黄芩苷在制备妊娠合并糖尿病胎儿心脏发育保护药物中的应用

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及黄芩苷在制备妊娠合并糖尿病胎儿心脏发育保护药物中的应用。

背景技术

近年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯及生活方式的改变，妊娠合并糖尿病的发病率在全球都呈逐年上升的趋势，成为各国的公共健康问题。葡萄糖可以通过胎盘屏障，妊娠合并糖尿病的胎儿实质是处于一个高葡萄糖的环境，报道称糖尿病妊娠的胎儿的先天畸形发生率高于非糖尿病妊娠2-5倍，主要表现为先天性心脏病和神经系统异常。

妊娠合并糖尿病患者是一类特殊的人群，主要治疗措施是胰岛素治疗来降低体内血糖浓度。由于胎儿的肝脏发育不完善，药物及降解产物排泄延，且排除的部分代谢产物，可因“羊水肠道循环”被胎儿重吸收，容易在体内蓄积，影响胎儿组织器官的发育。在妊娠期间，即使对母体无严重的不良反应的药品也可能对胎儿产生毒性作用。当前治疗糖尿病的口服药物包括二甲双胍，甲糖宁及氯磺丙脲等都明确说明了孕妇不宜使用。

祖国医学中，服用中药保护胎儿正常生长发育，防止流产、早产、畸形已有悠久的历史，积累了丰富的临床经验，在临床治疗方面突出了自身的优势。黄芩为传统安胎名药，药源广泛，价格低廉，无明显毒副作用。黄芩的抗菌抗病毒、抗炎、抗过敏、降脂、保肝、利胆是其清热燥湿的药理学基础；镇静、解毒、利尿、降血压、抗氧化、抗肿瘤等是其泻火解毒的现代依据。黄芩适合妊娠期服用，因具有抗炎、抗氧化、镇静、降压、舒张血管平滑肌等药理作用， 可以提高胎盘血供。不但对复发性流产、妊高症、宫内生长迟缓等具有防治作用，同时可减少产时、产后感染，有利产后子宫的止血及复旧过程。黄芩苷(Baicalin)是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，分子式为C₂₁H₁₈O₁₁，分子量为446.35，具有一定脂溶性，可以通过胎盘屏障。具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态、解痉及较强的抗癌反应等生理效能，在临床医学已占有重要地位，当前已有多个厂家生产黄芩苷片，主要应用于急、慢性肝炎，迁延性肝炎的辅助治疗，对孕妇及哺乳期妇女用药并不明确。

黄芩苷的专利多集中在其提取技术上，例如一种提高黄芩毛状根黄芩苷产量的方法(201410143966.0)，一种快速高效提取黄芩苷的方法(201410502598.4)，一种生物酶法生产黄芩苷的提取方法(201510156727.3)等。在黄芩苷的应用方面，多集中在其抗炎、抗菌方面的专利，例如黄芩苷在制备口腔护理品中的应用(201310489646.6)，黄芩苷在制备保护靶器官药物中的用途(200910004166.X)等。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄芩苷的新用途，不仅扩大了黄芩苷的应用范围，提高了其应用价值，还有助于进一步开发新的药物，比如以黄芩苷为先导化合物，通过结构修饰或改造，或有望进一步提高其活性或降低副作用。

为实现本发明目的，本发明的技术方案是：

提供中药单体黄芩苷在制备妊娠合并糖尿病胎儿心脏发育保护药物中的新用途。

所述药物为药学上可接受的任何剂型，可含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

黄芩虽然为传统安胎名药，但是其提取物黄芩苷对于妊娠期糖尿病胎儿的保护作用尚不明确。当前治疗妊娠合并糖尿病主要采用胰岛素治疗，但是价格相对高，有的患者会存在过敏反应，会导致新生儿低血糖症。口服降糖药包括 二甲双胍，甲糖宁及氯磺丙脲等都明确说明了孕妇不宜使用。因此当前并无安全的口服药物保护妊娠合并糖尿病胎儿的心脏发育。本发明发现一定浓度黄芩苷不会导致胚胎发育畸形，并且能够有效缓解高糖环境诱导的胚胎心脏发育不良。本发明所述的中药单体黄芩苷分子式为C₂₁H₁₈O₁₁，分子量为446.35，结构式如图1所示。本发明提供了黄芩苷或其作为先导化合物合成出来的修饰物可以作为药物制剂的原料，与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂一起制成药学上可接受的任何剂型、并具有保护妊娠合并糖尿病胎儿心脏发育作用的药物的新用途。

本发明应用鸡胚建立妊娠合并糖尿病胎儿的模型(Cell Cycle:14(5):772-783.2015)，发现高糖环境可以通过介导细胞自噬和抑制GATA4等关键基因的表达导致胚胎心脏畸形，这为本发明提供了一个良好的研究保护妊娠合并糖尿病胎儿发育药物的在体模型。

本发明采用中药单体黄芩苷进行了鸡胚试验，结果证明，一定浓度黄芩苷不会导致鸡胚发育畸形，并且能够有效缓解高糖环境诱导的胚胎心脏发育不良，具体具有以下优点：

(1)一定浓度黄芩苷不会影响鸡胚发育。

(2)黄芩苷会显著改善高糖环境导致的胚胎死亡及发育畸形。

(3)黄芩苷会显著改善高糖环境导致的心管发育畸形，调节相应心管发育基因。

(4)黄芩苷会显著改善高糖环境诱导的细胞凋亡。

附图说明

图1为黄芩苷的化学结构。

图2为不同浓度黄芩苷对胚胎早期发育的影响。

图3为不同浓度黄芩苷对高糖环境下胚胎早期发育的影响。

图4为黄芩苷对高糖环境下心管发育的影响。

图5为黄芩苷对高糖环境下鸡胚细胞自噬和凋亡的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明实施例所述的中药单体黄芩苷购自Santa Cruz(sc-204638)。

实施例1：一定浓度黄芩苷不会影响鸡胚发育

采用Early chick(EC)Culture的方法培养早期鸡胚，将鸡胚分为正常组(0.1％二甲基亚砜DMSO)和黄芩苷组(DMSO溶解黄芩苷)。黄芩苷用DMSO溶解后，所用实验组工作液DMSO浓度低于0.1％。将不同浓度的黄芩苷加入到EC Culture后培养鸡胚至HH11期(0μM：n＝30，3.125μM：n＝30，6.25μM：n＝30，12.5μM：n＝27和25μM：n＝30)。发现3.125μM，6.25μM的黄芩苷对26h，39h和48h的胚胎发育基本没有明显影响，与正常组胚胎(0μM)形态相似(图2中的A-C3)，体节数(判断鸡胚早期发育阶段的标志性结构)没有统计学有意义(p>0.05)。12.5μM，25μM条件下的鸡胚部分基本正常发育，有部分发育滞后(图2中的C2，C3)，48h体节对数与正常组相比减少(p<0.01，图2中的G)；并且有的鸡胚出现了严重畸形(图2中的H-I)，12.5μM黄芩苷严重畸形率为33.33％，25μM黄芩苷的严重畸形率为50％(图2中的J)。

实验证实，在鸡胚模型中，6.25μM以下浓度的黄芩苷不影响胚胎早期发育。

实施例2：黄芩苷会显著改善高糖环境导致的胚胎死亡及发育畸形。

基于我们已经建立的妊娠糖尿病鸡胚模型(Cell Cycle:14(5):772-783.2015)，我们设立鸡胚正常组(0.1％DMSO)，高糖组(50mM葡萄糖)，黄芩苷低浓度组(6.25μM)，黄芩苷中浓度组(6.25μM)4组(n＝10)，在4组EC Culture中培养鸡胚至HH11期，进行发育时期和畸形率的统计。从图3中的A-A1我们可以观察到正常组胚胎发育良好，形态正常；高糖处理组的部分胚胎(图3中的B-B3)在48h明显观察到严重的畸形(50％，图3中的B3)，胚胎发育滞后(图3中的 E)，体节对数与正常组相比减少(p<0.001)；高糖环境下，3.125μM黄芩苷处理的胚胎(图3中的C-C3)也有较严重的畸形，发生率为50％，胚胎发育滞后并未得到恢复(图3中的E-F)，体节对数与正常组相比减少(p<0.001)；高糖环境下，6.25μM黄芩苷处理的胚胎(图3中的D-D3)大部分可以看到胚胎发育时期和形态的恢复，严重畸形率为20％(图3中的E-F)，体节对数与正常组相比无显著性差异(p>0.05)。

实验证实，在鸡胚模型中，6.25μM浓度的黄芩苷显著改善高糖环境导致的胚胎发育不良。

实施例3：黄芩苷会显著改善高糖环境导致的心管发育畸形，调节相应心管发育基因。

采用MF-20的免疫荧光对鸡胚心管形态进行观察。我们可以看到正常组和6.25μM黄芩苷处理的胚胎在HH11⁺心管呈现C形环化(图4中的A-B)，而高糖处理组严重畸形的胚胎出现了心管融合异常(图4中的C)，应用黄芩苷处理后得到恢复的胚胎，其心管呈现正常C形环化。随后我们采用RT-PCR的方法检测了心管分化基因VMHC，中胚层粘附基因N-Cadherin和心管分化调控基因BMP2的mRNA水平，我们发现6.25μM黄芩苷对VMHC，N-Cadherin和BMP2的mRNA水平并没有明显影响(p>0.05)，而高糖环境会抑制以上基因的表达(p<0.01)。在高糖环境下，应用黄芩苷干预可以显著恢复VMHC，N-Cadherin和BMP2的mRNA表达水平(p<0.01，图4中的E-E1)。采用Western>

实验证实，在鸡胚模型中，6.25μM浓度的黄芩苷显著改善高糖环境导致的胚胎发心管畸形和心管发育重要基因表达。

实施例4：黄芩苷会显著改善高糖环境诱导的鸡胚细胞凋亡

基于高糖环境会导致细胞自噬水平和细胞凋亡的增加，应用Western blot的方法，检测细胞自噬蛋白LC3B和Beclin1的表达情况，我们发现6.25μM黄芩苷虽然会促进LC3BⅡ/LC3BⅠ和Beclin1，但是结果并没有显著性差异(图5，P>0.05)，而高糖环境会显著促进会促进LC3BⅡ/LC3BⅠ和Beclin1(图5，P<0.01,P<0.05)。在高糖环境下，应用黄芩苷干预抑制LC3BⅡ/LC3BⅠ和Beclin1，虽然与高糖组相比，结果无统计学差异，但是与正常组相比，差异也不显著(P>0.05)。同时，我们发现高糖环境会显著促进C-caspase3的表达(图5，P<0.001)，黄芩苷不影响C-caspase3的表达(图5，P>0.05)，在高糖环境下应用黄芩苷干预后，C-caspase3的表达明显降低(图5，P<0.01)。

实验证实，在鸡胚模型中，6.25μM浓度的黄芩苷显著改善高糖环境诱导的细胞凋亡。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。