目的基因转化甜樱桃的方法及其在甜樱桃原生质体瞬时转化中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中目的基因转化甜樱桃的方法及其在甜樱桃原生质体中瞬时表达目的基因中的应用。

背景技术

甜樱桃(Prunus avium L.)是一种深受人们喜爱，且是具有较高的营养价值及医疗保健作用的水果。果实的色泽是影响果品商品性与价值性的重要因素之一，对影响果实色泽形成调控基因的研究，有助于揭示果实着色的分子机理。广泛应用于再生植株的胚性愈伤组织是游离原生质体的良好试材。没有细胞壁的原生质体细胞在信号转导途径及代谢过程等方面与完整的植物细胞或组织基本相同。植物的原生质体作为现代生物技术的重要工具，是遗传转化的理想受体，可用于所转基因的细胞器定位、功能研究及蛋白互作研究等，同时也为在细胞水平上研究植物的信号转导、基因表达和生理反应等提供了便利。

目前尚未在甜樱桃本属植物中建立高效的稳定遗传转化体系，影响了甜樱桃重要候选基因的功能验证和研究。因此建立高效的甜樱桃原生质体瞬时转化体系具有实际意义，为甜樱桃重要候选基因的研究分析和遗传转化提供了技术支持。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何在甜樱桃原生质体中进行目的基因的瞬时表达。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了甜樱桃原生质体瞬时转化方法。

本发明所提供的甜樱桃原生质体转化方法，包括以甜樱桃原生质体为受体进行甜樱桃转化；

所述甜樱桃原生质体为利用甜樱桃果肉制备的原生质体。

上述方法中，利用甜樱桃果肉制备原生质体的方法可包括：

A1)将甜樱桃果肉愈伤组织进行悬浮继代培养，得到悬浮细胞；

A2)用纤维素酶和果胶酶酶解所述悬浮细胞得到所述甜樱桃原生质体。

上述方法中，所述将甜樱桃果肉愈伤组织进行悬浮继代培养包括：将所述甜樱桃果肉愈伤组织在悬浮系继代培养基中进行悬浮继代培养，得到悬浮细胞；

所述悬浮系继代培养基为向MS培养基中加入BA、NAA、维生素C和蔗糖得到的培养基；所述悬浮系继代培养基中所述BA、所述NAA、所述维生素C和所述蔗糖的浓度可分别为1.0mg/L、0.3mg/L、3mg/L和质量百分比浓度3％，pH为5.85。

上述方法中，所述A1)具体可包括：研磨所述甜樱桃果肉愈伤组织，得到研磨物；将所述研磨物在所述悬浮系继代培养基中进行继代培养，得到所述悬浮细胞。

上述方法中，所述研磨甜樱桃果肉愈伤组织可为用网筛研磨所述甜樱桃果肉愈伤组织。所述网筛可为不锈钢网筛，如40目不锈钢网筛。

上述方法中，所述以甜樱桃原生质体为受体进行甜樱桃原生质体转化可为用含有目的基因的侵染液侵染所述甜樱桃原生质体。所述用含有目的基因的侵染液侵染所述甜樱桃原生质体可为利用PEG介导的原生质体瞬时表达方法完成所述侵染。

上述方法中，所述侵染时间可为5-25min，如10min或15min。

上述方法中，所述悬浮继代培养的次数可大于等于2次，每次悬浮继代培养的时间可为7-10d，如8d。所述悬浮继代培养可在黑暗、120r/min下进行。所述悬浮继代培养的温度可为22-24℃。

上述方法中，所述用纤维素酶和果胶酶酶解所述悬浮细胞前还可包括将所述悬浮细胞用CPW13M进行处理；所述CPW13M为向细胞-原生质体清洗液(cell protoplastwash medium，以下简称CPW溶液)中加入甘露醇得到的甘露醇的质量百分比浓度为11％-15％的溶液(如13％)。

上述方法中，用所述CPW13M处理所述悬浮细胞的时间可为0.5-2h。用所述CPW13M处理所述悬浮细胞的浸泡时间具体可为1h。

上述方法中，所述纤维素酶、所述果胶酶和所述CPW13M处理的悬浮细胞的比例可为1000U:50U:10mL。

上述方法中，所述A2)可包括A21)和A22)：

A21)用含有所述纤维素酶和所述果胶酶酶的酶液浸泡所述悬浮细胞，得到酶-原生质体混合液；

A22)将所述酶-原生质体混合液加至CPW25S上，得到下层为CPW25S上层为酶-原生质体混合液的分层液体1；将所述分层液体1进行离心，使原生质体位于所述分层液体1的界面处，分离原生质体，得到所述甜樱桃原生质体；

所述CPW25S为向所述细胞-原生质体清洗液中加入蔗糖得到的溶液；所述CPW25S中蔗糖质量百分比浓度为23％-27％(如25％)。

上述方法中，所述酶液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为所述CPW溶液，所述溶质及其浓度分别为100000U/L所述纤维素酶、5000U/L所述果胶酶、0.6mol/LD-mannitol、1.0％(质量百分比浓度)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.1％(质量百分比浓度)MES和0.1％(质量百分比浓度)BSA，pH为5.8。

上述方法中，用所述酶液浸泡所述悬浮细胞可在弱光(如500lux以下)、22-24℃、50r/min下进行。用所述酶液浸泡所述CPW13M处理的悬浮细胞的时间可为16-20h，如18h。

上述方法中，所述纤维素酶可为Cellulase R-10。所述果胶酶可为PectolaseY-23。所述Cellulase R-10具体可为北京拜尔迪生物技术有限公司产品，货号为L0012。所述Pectolase Y-23具体可为北京拜尔迪生物技术有限公司产品，货号为aov0093。

上述方法中，所述甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法可包括：将甜樱桃果肉在诱导培养基上进行诱导培养得到甜樱桃果肉愈伤组织；

所述诱导培养基为向MS培养基中加入BA、2,4-D和蔗糖得到的固体培养基；

其中，所述诱导培养基中BA、2,4-D和蔗糖的浓度分别可为2mg/L、1mg/L和3％(质量百分比浓度)。

上述方法中，所述诱导培养可在22-24℃、黑暗下进行。所述诱导培养的培养时间可为7-21d，如14d。

上述方法中，所述甜樱桃果肉具体可为10-40DAFB(盛花后天数，Day after fullbloom)的甜樱桃果实的果肉，如34DAFB的甜樱桃果实的果肉。

上述方法中，所述甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法还可包括将所述甜樱桃果肉愈伤组织在继代培养基上进行继代培养；

所述继代培养基为向MS培养基中加入BA、NAA和蔗糖得到的固体培养基；

其中所述继代培养基中BA、NAA和蔗糖的浓度分别可为3mg/L、1.5mg/L和3％(质量百分比浓度)。

上述方法中，所述继代培养可在22-26℃、黑暗下进行。所述继代培养的培养时间可为7-21d，如14d。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述P1或P2的方法：

P1、所述利用甜樱桃果肉制备原生质体的方法；

P2、所述甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1或M2的产品：

M1、用于制备甜樱桃原生质体的成套试剂，为所述CPW13M、所述CPW25S、所述细胞-原生质体清洗液、所述纤维素酶、所述果胶酶酶、所述诱导培养基、所述继代培养基中的至少两种；

M2、用于诱导甜樱桃果肉愈伤组织的成套试剂，为所述诱导培养基和/或所述继代培养基。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

X1、所述甜樱桃转化方法在甜樱桃中瞬时表达目的基因中的应用；

X2、所述利用甜樱桃果肉制备原生质体的方法在甜樱桃中瞬时表达目的基因中的应用；

X3、所述甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法在甜樱桃中瞬时表达目的基因中的应用；

X4、所述产品在甜樱桃中瞬时表达目的基因中的应用；

X5、所述甜樱桃转化方法在植物基因功能验证中的应用；

X6、所述利用甜樱桃果肉制备原生质体的方法在植物基因功能验证中的应用；

X7、所述甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法在植物基因功能验证中的应用；

X8、所述产品在植物基因功能验证中的应用；

X9、所述甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法在制备甜樱桃原生质体的中的应用；

X10、所述甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法在甜樱桃转化中的应用；

X11、所述利用甜樱桃果肉制备原生质体的方法在制备甜樱桃原生质体的中的应用。

本发明中，所述甜樱桃具体可为‘红灯’樱桃。

本发明中，所述悬浮系继代培养基可为无菌培养基。所述诱导培养基可为无菌培养基。所述继代培养基可为无菌培养基。所述CPW13M可为无菌液体。所述酶液可为无菌液体。所述CPW25S可为无菌液体。

实验证明，本发明的甜樱桃转化方法能将目的基因在甜樱桃，尤其是甜樱桃的果肉中进行瞬时表达，并使目的基因得到表达：对照中绿色荧光信号分布在整个原生质体细胞中，而转化目的基因PacMYBA基因的甜樱桃原生质体中绿色荧光信号集中在细胞核区域，表明PacMYBA基因在细胞核区域有表达，与PacMYBA基因在自然情况下的表达特点一致。本发明的甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法能制备甜樱桃愈伤组织：利用本发明的甜樱桃果肉愈伤组织的制备方法得到的愈伤组织颜色淡黄、质地松脆、表面有颗粒状凸起，镜检观察到细胞为圆形细胞，并且经多次继代培养后形态稳定，增殖能力强。本发明的甜樱桃原生质体的制备方法能制备高质量的由细胞膜包裹着的圆球状甜樱桃原生质体。

实验证明，本发明的甜樱桃转化方法可以将目的基因在甜樱桃，尤其是甜樱桃的果肉中进行瞬时表达，可以用来进行目的基因的功能验证及蛋白质和细胞器的定位，还可用来检测蛋白质互作及细胞代谢。本发明建立了高效的甜樱桃原生质体瞬时转化体系，为甜樱桃重要候选基因的研究分析和遗传转化提供了技术支持。

附图说明

图1为甜樱桃果肉愈伤组织的外观。A为甜樱桃果肉刚接种；B为甜樱桃果肉接种后7d；C为甜樱桃果肉接种后14d；D为甜樱桃果肉接种后21d；E为甜樱桃果肉接种后28d；F为继代培养五次的甜樱桃果肉愈伤组织。Bar＝2mm。

图2为甜樱桃果肉愈伤组织悬浮系。

图3为酶解悬浮系细胞。A为酶解前的悬浮系细胞；B为酶解后的悬浮系细胞。

图4为甜樱桃原生质体的镜检和纯化。A为未经纯化的原生质体镜检结果；B为纯化过程中的分层情况，1为酶解液，2为原生质体层，3为残渣及CPW25S；C为纯化后的原生质体镜检结果。

图5为目的基因在甜樱桃原生质体中的表达情况。A1为暗场下转化E3025的甜樱桃原生质体；A2为明场下的转化E3025的甜樱桃原生质体；A3为明暗叠加场下的转化E3025的甜樱桃原生质体；B1为暗场下的转化E3025-PacMYBA的甜樱桃原生质体；B2为明场下的转化E3025-PacMYBA的甜樱桃原生质体；B3为明暗叠加场下的转化E3025-PacMYBA的甜樱桃原生质体。Bars＝15μm。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的‘红灯’樱桃(P.avium L.cv.Hong Deng)，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。

下述实施例中的载体E3025为将pSAT6–RFP–N1载体中的RFP基因替换为GFP基因，保持其他序列不变得到的载体，载体E3025表达绿色荧光蛋白GFP。其中pSAT6–RFP–N1载体记载在文献(Sang-Min Chung et al.A versatile vectorsystem for multiple gene expression in plants.TRENDS in Plant Science Vol.10No.8August 2005)中。公众可从申请人处获得载体E3025，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的诱导培养基为向MS培养基中加入BA、2,4-D、蔗糖和琼脂得到的无菌固体培养基；其中BA、2,4-D、蔗糖和琼脂的浓度分别为2mg/L、1mg/L、3％(质量百分比浓度)和7.5g/L。

下述实施例中的继代培养基为向MS培养基中加入BA、NAA、蔗糖和琼脂得到的无菌固体培养基；其中BA、2,4-D、蔗糖和琼脂的浓度分别为3mg/L、1.5mg/L、3％(质量百分比浓度)和7.5g/L。

下述实施例中的悬浮系继代培养基为向MS培养基中加入BA、NAA、维生素C和蔗糖得到的无菌液体培养基，其中BA、NAA、维生素C和蔗糖的浓度分别为1.0mg/L、0.3mg/L、3mg/L和3％(质量百分比浓度)，pH为5.85。

下述实施例中的CPW13M为向CPW溶液中加入甘露醇得到的甘露醇质量百分比浓度为13％的无菌溶液。CPW溶液由水和溶质组成，CPW溶液的溶质及其浓度分别为KH₂PO₄>3>2>4>4·5H₂O>

下述实施例中的酶液为溶质和溶剂；溶剂为CPW(cell protoplast washingmedium)，溶质及其浓度分别为100000U/L纤维素酶R-10、5000U/L果胶酶Y-23、0.6mol/L甘露醇、1.0％(质量百分比浓度)聚乙烯吡咯烷酮(PVP K-30)、0.1％(质量百分比浓度)MES和0.1％(质量百分比浓度)BSA，pH为5.8。Cellulase R-10为北京拜尔迪生物技术有限公司产品，货号为L0012。Pectolase Y-23为北京拜尔迪生物技术有限公司产品，货号为aov0093。

下述实施例中的W5溶液为由水和溶质组成的无菌溶液，W5溶液的溶质及其浓度分别为CaCl₂·2H₂O>

下述实施例中的CPW25S为向CPW溶液中加入蔗糖得到的蔗糖质量百分比浓度为25％的无菌溶液。

下述实施例中的MMg为由溶质和溶剂组成的无菌溶液；溶剂为水，溶质及其浓度分别为MgCl₂>

下述实施例中的PEG 4000水溶液为由溶质和溶剂组成的无菌溶液；溶剂为水，溶质及其浓度分别为PEG 4000 40％(质量百分比浓度)。

实施例1、甜樱桃原生质体中目的基因的瞬时表达

甜樱桃中目的基因的瞬时表达，包括利用甜樱桃转化方法将目的基因转至甜樱桃中，具体为用含有目的基因的侵染液侵染甜樱桃原生质体，完成甜樱桃转化。实验重复三次，每次重复实验的具体操作步骤如下：

一、甜樱桃原生质体的制备

1、甜樱桃果肉愈伤组织的制备

1.1外植体消毒

将34DAFB(盛花后天数，Day after full bloom)‘红灯’甜樱桃(P.aviumL.cv.Hong Deng)的幼果清洗干净，并用75％(体积百分比浓度)的乙醇水溶液表面消毒30s，然后用有效氯质量百分比为5％的次氯酸钠水溶液消毒13min，最后用无菌水冲洗3-4次，得到无菌幼果。

1.2甜樱桃果肉愈伤组织的诱导

用无菌滤纸将步骤1.1的无菌幼果表面的水吸干，在无菌条件下用镊子小心去除种皮，将幼果的果肉切成4mm见方小块后接种于诱导培养基上，而后在25±1℃下避光培养28d，得到甜樱桃果肉愈伤组织。

1.3甜樱桃果肉愈伤组织的继代培养

将步骤1.2的甜樱桃果肉愈伤组织接种于继代培养基上，而后在25±1℃下避光培养14d，得到继代培养的甜樱桃果肉愈伤组织，将该继代培养的甜樱桃果肉愈伤组织在25±1℃、黑暗下重复继代培养4次。

观察步骤1.2得到的甜樱桃果肉愈伤组织和步骤1.3的继代培养的甜樱桃果肉愈伤组织(图1)，甜樱桃果肉接种后得到的甜樱桃果肉愈伤组织颜色淡黄、质地松脆、表面有颗粒状凸起(图1中C和D)，镜检观察到细胞为圆形细胞，并且经多次继代培养后形态稳定，增殖能力旺盛(图1中F)。

2、甜樱桃原生质体的制备

2.1悬浮细胞的制备

用40目不锈钢网筛研磨实例1步骤1.3得到的甜樱桃果肉愈伤组织，得到研磨物，该研磨物(颗粒直径约40μm)；将研磨物在悬浮系继代培养基中悬浮继代培养7d，悬浮继代培养的条件为黑暗、120r/min下，温度为23±1℃，重复继代培养3次，得到悬浮系细胞(图2)。

2.2甜樱桃原生质体的制备

用CPW13M浸泡步骤2.1得到的悬浮系细胞1h，弃上层液体，得到CPW13M预处理的悬浮系细胞；按照CPW13M处理的悬浮细胞和酶液的体积比为1:10的比例向CPW13M预处理的悬浮系细胞中加入酶液，得到酶-悬浮细胞混合液，将酶-悬浮细胞混合液在弱光(500lux)、23±1℃、50r/min下孵育18h，得到酶解后的酶-悬浮细胞混合液(图3)；将酶解后的酶-悬浮细胞混合液用200目尼龙网筛轻轻研磨过滤，释放原生质体，得到酶-原生质体混合液。

按照下述方法纯化酶-原生质体混合液中的原生质体：将酶-原生质体混合液轻轻加至CPW25S上，过程轻柔缓慢，避免冲撞分界面，尽量使其保持稳定，得到下层为CPW25S上层为酶-原生质体混合液的分层液体；将分层液体在800rpm下离心6min，使原生质体位于所述分层液体的界面处(图4中B)，小心地将界面处的原生质体层吸出，得到甜樱桃原生质体；将甜樱桃原生质体置于新的离心管中，用CPW13溶液洗涤2-3次，每次洗涤均在800rpm下离心6min，最后用CPW13M溶液重悬甜樱桃原生质体，得到甜樱桃原生质体悬浮液。

将甜樱桃果肉原生质体进行镜检，结果如图4中A和C所示，结果显示，纯化后可得到高质量的由细胞膜包裹着的圆球状甜樱桃原生质体。

二、甜樱桃中目的基因的瞬时表达

1、目的基因的制备

将载体E3025的EcoR I和Sal I识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的PacMYBA基因(PacMYBA基因为甜樱桃基因)，得到重组载体E3025-PacMYBA-GFP。E3025-PacMYBA-GFP表达序列2所示的蛋白质。

其中，序列1为PacMYBA基因的序列，编码序列2所示的蛋白质。

2、甜樱桃原生质体中目的基因的瞬时表达

按照下述方法完成目的基因转化甜樱桃原生质体，并将载体E3025作为对照：

1)将步骤一种2得到的甜樱桃原生质体悬浮液于冰上放置30min后，于800rpm下离心6min，弃上清液，得到甜樱桃原生质体；向甜樱桃原生质体中加入300μLMMg重悬原生质体，得到甜樱桃原生质体MMg悬浮液；

2)向步骤1)的100μL甜樱桃原生质体MMg悬浮液中加入10μg步骤1的重组载体E3025-PacMYBA-GFP质粒，轻轻混匀，得到甜樱桃原生质体-E3025-PacMYBA-GFP混合液；向甜樱桃原生质体-E3025-PacMYBA-GFP混合液中加入110μL PEG 4000水溶液，混匀后得到待转化液；将待转化液于23℃下孵育15min进行原生质体的转化，得到原生质体的转化液；

3)向步骤2)的原生质体的转化液中加入440μL CPW13M，轻轻颠倒，得到转化后液体；将转化后液体于800rpm下离心6min，弃上清液，得到转化后的原生质体；

4)向步骤3)的转化后的原生质体中加入200μL W5溶液轻柔混匀后，再加入800μL W5溶液，然后于细胞培养板上、23±1℃、弱光(500lux)下孵育17h，得到转化15min的甜樱桃原生质体。

按照步骤1)-4)的方法，将孵育15min分别替换为孵育5、10、20和25min，其他步骤均不变，分别得到转化5、10、20和25min的甜樱桃原生质体。

激光共聚焦显微镜(OLYMPUS FLUVIEW FV1000,日本)下观察转化5、10、15、20和25min的甜樱桃原生质体中目的基因的瞬时表达情况，未见这几种甜樱桃原生质体中目的基因表达的显著性差异，其中转化15min的甜樱桃原生质体中目的基因的瞬时表达情况如图5所示。

结果显示，对照中绿色荧光信号分布在整个原生质体细胞中，而转化5、10、15、20和25min的甜樱桃原生质体中绿色荧光信号均集中在细胞核区域，表明PacMYBA基因在细胞核区域有表达，与PacMYBA基因在自然情况下的表达特点一致。上述结果表明，本发明的方法可以将目的基因在甜樱桃中进行瞬时表达，并可进行目的基因的功能验证。