一种墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的快速繁殖方法

技术领域

本发明属于兰科植物组织培养技术领域，具体涉及一种墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的快速繁殖方法。

背景技术

墨兰(Cymbidium sinense)为兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)地生兰类多年生草本花卉，为五大传统国兰之一，其叶片飘逸秀美，花瓣香气浓郁，花色多变，花期冬季至早春，具有很高的观赏价值和经济价值。因其多在春节前后开花，又称报岁兰，其传统的分株繁殖方法，繁殖系数极低，一般每年只能增殖1～3倍。

虎头兰(Cymbidium hookerianum)是兰科兰属附生性多年生草本植物。原产于我国西南地区，主要分布在贵州、西藏、云南、四川等省区，世界各国多有引种栽培。目前我国虎头兰的种苗、成品花大多从日本、韩国及我国台湾地区引进。虎头兰叶长碧绿，花茎斜生，花浅黄绿色、表面有紫红色条纹或小斑点，花形似“虎头”，十分典雅，因而具有很高的观赏价值，是世界著名的“兰花新星”，深受各国人民的喜爱。但是，虎头兰主要采取传统的分株方法进行繁殖，其繁殖率低，周期长，远不能满足花卉市场需求。

大花蕙兰是兰属的多代杂交种，虎头兰是大花蕙兰原始杂交亲本材料之一，二者均为附生兰。近年，有关附生兰与地生兰的杂交育种研究工作取得了一些进展，一些杂交兰可通过杂交种子无菌萌发成苗，但是，由于基因型不同，附生兰与地生兰的杂交兰对培养基营养成分、激素配比等要求不同，还存在着繁殖系数低，长势差、生根困难等问题。

运用生物技术快速繁殖名优国兰已有一些报道，翁锦周等(亚热带植物科学，2006，35(3)37～38)以墨兰(Cymbidium sinense)地下根状茎段为外植体，探讨不同浓度活性炭对其离体培养的影响。结果表明，在MS+NAA2.0mg/L+l0％椰汁的培养基中加入1.0g/L活性炭对原球茎的诱导 效果最好；MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭4.0g/L适合于不定芽分化；在1/2MS+NAA 1.0mg/L+BA 0.5mg/L+l0％椰汁的培养基中加入0.5～3.0g/L活性炭有利于提高成苗率，但是，该诱导培养基用于墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的组织培养中，外植体稍膨大却并未形成原球茎。

曹受金以虎头兰茎尖、茎段和叶为外植体开展了组培研究，结果表明：适宜的原球茎诱导培养基：KC+5mg/L 6-BA+0.5(或1.0)mg/L NAA+0.5～1％蔗糖；茎尖的原球茎诱导率为38～75％；茎段的原球茎诱导率为48～78％；叶的原球茎诱导率为5～16％；增殖培养基：KC+5mg/L BA+0.1(或0.5)mg/L NAA+0.2蛋白胨；原球茎的鲜重増加率为50～58％(曹受金，北方园艺，2007(3)：167～169)，但是，该诱导培养基用于墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的组织培养中，也未获得原球茎。

“红美人”是墨兰红樱姬与虎头兰的杂交品种，株型漂亮，花期长，集花大、花香、花色艳美于一体，目前，其繁殖方式主要为常规分株繁殖，一年只能得到1～3倍的增殖速度，繁殖系数低，周期长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的组培快速繁殖方法，以杂交兰无菌苗基部组织为材料，诱导原球茎进行增殖、分化，壮苗、生根，培养程序简单，繁殖系数大，速度快，生产成本低，种苗质量高，便于工厂化生产。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)诱导培养

取墨兰与虎头兰的杂交兰无菌苗，切去根及顶部叶片，取基部组织0.5～0.8cm，剥去1～2层叶鞘，接种于诱导培养基中，光照培养45～60d，获得杂交兰原球茎；

其中，所述的诱导培养基包括：MS培养基，6-苄氨基腺嘌呤2.0～6.0mg/L，萘乙酸0.5～3.0mg/L，激动素0.5～1.5mg/L，毒莠定0.2～0.5mg/L，水解酪蛋白0.5～1.5g/L，活性炭0.1～0.5g/L，蔗糖20～40g/L和琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.8；

2)增殖培养与分化

取步骤1)获得的杂交兰原球茎，进行切割，以2～4个原球茎为一团，接种于原球茎增殖与分化培养基中，培养30～60d，形成新生原球茎，新生原球茎再分化成不定芽；

其中，所述的增殖与分化培养基包括：MS培养基，6-苄氨基腺嘌呤2.0～3.0mg/L，激动素0.2～0.5mg/L，萘乙酸0.5～1.0mg/L，水解酪蛋白0.5～1.5g/L，活性炭0.1～0.5g/L，蔗糖30～40g/L和琼脂粉5.5～6.5g/L，pH＝5.4～5.8；

3)壮苗与生根培养

将步骤2)获得的不定芽切成单芽，接种于壮苗与生根培养基中，在带瓶盖的培养瓶中培养25～35d，获得生根试管苗；

4)试管苗移栽

将步骤3)获得的生根试管苗带瓶盖常温条件下炼苗5～7d，然后打开瓶盖再炼苗2～3d，将生根试管苗取出，去除基部残留的培养基，移栽于基质中，浇水后保持温度25±2℃，空气湿度70～80％。

进一步，步骤3)所述壮苗与生根培养基包括：1/2MS培养基，6-苄氨基腺嘌呤0.1～0.2mg/L，吲哚丁酸0.5～1.5mg/L，萘乙酸0.2～0.5mg/L，蔗糖20～30g/L，琼脂粉5.5～6.5g/L和活性炭0.1～0.5g/L，pH＝5.4～5.8。

又进一步，步骤4)所述的基质为泥炭：椰壳＝1～3：1，质量比。

优选地，所述的墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的品种为红美人。

如无特殊说明，本发明所述的单位mg/L或g/L是指在1升培养基中各组分的含量，1/2MS是指MS培养基中的无机盐成分减半。

本发明的诱导培养步骤1)中，以杂交兰的基部组织为外植体，取材方便，诱导率高。本发明在诱导培养基中添加含量为0.5～1.5g/L的水解酪蛋白，水解酪蛋白为培养物提供丰富的营养物质，添加后可将诱导培养的时间提前10～15d，先形成的新生原球茎再分化成不定芽，且原球茎培养物生长健壮。

本发明的增殖与分化培养基中，添加了多种植物生长激素，合理调节植物生长激素配比，相互之间能起到配合协同作用，6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和激动素(KT)是细胞分裂素类物质，本发明添加较高浓度的 6-BA，可直接促进细胞分裂、分化，促进芽的形成，萘乙酸(NAA)为生长素类物质，具有促进外植体诱导愈伤组织或生根的作用，低浓度的NAA对6-BA、KT的促进细胞分裂、分化具有辅助作用，将原球茎的增殖与分化步骤合二为一，不需进行转接，不需另外配制培养基，简化了培养过程，缩短了培养时间。

本发明在诱导、增殖与分化阶段加入了0.5～1.5g/L的水解酪蛋白，由于多种氨基酸的复合效应，可增强培养物对培养基中其他营养物质的吸收利用，加入少量的活性炭，既控制外植体褐化，又不影响其对营养和激素的吸收，使得培养物生长茂盛。生根阶段，减少了水解酪蛋白的添加量，为生根苗逐渐适应外界条件起了一个缓冲的作用，在生根培养基中添加6-BA 0.1～0.2mg/L，可以保持培养物生长旺盛，对促进壮苗也有一定的积极作用。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

1)采用本发明方法进行杂交兰组织培养快速繁殖种苗，诱导原球茎数量多、繁殖系数大，单个原球茎的增殖系数在8以上，可达9.6，增殖速度快，移栽成活率高。

2)采用本发明方法进行杂交兰快速繁殖，合理调节好激素配比，将原球茎的增殖与分化步骤合二为一，不需进行转接，不需另外配制培养基，大大降低了配制培养基的药品、试剂，还降低了配制培养基和接种的人力成本。

3)利用本发明繁育杂交兰种苗，种苗质量好，能保持本品种特征特性，控制好繁殖周期，可减少接种和培养基配制方面的人力成本，还可以减少生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例1获得的原球茎。

图2为本发明实施例1中原球茎分化的不定芽。

图3为本发明实施例1中获得的生根试管苗。

图4为本发明实施例1获得的红美人杂交兰小苗。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1

一种墨兰与虎头兰的杂交兰的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)诱导培养

取墨兰与虎头兰的杂交后代“红美人”无菌苗，切去根及顶部叶片，取基部组织0.6cm，剥去外面1～2层叶鞘，接种于诱导培养基；进行光照培养，培养50d，获得杂交兰原球茎(参见图1)，原球茎诱导率达83.3％；

其中，诱导培养基为：MS+6-BA 5.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA1.0mg/L+PIC 0.3mg/L+水解酪蛋白1.0mg/L+活性炭0.1g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6；

2)增殖培养与分化

取步骤1)获得的杂交兰原球茎，进行切割，接种于原球茎增殖与分化培养基中，培养20d后原球茎开始增殖，40d后形成大量新生原球茎，增殖系数达9.6，45d后，先形成的原球茎逐渐分化成大量不定芽(参见图2)；

其中，增殖与分化培养基为MS+6-BA 3.0mg/L+KT 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+水解酪蛋白1.0g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.2g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6；

3)壮苗与生根培养

将步骤2)获得的不定芽切成单芽，接种于壮苗与生根培养基中，培养30d后，获得生根试管苗(参见图3)；

其中，壮苗与生根培养基为1/2MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+水解酪蛋白0.2g/L+活性炭0.2g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6；

4)试管苗移栽

将步骤3)获得的生根试管苗带瓶盖常温条件下炼苗5d，然后打开瓶盖再炼苗3d，将生根试管苗取出，去除基部残留的培养基，移栽于泥炭： 椰壳＝2：1的基质中，浇水，保持温度25±2℃，空气湿度80％左右，移栽1个月后，红美人杂交兰小苗全部成活(参见图4)。

实施例2

一种墨兰与虎头兰的杂交兰的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)诱导培养

取墨兰与虎头兰的杂交后代“红美人”无菌苗，切去根及顶部叶片，取基部组织0.8cm，剥去外面1～2层叶鞘，接种于诱导培养基；进行光照培养，培养53d，获得杂交兰原球茎，原球茎诱导率达75.0％；

其中，诱导培养基为：MS+6-BA 4.0mg/L+KT 1.5mg/L+NAA1.0mg/L+PIC 0.2mg/L+水解酪蛋白1.0mg/L+活性炭0.4g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6；

2)增殖培养与分化

取步骤1)获得的杂交兰原球茎，进行切割，接种于原球茎增殖与分化培养基中，培养20d后原球茎开始增殖，40d后形成大量新生原球茎，增殖系数达8.4，45d后，先形成的原球茎逐渐分化成大量不定芽；

其中，增殖与分化培养基为MS+6-BA 2.5mg/L+KT 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+水解酪蛋白1.0g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.2g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6；

3)壮苗与生根培养

将步骤2)获得的不定芽切成单芽，接种于壮苗与生根培养基中，培养30d后，获得生根试管苗；

其中，壮苗与生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+水解酪蛋白0.2g/L+活性炭0.2g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6；

4)试管苗移栽

将步骤3)获得的生根试管苗带瓶盖常温条件下炼苗7d，然后打开瓶盖再炼苗3d，将生根试管苗取出，去除基部残留的培养基，移栽于泥炭：椰壳＝3：1的基质中，浇水，保持温度25±2℃，空气湿度80％左右，移栽1个月后，红美人杂交兰小苗全部成活。

对比例1

取墨兰与虎头兰的杂交后代“红美人”无菌苗，切去根及顶部叶片，取基部组织0.6cm，剥去外面1～2层叶鞘，接种于墨兰的诱导培养基：MS+NAA 2.0mg/L+椰汁l0wt％+活性炭1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6；进行光照培养，培养50d，外植体稍膨大而未形成原球茎。

说明墨兰的组织培养过程中使用的诱导培养基不适用于墨兰与虎头兰的杂交兰无菌苗基部繁殖，这可能与墨兰和虎头兰的杂交兰的基因型及外植体类型不同有关。

对比例2

取墨兰与虎头兰的杂交后代“红美人”无菌苗，切去根及顶部叶片，取基部组织0.6cm，剥去外面1～2层叶鞘，接种于虎头兰的诱导培养基:MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭0.1g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6；进行光照培养，培养50d，未获得杂交兰原球茎。

对比例3

取墨兰与虎头兰的杂交后代“红美人”无菌苗，除增殖与分化培养阶段中增殖与分化培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+活性炭0.5g/L+琼脂粉6.0g/L，pH＝5.6，增殖培养25d后原球茎开始增殖，40d后增殖系数为4.4，其余步骤与本发明实施例1相同。