忍冬藤中5-O-4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基奎宁酸含量测定方法

技术领域

本发明涉及中医中药技术领域，特别涉及一种忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量测定方法。

背景技术

中药材忍冬藤为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝，秋、冬二季采收。味甘，性寒，具有清热解毒，疏风通络的功效，用于温病发热，热毒血痢，痈肿疮疡，风湿热痹，关节红肿热痛。其化学成分主要包括有机酸类、三萜类、环烯醚萜类、黄酮类、挥发油类等。

经过长期研究，发现忍冬藤中含有一种咖啡酰奎宁酸糖苷：5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，经HR-ESI-MS、2D NMR技术确定该化合物结构式如下：

该成分为绿原酸的单葡萄糖苷，是忍冬藤的主要成分之一，其含量甚至超过了《中国药典》2015年版一部忍冬藤药材项下控制的绿原酸含量，有必要进行定量测定。但目前对5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的研究仅限于定性分析，含量测定方法鲜有报道。研究发现，忍冬藤直接以水超声提取后，该成分稳定性差，24h后含量测定值下降一半，无法满足对样品稳定性的要求(24h内基本稳定)；加热回流提取后，样品溶液稳定性较好，但含量测定值过低，远远不能反映药材中该成分的真实含量，应当是剧烈的提取条件对目标成分造成了破坏。因此，测定忍冬藤药材中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的真实含量，是一项具有挑战性又十分有意义的工作。

发明内容

忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量测定时，因目标成分稳定性差导致测定不准确。为了解决以上问题，本申请提供了一种加样回收率在95.0％～105.0％范围内，测定数值能够准确地反映忍冬藤原药材中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量的测定方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量测定方法，包括以下步骤：

(1)取供试品忍冬藤药材粉末，在150±10℃加热8分钟～15分钟，放冷，加水50mL，密塞，称定重量，超声功率500W，频率40kHz处理15分钟～45分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，收集续滤液；

(2)精密吸取续滤液，注入液相色谱仪，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数比0.1％～1％的酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→20min：乙腈8％→15％，酸溶液92％→85％，检测波长为216±2nm、292±2nm、316±2nm或327±2nm，以外标法或标准曲线法测定供试品溶液中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量。

优选步骤(2)中的酸溶液为冰醋酸溶液、甲酸溶液或磷酸溶液。

所述的含量测定方法，优选忍冬藤药材粉末过五号筛。

所述的含量测定方法，优选忍冬藤药材粉末取0.125g～0.25g。

所述的含量测定方法，优选忍冬藤药材粉末在150℃加热10分钟。

所述的含量测定方法，优选步骤(1)中超声处理时间为30分钟。

所述的含量测定方法，优选外标法或标准曲线法中使用的对照品通过以下步骤得到：

(1)取忍冬藤药材500g，粉碎成粗粉，加8倍量体积分数为50％的甲醇溶液，超声功率500W，频率40kHz提取2次，每次0.5小时，合并提取液并滤过，以旋转蒸发仪回收提取溶剂至干，得干浸膏a；

(2)干浸膏a加等量水使溶解，以D101大孔吸附树脂柱进行纯化，柱填料用量为干浸膏重量的2倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，收集洗脱液并合并，以旋转蒸发仪回收溶剂至干得干浸膏b；

(3)干浸膏b加等量水使溶解，以Sephadex LH-20凝胶柱进行纯化，柱体积为样品水溶液体积的15倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，以40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，以旋转蒸发仪回收溶剂至干，以Sephadex LH-20凝胶柱反复纯化2次，得到干浸膏c；

(4)干浸膏c加水使溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，经半制备HPLC纯化，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.4％冰醋酸溶液，体积比4:96，327nm检测，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥后可得5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，按照峰面积归一化法计算，纯度大于98％。

对照品溶液的制备：取5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品适量，精密称定，加水制成质量浓度为30μg/mL的溶液，即得。

所述的含量测定方法，优选标准曲线法中标准曲线为y＝1.5205x-2.1952，相关系数r＝1.0000，x为进样量，取值范围30～3100ng，y为峰面积。

所述的含量测定方法，优选加样回收率为95.0％～105.0％。

所述的忍冬藤药材为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝。

所述的梯度洗脱方式为梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH，以期将层析柱上不同的组分在合理的时间内洗脱出来的方法。

有益效果：

1)本发明方法制备的忍冬藤供试品溶液稳定性好，24h测定值基本稳定；

2)加样回收率在95.0％～105.0％范围内，测定数值能够准确地反映原药材中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的含量；

3)方法操作简便，步骤简单；供试品溶液和对照品溶液的制备过程中未用到有机试剂，降低了分析成本。

附图说明

图1为5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸紫外吸收光谱图；

图2为实施例1的2.3项下5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品的HPLC色谱图；

图3为实施例1的2.3项下忍冬藤药材供试品溶液的HPLC色谱图；

图4为5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸标准曲线(横坐标为进样量，纵坐标为峰面积)。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。

实施例1

1仪器与试药

仪器：Sartorius CP225D电子天平；DGG-9070B电热鼓风干燥箱；Agilent 1200高效液相色谱仪。

对照品及来源：如发明内容部分中方法自制5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，以峰面积归一化法测定，含量大于98％。

试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，水为Millipore制备的纯化水，其他试剂均为分析纯。

2色谱条件

2.1对照品溶液的制备精密称取5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品15.36mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(0.1536mg/mL)。精密量取上述对照品贮备液10mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为30.72μg/mL的对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备取待测忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件

5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸紫外吸收光谱图见图1。在216、292、316nm波长处有最大吸收。考虑到咖啡酰奎宁酸类成分常以327nm作为测定波长，而5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸在327nm也有较大吸收，最终选择327nm作为测定波长。

色谱柱：Dikma Technologies PLATISIL^TM>

精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、2.2项下供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，进行测定。结果5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸峰型较好，理论板数、分离度、对称因子均符合相关要求，证明该色谱条件可行。色谱图见图2、3。

3供试品溶液制备方法的考察

3.1提取溶剂的考察

供试品溶液的制备分别取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，分别精密加水、50％甲醇、50％乙醇、甲醇各50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、上述供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量(以干燥品计算；经烘干法测定，方法学研究用忍冬藤水分为7.39％)。结果见表1。

表1 提取溶剂考察结果

由测定结果可知，以水为提取溶剂时目标成分色谱峰面积最大，含量测定结果最高，所以应采用水作为提取溶剂。

但在考察过程中发现，随时间的推移，水提液中目标成分含量下降明显，24h后峰面积降低一半(见表2)，忍冬藤水提液中可能存在某些酶，可以将目标成分降解。研究发现，通过对忍冬藤样品进行前处理，将上述酶类灭活，可以增加水提液中目标成分的稳定性。

3.2样品前处理方法及稳定性考察

3.2.1前处理方法的考察

方法一(直接水煮)：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50mL，密塞，称定重量，回流提取30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法二(改变pH值)：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加pH为2.0的盐酸溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法三(直接加热)：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热20分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.2.1项下各提取供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，每隔4h进样一次，测定供试品溶液24h稳定性，计算含量。结果见表2。

表2 不同前处理方法样品稳定性试验结果

根据表2测定结果，水直接超声样品稳定性较差，目标成分24h测定含量下降一半！使用不同的样品前处理方法后，提取液中目标成分稳定性增强：水煮提取后稳定性最好，24h测定含量几乎不变，但其测定值较低，可能是水煮过程中对目标成分造成了破坏；pH2.0的盐酸溶液提取后含量测定值较高，但稳定性不足(RSD＞2.0％)；样品直接加热后再提取得到的供试品溶液稳定性好，24h测定值RSD≤2.0％，而且含量测定值较高。

综上，采用直接加热的方式对忍冬疼药材进行前处理，可以增加供试品溶液中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的稳定性。

3.2.2前处理温度的考察

取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，分别在100、150、200℃加热20分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.2.2项下供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，每隔4h进样一次，测定供试品溶液24h稳定性，计算含量。结果见表3。

表3 不同前处理温度样品稳定性试验结果

根据表3测定结果，100℃处理后样品溶液稳定性不足，而200℃处理后测定含量过低，150℃处理后稳定性较好，含量较高。故前处理温度选择150℃。

3.2.3前处理时间的考察

取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，分别在150℃加热5、10、20分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.2.3项下供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，每隔4h进样一次，测定供试品溶液24h稳定性，计算含量。结果见表4。

表4 不同前处理时间样品稳定性试验结果

根据表4测定结果，前处理5min后样品溶液稳定性不足，前处理10min和20min后24h含量测定稳定性均较好，RSD≤2.0％，两者相比，前处理10min含量测定值更高。故前处理时间选择10min。

3.2.4样品前处理方法

综上，采用如下前处理方法可以增加忍冬藤样品中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的稳定性(24h内测定数值RSD≤2.0％)：取本品粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷。

3.3提取时间的考察

取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)15、30、45分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.3项下供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表5。

表5 提取时间考察结果

由上述结果可见，三种超声时间测定结果没有显著性差异。为了确保目标成分的完全提取，同时兼顾节约能源，选择提取时间为30分钟。

3.4取样量的考察

分别取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.125、0.25、0.375g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液10μL、3.4项下供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表6。

表6 取样量考察结果

由上述结果可见，取样量为0.375g时测定结果偏低，另外两种取样量测定结果没有显著性差异。为了确保取样的均匀性，确定取样量为0.25g。

3.5供试品溶液的制备

综上所述，供试品溶液的制备方法如下：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4线性关系的考察

取2.1项下对照品溶液，分别精密吸取各1、2、5、10、15、20μL，2.1项下对照品贮备液各5、10、15、20μL，注入液相色谱仪，分别测定峰面积积分值。以5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。测定结果见表7。

表7 线性关系考察结果

回归方程y＝1.5205x-2.1952，相关系数r＝1.0000。x为进样量，取值范围30-3100ng，y为峰面积。

试验结果表明，5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸进样量在30.72～3072.00ng之间进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。见图4。

5仪器精密度试验

精密吸取2.1项下对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测其峰面积积分值。结果见表8。

表8 精密度试验结果

试验结果显示仪器精密度良好。

6方法重复性考察

供试品溶液的制备：取待检忍冬藤粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，照3.5项下方法制成供试品溶液，平行制备6份。

分别精密吸取2.1项下的对照品溶液10μL、上述供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表9。

表9 重复性考察结果

6份样品测定结果RSD≤2.0％，表明含量测定方法的重复性良好。

7加样回收率试验

供试品溶液的制备：取已测知含量的忍冬藤粉末适量(5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量为7.114mg/g)，取约0.125g，精密称定，平铺于具塞锥形瓶中，在150℃加热10分钟，放冷，精密加2.1项下对照品贮备液5mL、水45mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行制备6份。

分别精密吸取2.1项下的对照品溶液10μL、上述供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表10。

表10 加样回收率考察结果

6份样品加样回收率平均值在95.0％～105.0％范围内，RSD≤2.0％，表明测定方法的回收率良好。

8样品测定

按照3.5项下方法制备供试品溶液，对所收集到的8批样品进行测定，结果见表11。

表11 样品含量测定结果(按照干燥品计算)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。