紫背浮萍水溶性提取物在促进反硝化微生物反硝化活性中的应用

技术领域

本发明属于硝酸盐污染水体的控制技术研究领域，具体涉及一种紫背浮萍水溶性提取物的制备方法，以及在促进反硝化微生物反硝化活性中的应用。

背景技术

2010年第一次全国污染源普查公报表明，农业源的硝酸盐污染已超过工业源成为我国水体总氮污染的主要来源，引起了河流和湖泊水体富营养化，导致地表水污染和地下水硝酸盐超标，严重威胁人体健康。从长远角度来看，过量的硝酸盐会导致整个生态群落结构和多样性的变化。因此，农业废水和肥水的净化处理目前已成为水处理领域新的研究热点。

浮萍是一种全世界范围内普遍存在的水生植物，尤其漂浮在静止或慢速流动的水面。由于其高效的氮磷营养盐去除能力，浮萍一直以来就是治理硝酸盐污染水体的理想植物材料。近年来，浮萍还可作为一种低成本的清洁能源，应用于环境中重金属和有机污染物吸附降解。除了对污染物的物理吸收，植物本身就是一个巨大的碳库。研究发现香蒲和小麦秸秆等植物在发酵和消化后，本身体内的代谢产物能促进微生物的反硝化作用，主要是为反硝化细菌提供了营养性的有机碳源。然而，这些研究在投入大量碳源的同时，也会附加地导致水体中BOD浓度的升高，从而引起一系列其他的环境问题。

植物残体也属于根际沉积物，对环境有添加效应，如果浮萍本身提取物中包含量更大且促进效果更好的非营养性信号功能物质，将在水环境治理中有更大的实际应用价值，同时也将很好地解决上述直接利用植物材料而造成水体BOD高的问题。而且，浮萍生长迅速，生物量巨大(10～50吨干重/公顷·年)，在野外时需要人工定期收获和清理，所以因地制宜地利用浮萍植物来加速硝酸盐污染水体的净化，是一种便捷、经济的生态处理手段。已有研究发现浮萍脂溶性提取物中的脂肪酸酸类化合物有促进反硝化微生物脱氮活性的功能。但目前，浮萍水溶性提取物作为信号在促进反硝化活性方面的应用尚未报道，也未见以紫背浮萍为原料制备活性提取物的技术。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种紫背浮萍(Spirodelapolyrrhiza)水溶性提取物在促进反硝化微生物反硝化活性中的应用。

技术方案：紫背浮萍水溶性提取物在促进反硝化微生物反硝化活性中的应用。

上述反硝化微生物为施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)。

上述紫背浮萍水溶性提取物的制备方法包括以下步骤：将干燥的紫背浮萍研磨至细粉，体积比4:1的甲醇/水混合液提取，过滤，滤液旋转蒸发；将上步所得提取物总组分用水稀释，乙酸乙酯提取3次；将提取后的剩余水溶液用1mol/LHCl调节pH至2.0，乙酸乙酯提取3次；将提取后的剩余水溶液用1mol/LNaOH调节pH至12.0，乙酸乙酯提取3次；将提取后的剩余水溶液用1mol/LHCl调节pH至6.5，冷冻干燥，即得紫背浮萍水溶性提取物。

上述甲醇/水混合液用量为紫背浮萍质量的50-120倍，提取条件为15-25℃和120rpm提取16-24h。

上述紫背浮萍水溶性提取物添加浓度为5-60mgL^-1。试验结果表明，紫背浮萍水溶性提取物具有显著的反硝化促进效应，在添加浓度为5-60mg·L^-1时对施氏假单胞菌的硝酸盐还原速率有约25-135％的促进效果。

促进反硝化微生物反硝化活性的组合物，有效成分为紫背浮萍水溶性提取物。

有益效果：(1)本发明在紫背浮萍原有化学成分和传统功效的研究基础上，进一步揭示紫背浮萍水溶性活性提取物具有促进反硝化微生物反硝化活性的新用途，为环境保护中的硝酸盐污染水体治理提供新型的净化增效剂。

(2)本发明“变废为宝”，因地制宜地利用浮萍植物提取物来增强硝酸盐污染水体的处理效率，有效避免了河流湖泊中大量浮萍漂浮引起的水质恶化问题。

(3)本发明提供一种植物源“绿色”硝酸盐去除促进剂，不含有机溶剂，主要起信号调控作用，环境友好，安全无毒，成本低廉，为构建高效处理硝酸盐污染水体的生物生态技术提供新的方法和思路。

附图说明

图1为本发明的紫背浮萍水溶性提取物的分离步骤示意图。

图2为不同浓度紫背浮萍水溶性提取物对施氏假单胞菌硝酸盐还原速率的影响示意图(mean±SE,n＝3)。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1、紫背浮萍水溶性提取物的制备

紫背浮萍水溶性提取物通过以下步骤获得：

(1)取冷冻干燥后的紫背浮萍，研磨至细粉，称取约0.50g放入150mL三角瓶，加50mL甲醇/水混合液(体积比4:1)，在20℃，120rpm摇床条件下提取16h。提取液通过WhatmanGF/F玻璃纤维滤膜真空抽滤，滤液随后在35℃旋转蒸发除去甲醇，剩余水溶液冷冻干燥，得提取物总组分。

(2)分离步骤见图1，将(1)中所得提取物总组分用水稀释至50mL，调节pH至6.5左右，50mL乙酸乙酯分3次提取，合并提取液，得提取物脂溶性中性组分；用1mol/LHCl调节剩余溶液pH至2.0，50mL乙酸乙酯分3次提取，合并提取液，得提取物脂溶性酸性组分；用1mol/LNaOH调节剩余溶液pH至12.0，50mL乙酸乙酯分3次提取，合并提取液，得提取物脂溶性碱性组分。用1mol/LHCl调节剩余水溶液pH至6.5，并冷冻干燥，即得紫背浮萍水溶性提取物(约50mg)。

2、紫背浮萍各组分提取物对施氏假单胞菌硝酸盐去除的影响比较

2.1实验设计

(1)提取物各组分由上述步骤中分离获得，其中水溶性提取物用无菌水溶解过0.22μm滤膜待用，而提取物总组分、酸性提取物、中性提取物和碱性提取物分别离心浓缩后溶解于CH₂Cl₂中，过0.22μm滤膜待用。

(2)微生物菌株：施氏假单胞菌ATCC17588(Pseudomonasstutzeri)购于美国典型菌种保藏中心(Americantypeculturecollection)。

(3)LB培养基：10g/Ltryptone，5g/Lyeastextract，10g/LNaCl，pH7.0。

(4)反硝化培养基：6.0g·L^-1KNO₃，1.5g·L^-1KH₂PO₄，4.2g·L^-1Na₂HPO₄，0.1g·L^-1MgSO₄·7H₂O，27.0g·L^-1Na₂C₄H₄O₄·6H₂O，微量溶液5mL(2.2g·L^-1ZnSO₄·7H₂O，5.54g·L^-1CaCl₂，5.06g·L^-1MnCl₂·4H₂O，1.1g·L^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄·7H₂O，1.57g·L^-1CuSO₄·5H₂O，1.61g·L^-1CoCl₂·6H₂O，5.0g·L^-1FeSO₄·7H₂O，63.69g·L^-1EDTA-2Na)，pH7.0。

(5)生物活性实验

收集在LB培养液中活化20h的施氏假单胞菌，离心10min(5,000g，4℃)，然后重新悬浮于无菌的反硝化培养液中。1mL施氏假单胞菌菌液和10μL各组分(总组分、水溶性提取物、脂溶性酸性提取物、脂溶性中性提取物和脂溶性碱性提取物)，添加到含有19mL反硝化培养液的50mL三角瓶中，在摇床中30℃，120rpm培养。初始硝酸盐浓度为60mM，对照为添加10μL的无菌水或10μLCH₂Cl₂，实验设置3个重复。培养72h后，在不同时间点吸取1mL菌液离心10min(10,000g)，上清液测定硝酸盐(NO₃^-)含量(紫外分光光度法)。施氏假单胞菌NO₃^-还原速率(表征反硝化活性的指标)和NO₃^-还原促进率(％)的计算方法如下：

(6)数据分析

数据处理结果均以(mean±SD)表示，采用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析及组间两两比较。

2.2实验结果

由表1可知，添加10μL紫背浮萍提取物总组分后，施氏假单胞菌的硝酸盐还原速率显著高于CH₂Cl₂对照，表明紫背浮萍提取物具有促进反硝化微生物脱氮的潜力。将总组分按照极性分离后发现，水溶性提取物具有最高的促进率，其硝酸盐去除速率为3.17mM/h，约为水对照的2.3倍。另外脂溶性组分中，酸性和中性提取物也显著促进了施氏假单胞菌的硝酸盐还原速率，约为CH₂Cl₂对照的1.5和1.3倍。然而，碱性提取物却略有抑制效应，可能是因为不同提取物组分中活性成分不同，而碱性组分中含有特定的反硝化抑制物质。综上可知，紫背浮萍水溶性提取物具有最好的硝酸盐还原促进效应，即良好的净化硝酸盐污染水体的应用潜力。

另外，由于添加10μL各组分到反硝化培养液中，测得培养基中总有机碳浓度(TOC)约为50-60mg/L，相对于反硝化培养液中碳源TOC(4440mg/l)占1.0-1.3％。因此，本发明的水溶性提取物主要是起生理生化信号作用激活反硝化活性，而不是简单提供反硝化微生物的碳源来促进其生长。

表1紫背浮萍各组分提取物对施氏假单胞菌硝酸盐去除的影响

*不同的小写字母表示组间有显著差异(P<0.05,LSDtest)

3、不同浓度紫背浮萍水溶性提取物对施氏假单胞菌硝酸盐去除速率影响

3.1实验设计

分别添加5,10,20,30,40,60mg·L^-1的紫背浮萍水溶性提取物于反硝化培养液中，再添加1mL施氏假单胞菌菌液，于摇床中30℃，120rpm培养，对照为无菌水。培养72h后，菌液按照2.1中方法离心，上清液测定NO₃^-浓度，计算各处理后的硝酸盐还原促进率(％)。

3.2实验结果

本发明紫背浮萍水溶性提取物在添加浓度为5-60mg·L^-1时，对施氏假单胞菌的硝酸盐还原速率有约25-135％的促进效果(图2)。由于添加30mg·L^-1浓度时，硝酸盐还原促进率为135％，已达最高值；超过30mg·L^-1，促进率略为降低。所以考虑到成本，建议在应用过程中水溶性提取物的添加量为30mg·L^-1左右，同时为应用于其他反硝化菌株的剂量作参考。