加热回流1h， 再称重，用80％甲醇补足失重。提取液至1.5mL的离心管中离心10min，转速为13000r·min^-1， 取上清液，既得。b.液相色谱条件：色谱柱：WatersCORTECSC18分析柱(4.6×150mm， 2.7μm)；流动相为乙腈(B):水(A)，梯度洗脱0～10min：10～17％B，10～15min：17～90％B； 检测波长240nm，流速为0.8mL·min^-1，进样量为10μL，柱温30℃。

(3)六味地黄丸浓缩丸生药粉校正集样品和验证集样品的近红外原始光谱数据采集

精密称取六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末2g，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫 反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm^-1，扫描光谱范围为 4000-10000cm^-1，每批样品扫描重复扫描4次，取平均光谱。六味地黄丸浓缩丸生药粉粉末 近红外原始吸收光谱图见附图1。

(4)近红外原始光谱的预处理

运用偏最小二乘(PLS)法建立样品中3个检测指标的近红外定量分析模型。模型建立 前对校正集光谱进行异常点判别，以提高模型精度，同时原始光谱在平滑、微分等适宜的光 谱预处理方法下来消除仪器背景或漂移对信号的影响，选择合适的波段提取有效信息，减少 计算量，缩短建模时间。六味地黄丸浓缩丸生药粉原始光谱采用OPUS软件提供的大量预处 理方式，包括一阶导数、二阶导数、多元散射校正、Norris平滑、减去一条直线、SNV中1 至2种方法的结合等方法对光谱有效信息进行提取。根据模型参数参数，最终各关键检测指 标的光谱预处理方式如下：

1)六味地黄丸浓缩丸生药粉水分含量模型采用减去一条直线光谱预处理；

2)六味地黄丸浓缩丸生药粉浸出物含量模型采用消除常数偏移量光谱预处理；

3)六味地黄丸浓缩丸生药粉的马钱苷含量模型采用矢量化归一(SNV)的光谱预处理； (5)选择六味地黄丸浓缩丸生药粉各检测指标建模波段，建立近红外校正模型

六味地黄丸浓缩丸生药粉药材的近红外光谱经过光谱预处理后，其建模波段选择：水分 模型建模波段为9403.7-7498.3cm^-1和6102-4246.7cm^-1；浸出物模型建模波段为7502.1-4597.7 cm^-1；马钱苷含量模型建模波段为7502.1-4246.7cm^-1。应用化学计量学软件将所得的近红外光 谱信息与参比方法所测得的标准值进行关联，采用偏最小二乘(PLS)法建立近红外光谱与 上述各检测指标之间的定量校正模型；

建模过程中，随机选择约三分之二的样本作为校正集，剩余的样本作为验证集用于预测。 模型采用相关系数(R)、相对分析误差(RPD)、交叉验证均方根(RMSECV)和主成分数 (Factor)四个参数考察模型性能，同时采用预测相对偏差(RSEP)来评价模型对未知样品 的预测能力，当R值接近于1，当RPD值大于2.5且越大评价模型性能越好，预测准确度高，当 RSEP值小于10％时评价模型具有较好的预测能力，能够满足六味地黄丸浓缩丸生药粉快速检 测的要求。

表1为3个检测指标的近红外模型的建模结果比较，从表1可以看出，3个检测指标的近红 外模型的线性良好，相关系数均在0.90以上，RPD值在2.5以上，说明所建立的近红外定量校 正模型效果较好。水分含量的实测值和预测值之间的相关图见附图2，浸出物含量的实测值和 预测值之间的相关图见附图3，马钱苷含量的实测值和预测值之间的相关图见附图4。

表1六味地黄丸浓缩丸生药粉各关键检测指标含量模型参数汇总

(6)校正模型的验证

将3个定量校正模型分别用于预测验证集样品中水分、浸出物、马钱苷的含量。水分含量 的实测值和近红外预测值的比较见附图5，浸出物含量的实测值和近红外预测值的比较见附图 6，马钱苷的含量实测值和近红外预测值比较见附图7，可以看出六味地黄丸浓缩丸生药粉的3 个检测指标的含量实测值与近红外预测值接近。

表2为3个不同检测指标的近红外模型预测结果的参数汇总，从表2可看出水分、马钱苷模 型的RMSEP均在1.0以下，水分、浸出物、马钱苷含量模型的RSEP均在10％以内，说明所建 立的3个检测指标的近红外分析模型具有较好的预测能力和稳定性。

表2六味地黄丸浓缩丸生药粉各检测指标的模型预测结果

(7)测定待测的六味地黄丸浓缩丸生药粉样品(140108、140109、140110批次)的近红外 光谱值，导入步骤(5)所建校正模型，经模型计算得到待测样品中水分、浸出物、马钱苷的 预测含量。

(8)使用以上方法预测得到的六味地黄丸浓缩丸生药粉水分含量≤16.0％，浸出物含量≥ 24.0％，马钱苷含量≥0.24％，则判断该六味地黄丸浓缩丸生药粉为合格样品，符合质量要求， 可以投入提取等后续生产环节。

按本实施例步骤(2)的测定方法，分别测定批次140108(样品编号1-5)、140109(样 品编号6-10)、140110(样品编号11-15)的样品的水分含量、浸出物含量、马钱苷含量值及 其近红外吸收光谱值，将近红外光谱值导入本实施例步骤(5)所建立的校正模型，经模型计 算得到待测样品中水分、浸出物、马钱苷的预测含量，其预测值与实测值的对比表如下表3：

表3六味地黄丸浓缩丸生药粉的关键检测指标实测值与预测值

本发明提出的一种六味地黄丸浓缩丸生药粉多指标快递检测方法，结果表明，使用本方 法可以对六味地黄丸浓缩丸生药粉的水分、浸出物、马钱苷含量进行快速分析。本方法省时、 无损，提高生产效率和经济效益，为药材的质量控制提供新的方法，从六味地黄丸浓缩丸的 生产源头控制其质量水平，保证制剂成品的安全、可靠。