miR-130a反义核酸及其衍生物在Hippo-YAP信号通路抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、细胞生物学和细胞信号转导领域，具体涉及一种微小RNA，即miR-130a反义核酸及其衍生物在Hippo-YAP信号通路抑制剂中的应用，及miR-130a反义核酸及其衍生物在预防或治疗与Hippo-YAP信号通路相关的过度生长性疾病中的应用，例如可开发为抗癌药物的应用。

背景技术

Hippo信号通路是一条进化上高度保守的细胞信号转导通路。Hippo信号通路的主要功能包括调控器官大小、组织再生以及干细胞功能等。而实现这些功能的细胞生物学基础是调控细胞增殖、细胞凋亡和干细胞及前体细胞的干性维持和分化。Hippo信号通路的核心是一个蛋白激酶链，由四个蛋白组成，在果蝇中为Hippo(Hpo)，Salvador(Sav)，Wts和Mats；哺乳动物中相应的为Mst1/2，Sav1，Lats1/2和Mob。其中Wts是第一个被发现的Hippo通路成员，在果蝇的遗传筛选实验中，发现Wts基因突变可导致组织的过度生长。在四个核心成员的上游，存在诸多蛋白对其进行调节，果蝇中最初发现的有Ex，Mer，Kibra等，而更上游受到Fat等的调节。核心成员的下游，Hippo信号通路可负调节一个转录辅激活因子，果蝇中为Yki，哺乳动物中为YAP/TAZ。YAP(Yes-associatedprotein)蛋白是Hippo通路的效应蛋白，在该通路中发挥着重要作用。TAZ是YAP的同源蛋白。Yki/YAP/TAZ作为转录辅激活因子，在Hippo通路处于抑制状态时，可以入核与转录因子结合，激活下游基因的表达；而当Hippo通路处于激活状态时，Yki/YAP/TAZ被Wts或Lats1/2磷酸化，滞留于细胞质中处于非活性状态并最终泛素化降解，从而抑制其活性。

研究表明，在小鼠中YAP转基因可以导致肝脏增大到小鼠体重四分之一大，并且停止YAP的诱导表达后肝脏恢复原来大小(引用文献：Jixin Dong,GeorgFeldmann,Jianbin Huang,Shian Wu,Nailing Zhang,Sarah A.Comerford,Mariana F.Gayyed,Robert A.Anders,Anirban Maitra,Duojia Pan，Elucidation of a UniversalSize-Control Mechanism in Drosophila and Mammals.Cell.2007Sep 21；130(6):1120-33)。然而持续性表达YAP转基因导致肝癌发生。在人的细胞中YAP/TAZ与促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、调控细胞干性和分化的活性密切相关。从癌症的种类来看，YAP在肝癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌，颅内室管膜瘤，髓母细胞瘤等中有基因扩增；TAZ在食道癌、乳腺癌等中也有基因扩增(引用文献：Zhao B,Li L,Lei Q,Guan KL,2010The Hippo-YAP pathway in organ sizecontrol and tumorigenesis:an updated version.Genes Dev 24:862-874)。从蛋白表达水平来看，YAP和TAZ在肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌和前列腺癌中均发现蛋白高表达以及核定位上升。YAP被发现在胰腺癌复发的过程中、在依赖于beta-catenin癌细胞的存活上具有重要的功能；TAZ被发现在维持乳腺癌干细胞的干性上具有独特的重要功能(引用文献：Moroishi T,Hansen CG,GuanKL.The emerging roles of YAP and TAZ in cancer.Nature reviews Cancer 2015,15(2):73-79.)。此外，Hippo信号通路的许多上游基因，在癌症样本中呈现不同程度的表达下调等失活现象，例如RASSF1A是在人类癌症中通过启动子甲基化失活的最明显的基因之一。还有几类特别值得注意的是：①2型神经性纤维瘤。在这一类肿瘤中NF2抑癌基因突变失活。NF2是Hippo通路的上游基因，它的缺失引起YAP激活，而在NF2突变诱导癌症的小鼠模型中，失活YAP等位基因中的一条就可以完全逆转NF2的癌症发生，证明了YAP活性在这类肿瘤中的重要性(引用文献：Zhang N,Bai H,David KK,Dong J,Zheng Y,Cai J,et al.TheMerlin/NF2tumor suppressor functions through the YAP oncoprotein to regulatetissue homeostasis in mammals.Dev Cell 2010,19(1):27-38.)。②在葡萄膜黑色素瘤中，约80％的病例含有GNAQ或GNA11的激活突变。这一突变导致YAP和TAZ的激活和癌症的发生，而YAP的失活抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤形成(引用文献：Yu FX,Luo J,Mo JS,Liu G,Kim YC,Meng Z,et al.Mutant Gq/11promoteuveal melanoma tumorigenesis by activating YAP.Cancer Cell 2014,25(6):822-830.)。可见，YAP作为原癌基因，对肿瘤细胞的增殖、凋亡、干性等方面起到重要作用，因此抑制YAP活性对抑制肿瘤具有显著的应用价值。

如前所述，转录辅激活因子(YAP/TAZ)是Hippo-YAP信号通路发挥功能调控细胞增殖、凋亡、干性、器官大小、再生等的关键效应分子，而TEAD家族转录因子被确认为是介导YAP/TAZ与DNA结合进而调控基因表达的重要蛋白。靶向YAP和TEAD的结合是抑制YAP活性的重要途径。一个小分子化合物verteporfin，可以通过干扰YAP和TEAD的相互作用，进而抑制肝肿大，为开发以Hippo-YAP信号通路作为靶点的特异性小分子靶向抗癌药提供了理论依据(引用文献：Liu-Chittenden Y,Huang B,Shim JS,Chen Q,Lee SJ,Anders RA,etal.Genetic and pharmacological disruption of the TEAD-YAP complex suppressesthe oncogenic activity of YAP.Genes Dev 2012,26(12):1300-1305.)。

微小RNA(microRNA，miR)是一类内源性的、长约21～23个核苷酸的非编码单链小RNA，参与多种重要的生理过程，如细胞增殖、分化、形态变化、凋亡等，微小RNA的表达具有组织特异性，在不同的组织中，微小RNA具有抑癌和促癌的双重作用，其中具有致癌作用的微小RNA被称为“oncomirs”，这些微小RNA可以通过碱基互补性结合到靶基因mRNA特别是3’端非翻译区，引起靶基因mRNA的降解或抑制靶基因mRNA的转译；具有促癌转移作用的微小RNA被称为“metastamirs”，这些微小RNA可以直接作用于肿瘤转移相关基因，从而影响肿瘤迁移以及侵袭能力(引用文献：胡思思、凌志强、葛明华，miR-130在恶性肿瘤中作用研究进展，《中国肿瘤》2014年02期，P136)。

近年来，针对微小RNA的修饰和递送载体的研发，使得微小RNA作为药物靶点的实用性大为增强。例如，使用2’-O-methyl(2’-OMe)、2’-O-methoxyethyl或2’-fluoro修饰提高稳定性；使用locked nucleic acid(LNA)，使用肽核酸PNA(peptide nucleic acid)；使用无机或有机的纳米颗粒或脂质体包裹作为递送载体；使用基于病毒的递送体系等。总之，这些方法都是基于使用模拟微小RNA的序列或其反义序列的核酸或核酸类似物片段，通过一定的方式递送到肿瘤细胞内，抑制或解除抑制该微小RNA靶基因的表达，达到抑癌效果。但是现有的抑制剂种类非常有限，抑癌效果缺乏深入的分析和实验验证，有待进一步的挖掘。

miR-130家族包括miR-130a和miR-130b，分别位于不同的染色体上。miR-130a定位于染色体11q12.1上，位于基因AP000662.4的内含子内；miR-130b定位于染色体22q11.21上，位于肽酰脯氨酰异构酶(亲环蛋白)样2基因(peptidylprolyl isomerase(cyclophilin)-like 2，ppil2)的外显子上。miR-130a和miR-130b的成熟序列都是由Dicer酶从发夹状转录前体的3’臂上切割得来，miR-130a的成熟序列是CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU，miR-130b的成熟序列是CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU，属于高度同源miRNA。笔者对现有的miR-130家族的相关研究进行文献检索，其研究成果概述如下：

(1)miR-130a和miR-130b虽属高度同源的miRNA，但在不同肿瘤中的表达具有明显的不同，例如在胶质母细胞瘤中miR-130a和miR-130b均有高表达，在食管癌中miR-130a高表达、miR-130b低表达，在膀胱癌中miR-130a低表达、miR-130b高表达(引用文献：吕娟、宋鑫，miR-130a/b与肿瘤关系的研究进展，《重庆医科大学学报》2014年第39卷第3期，P274)，二者具有显著差异。

(2)miR-130a和miR-130b对不同肿瘤中的癌基因靶向作用不同，或起到促癌作用，或起到致癌作用，二者的作用机制存在差异。

(3)目前已知的肿瘤中miR-130a和miR-130b的靶基因见下表1(引用文献：吕娟、宋鑫，miR-130a/b与肿瘤关系的研究进展，《重庆医科大学学报》2014年第39卷第3期，P275)，尚无文献报道miR-130a与Hippo-YAP信号通路中靶基因的关联性。

表1肿瘤中miR-130a、miR-130b的靶基因

(4)YAP/TAZ是Hippo-YAP信号通路发挥功能调控细胞增殖、凋亡、迁移等的关键效应分子，尚无文献报道miR-130a与YAP/TAZ的失活或激活的关联性。

(5)对miR-130家族尤其是miR-130a的修饰、或与递送载体相结合开发出针对Hippo-YAP通路的靶向抑制剂，尚属研究空白。

发明内容

本发明的目的在于：基于发明人原创性地发现微小RNA miR-130a是被YAP激活表达的靶基因，同时正反馈激活YAP/TAZ的作用机制，提供了miR-130a反义核酸及其衍生物在Hippo-YAP信号通路抑制剂中的应用，为以Hippo-YAP信号通路作为靶点的特异性靶向抗癌药的开发提供了可行性。

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

miR-130a反义核酸在Hippo-YAP信号通路抑制剂中的应用。

优选的，所述应用为miR-130a反义核酸抑制YAP或TAZ的活性，抑制Hippo-YAP信号通路靶基因的表达，抑制肿瘤细胞增殖、转移。

更优选的，所述miR-130a反义核酸抑制YAP或TAZ的活性，通过提高VGLL4蛋白水平、抑制YAP或TAZ与TEAD家族转录因子结合发挥作用。

优选的，所述miR-130a反义核酸为SEQ NO1的碱基序列，SEQ NO1：5’AUGCCCUUUUAACAUUGCACUG>

miR-130a反义核酸的衍生物在Hippo-YAP信号通路抑制剂中的应用。

优选的，所述miR-130a反义核酸衍生物为具有如下特征的核酸或核酸衍生物片段：(1)通过碱基配对的方式与miR-130a结合；(2)碱基配对为所有碱基完全配对，或为SEQ NO1中划线部分的碱基配对，其余部分碱基不配对；不配对的方式可以是替换为A、U、G、C任一碱基。

优选的，所述miR-130a反义核酸衍生物为具有化学修饰的核酸片段或肽核酸片段，例如2′-O-methyl，2′-O-methoxyethyl，2′-fluoro，locked nucleic acid(LNA)，肽核酸(PNA)等的核苷酸衍生物；化学修饰的作用，在于促进稳定性或细胞穿透性等药理学性质。

优选的，所述miR-130a反义核酸衍生物可通过如下步骤构建：

(1)合成编码三个重复的miR-130a反义核酸的引物及其反向引物如下：

正向：

5’GATCCATGCCCTTTTAACATTGCACTGCGATATGCCCTTTTAACATTGCACTGTCACATGCCCTTTTAACATTGCACTGTTTTTTG>

反向：

5’AATTCAAAAAACAGTGCAATGTTAAAAGGGCATGTGACAGTGCAATGTTAAAAGGGCATATCGCAGTGCAATGTTAAAAGGGCATG 3’；

(2)将正向和反向引物在缓冲液中混合加热到95℃，退火到室温，得退火产物；

(3)将慢病毒载体用BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切，回收；

(4)将步骤(2)所得的退火产物与步骤(3)酶切后的载体，在T4链接酶作用下连接并转化大肠杆菌；

(5)培养大肠杆菌，质粒抽提扩增，即得目标物。

本发明还提供了一种根据如前所述的应用获得的Hippo-YAP信号通路抑制剂，在制备治疗或预防与YAP或TAZ激活相关的过度生长性疾病的药物中的应用。作为Hippo-YAP信号通路抑制剂的有效成分，可以为SEQ NO1序列所示的miR-130a反义核酸RNA分子或其生物学活性上容许的衍生物。

优选的，所述与YAP或TAZ激活相关的过度生长性疾病包括但不限于2型神经纤维瘤、葡萄膜黑色素瘤、肝癌、肠癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、脑癌、胰腺癌或肺癌等。即，将Hippo-YAP信号通路抑制剂，应用于制备抗肿瘤药物。

本发明所述的miR-130a反义核酸及其衍生物，能够以体外合成的化学分子的形式，在转染试剂的作用下递送到培养的细胞内或动物体内发挥作用；也能够通过将含有编码上述RNA片段(即SEQ NO1)的DNA序列的表达质粒递送到细胞内实现，该质粒可以是普通表达质粒，通过转染试剂递送到细胞内。该质粒也可以是慢病毒、逆转录病毒、或腺病毒、腺相关病毒质粒，通过包装病毒颗粒，由病毒介导递送到细胞内或动物体内。

本发明关于miR-130a反义核酸衍生物的制备中，可以通过市售获得，也可以合成制得。制备的方式不局限，例如可以用市售A、C、G、U单体，按标准操作经使用DNA合成仪固相合成寡核苷酸单链；也可以用市售6-N-benzoyladenosine(A^Bz),4-N-benzoylcytidine(C^Bz),2-N-isobutyrylguanosine(G^iBu),和uridine(U)的5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2’-O-methyl-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)RNA亚磷酰胺单体，按标准操作经使用DNA合成仪固相合成2′-O-methyl寡核苷酸单链；还可以用市售其它核苷酸衍生物，按标准操作经使用DNA合成仪固相合成修饰的寡核苷酸单链；如需胆固醇偶联，还可以从带有胆固醇羟脯胺醇的可控孔玻璃固相支持上开始合成。

本发明中，miR-130a反义核酸衍生物，优选由载体携带的miR-130a的海绵体多拷贝反义核酸，其构建方式如前所述。

本发明提供的新用途，具有如下创新性：

本发明基于发现微小RNA(即miR-130a)是被YAP诱导的直接靶基因(见图1)，并且miR-130a通过直接抑制YAP的竞争性抑制分子VGLL4蛋白的翻译(见图2)进一步促进YAP的活性。miR-130a的反义核酸可以抑制YAP的活性、抑制细胞增殖、抑制非癌细胞向具有癌细胞活性的细胞转化、抑制癌细胞在小鼠体内形成肿瘤、抑制YAP异常激活诱导的器官大小变大和肿瘤发生。

因此，本发明是通过向细胞内递送miR-130a的反义核酸或其衍生物抑制YAP/TAZ活性，并作为Hippo-YAP信号通路抑制剂用于治疗或预防与YAP/TAZ激活相关的过度生长性疾病，例如癌症；包括但不限于2型神经纤维瘤、葡萄膜黑色素瘤、肝癌、肠癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、脑癌、胰腺癌或肺癌等。

必须说明的是，本发明中使用的miR-130a反义核酸，可以是与成熟miR-130a完全互补的核酸片段；也可以是含有miR-130a的种子序列互补序列(SEQ NO1下划线部分)的核酸片段；也可以是基于碱基配对原理，与miR-130a结合，从而起到抑制miR-130a功能的其它衍生物，例如但不限于肽核酸(PNA)。

附图说明

图1为YAP/TAZ直接诱导miR-130a的表达。

其中，1A：YAP过表达诱导miR-130a水平升高。在MCF10A乳腺细胞和HepG2肝癌细胞中用慢病毒感染介导YAP野生型或YAP 5SA激活突变体的稳定表达。构建的稳定细胞株用miRNA提取试剂盒进行microRNA抽提，随后用基于荧光定量PCR的特异的Taqman miR-130a探针试剂盒检测miR-130a的表达水平。

1B：YAP/TAZ敲减降低miR-130a表达水平。在MCF10A和HMLE细胞中，分别转染5nM对照或YAP/TAZ特异的siRNA，转染48h后用试剂盒抽提miRNA,检测方法同1A。

1C：TEAD稳定敲减降低miR-130a水平。在HepG2和HMLE细胞中使用慢病毒介导的TEAD1/3/4shRNA干扰TEAD1/3/4的表达。稳定细胞株用试剂盒抽提miRNA，检测方法同1A。

1D：YAP和TEAD直接结合miR-130a启动子。收集1X10⁷HepG2细胞，裂解后分别用TEAD或YAP特异性抗体或对照IgG进行染色质免疫沉淀(ChIP)。产物经蛋白酶分解蛋白质后酚氯仿提取DNA，作为模板用于荧光定量PCR检测。P4和P5是两对miR-130a近端启动子区域特异性引物。

1E：TEAD介导YAP与miR-130a启动子的结合。在HEK293T细胞中，共同转染YAP、TEAD2和miR-130a启动子报告基因质粒质。miR-130a的启动子报告基因质粒为野生型或预测的TEAD结合位点1、2、3、4的突变体。培养48h后用酶标仪进行荧光素酶活性检测。结果显示TEAD结合位点1、2介导YAP-TEAD与miR-130a启动子的结合。

1F：MST1/2条件敲除提高miR-130a表达水平。使用albumin(alb)-Cre进行MST1和MST2在小鼠肝脏中的条件性敲除。于两个月鼠龄取肝脏组织样品，用miRNA抽提试剂盒提取miRNA,检测方法同1A。

1G：YAP-5SA诱导肝脏成瘤。使用液态动力学注射通过小鼠尾静脉递送对照或YAP 5SA PB转座质粒和PB转座酶表达质粒。注射100天后取肝脏可见明显肿瘤。箭头所指向的是肿瘤。

1H：在YAP诱导的肝脏肿瘤中miR-130a表达水平上升而VGLL4蛋白水平降低。分别收集YAP-5SA诱导的肿瘤组织和癌旁组织对照，miRNA试剂盒抽提miRNA,荧光定量PCR检测miR-130a表达水平。平行样品用SDS裂解液裂解细胞用免疫印迹实验检测VGLL4的蛋白表达水平。

图2为miR130a抑制VGLL4的蛋白表达。

其中，2A：miR-130a调节VGLL43’UTR荧光素酶报告基因活性。HEK293T细胞转染野生型或者突变型VGLL43’UTR报告基因，同时共转miR-130a模拟物或者抑制体或空白对照。48小时后进行荧光素酶报告基因实验，用酶标仪读数。

2B：miR-130a模拟体抑制VGLL4蛋白水平。在MCF10A、MGC-803、HepG2、A549和HMLE细胞中，瞬转对照或者miR-130a模拟体，72h后收集蛋白样品用于免疫印迹实验。

2C：miR-130a稳定过表达抑制VGLL4蛋白水平。HepG2和HMLE细胞中，慢病毒稳定转染对照空载或者miR-130a过表达质粒，构建稳定细胞株收集蛋白样品用于免疫印迹实验。

2D：miR-130a抑制体上调VGLL4蛋白水平。在MCF10A、MGC-803和A549细胞中，瞬转对照或者miR-130a抑制体，72h后收集蛋白样品用于免疫印迹实验。

2E：miR-130a海绵体稳定过表达上调VGLL4蛋白水平。HepG2和HMLE细胞中，慢病毒稳定转染对照空载体或者miR-130a海绵质粒，构建稳定细胞株收集蛋白样品用于免疫印迹实验。

图3为miR-130a反义核酸分子抑制YAP和TAZ的活性。

其中，3A：miR-130a反义核酸(抑制体，inhibitor)抑制YAP靶基因的表达。在HepG2、HMLE和MGC-803细胞中，分别瞬时转染miR-130a对照和抑制体，Trizol抽提总RNA，荧光定量PCR检测CTGF和Cyr61基因mRNA表达水平。

3B：miR-130a海绵体抑制YAP靶基因的表达。在HepG2、HMLE和MGC-803细胞中，分别稳定转染miR-130a对照和海绵体，构建的稳定细胞用Trizol裂解抽提总RNA，检测方法同3A。

3C：miR-130a抑制对YAP靶基因的抑制作用依赖于VGLL4。HMLE细胞瞬时转染对照或VGLL4干扰RNA，24h后转染对照或miR-130a反义核酸，继续培养48h后Trizol裂解抽提总RNA，检测方法同3A。

3D：miR-130a抑制对YAP靶基因CTGF启动子活性的抑制作用依赖于VGLL4。在稳定表达CTGF荧光素酶报告基因的HEK293T细胞中，瞬时转染对照或VGLL4干扰RNA，同时转染对照或miR-130a反义核酸，继续培养48小时后进行荧光素酶报告基因实验，用酶标仪读数。

3E：miR-130a海绵体抑制YAP与靶基因启动子区域的结合。收集1X10⁷表达空载或者miR-130a海绵体的HepG2细胞用于染色质免疫沉淀实验，分别用TEAD/YAP或者对照IgG抗体将蛋白DNA复合物沉淀，蛋白酶分解蛋白质后酚氯仿提取DNA，荧光定量PCR检测CTGF启动子富集水平。

图4为miR-130a反义核酸分子抑制细胞增殖、器官大小、促进细胞凋亡。

其中，4A：miR-130a海绵体能够抑制YAP 5SA的促细胞生长作用。在HepG2细胞中稳定表达空载、YAP 5SA或共表达miR-130a海绵体，构建的细胞株种植在96孔板中，每孔1000个细胞，每个时间点设置三个复孔，0-9天每隔一天用Cell Titer Blue试剂染色法，酶标仪读数计算制如图生长曲线。

4B：抑制VGLL4表达能阻断miR-130a反义核酸对细胞生长的抑制作用。在HepG2细胞中瞬时转染对照和VGLL4干扰RNA，24h后再转染对照和miR-130a反义核酸，处理后继续培养48h，消化种植在96孔板中，检测方法同4A。

4C：抑制miR-130a能够促进细胞悬浮引起的凋亡。HepG2细胞瞬时转染对照和miR-130a反义核酸，24h后消化进行悬浮培养，继续培养48h后，收集细胞进行Annexin V染色，随后流式细胞仪上机检测凋亡率。

4D：miR-130a海绵体抑制MST1/2条件敲除引起的肝脏变大。在MST1/2条件敲除小鼠中注射表达Cre重组酶的腺病毒并同时注射对照或者miR-130a海绵体腺病毒，9天后处死，称重，计算肝脏/体重比如图。P值根据T检验计算所得。

4E：miR-130a海绵体抑制MST1/2条件敲除引起的肝细胞增殖。将同4D的肝脏样品冰冻切片，进行增殖标志Ki67的免疫染色，绿色代表阳性。

4F：miR-130a海绵体抑制了MST1/2敲除导致的YAP靶基因表达的升高和VGLL4蛋白的降低。将同4D的肝脏样品用Trizol裂解肝脏组织提取总RNA，荧光定量PCR检测YAP靶基因CTGF、Cyr61以及Inhba的表达情况，同时SDS裂解组织收集蛋白样品，免疫印迹试验观察VGLL4的蛋白量变化。

图5为miR-130a反义核酸分子抑制细胞癌症转化和肿瘤生长。

其中，5A：miR-130a反义核酸抑制YAP 5SA引起的细胞贴壁非依赖性生长(癌症转化)。HepG2细胞表达空载或者YAP 5SA质粒，分别转染对照或者miR130a反义核酸，转染24h后消化，分别取2.5X10⁴/孔在6孔培养板上作软琼脂克隆形成实验，上层琼脂浓度为0.33％，下层琼脂浓度为0.6％.每隔4天换液，培养20天后克隆用显微镜拍照以及结晶紫染色液染色，拍照并用ImageJ定量克隆数。

5B：miR-130a海绵体抑制YAP S127A的促肿瘤形成作用。表达YAPS127A的HepG2细胞感染对照或miR-130a海绵体，扩增后用于裸鼠皮下成瘤实验，每只小鼠下肢左右两个注射点，每个点200ul无血清培养基细胞悬液，细胞浓度为1×10⁷/ml。

5C：miR-130a海绵体降低YAP S127A诱导的肿瘤大小。实验同5B，将每个肿瘤称重后统计数值并作如图点状图。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实例中所有的实验材料、试剂和仪器均可市售获得，若未特别指明，本发明实例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实验材料：

miR-130a正义核酸和反义核酸购自上海吉玛公司。

VGLL4抗体购自abcam公司。

Tubulin抗体购自sigma公司。

Scramble siRNA和YAP/TAZ siRNA购自广州瑞博公司。

QPCR引物和CHIP引物全部购自Life公司。

PE Annexin V凋亡试剂盒购自BD公司。

转染试剂RNAIMAX和LIPO2000购自invitrogen公司。

Cell Titer Blue试剂盒购自promega公司。

实施例1：

实验名称：miR-130a反义核酸以及编码海绵体多拷贝反义核酸质粒均抑制YAP靶基因表达，并且通过VGLL4发挥作用。

CTGF和Cyr61是最被广为接受的YAP靶基因。利用实时荧光定量PCR检测CTGF和Cyr61的mRNA水平能够反映出miR-130a反义核酸以及海绵体多拷贝反义核酸质粒对两个靶基因的转录水平的影响，从而反映其对YAP活性的作用。

在HepG2、HMLE和MGC-803细胞中，分别稳定转染miR-130a多拷贝反义核酸质粒或瞬时转染miR-130a反义核酸，进行CTGF和Cyr61基因表达分析。

实验原理：

实时荧光定量PCR是检测基因mRNA含量最为准确的方法之一。Hippo信号通路致癌基因YAP的靶基因CTGF和Cyr61同时也是该通路中的重要成分,通过荧光定量PCR检测Hippo通路靶基因的CTGF和Cyr61mRNA的含量是反映YAP转录活性的重要指标之一。

实验方法：

(1)细胞培养：HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM中,HMLE细胞培养在含10％马血清和10μg/ml胰岛素，100ng/ml霍乱毒素，20ng/ml EGF，0.5μg/ml氢化可的松四种因子的DMEM/F12培养基中，MGC-803细胞培养在含10％胎牛血清的1640培养基中。细胞不能过密，至70-80％即可传代。

(2)瞬时转染处理：将细胞种入6孔板中，每孔2x10⁵个细胞，待细胞密度达到60％后,每孔换成新鲜培养液，同时使用RNAiMax按照试剂说明书转染20nM对照或VGLL4小干扰RNA，24h后使用RNAiMax按照试剂说明书转染20nM对照或miR-130a反义核酸，继续培养48h.若单独转染对照或者mir-130a反义核酸，则共需处理48h。

(3)稳定表达细胞株建立：每种靶细胞准备两盘八成满的HEK293T细胞，换成新鲜培养液，使用Lipo2000按照试剂说明书分别转染2ug对照空载或miR-130a多拷贝反义核酸质粒，同时共同转染慢病毒包装质粒pxPAX21500ng和pMD2.G 500ng，24h后换液，同时种植两盘待感染的靶细胞，继续培养24h后进行第一次靶细胞感染，感染时取3ml含病毒的包装细胞培养基加入3ml新鲜培养基和10μg/ml polybrene,加到待感染靶细胞上，每隔12h进行一次，共3次，第一次感染36h后加入Puromycin进行筛选，48h后换液。

(4)细胞总RNA的提取：吸除培养基，用PBS洗一遍细胞，去除残留培养基，再吸干PBS，每孔加1mLTrizol反复吹打几次充分裂解细胞，将Trizol转移到新的无RNA酶的1.5mL EP管，再根据Trizol使用说明书纯化出总RNA，并测定浓度。

(5)mRNA逆转录为cDNA：每个样品取500ng的RNA，配置成10ul体系，用Takara的逆转录试剂盒在PCR仪上反应得到cDNA,用水稀释5倍。

(6)荧光定量PCR检测mRNA水平：以cDNA为模板,分别加入Hippo通路YAP靶基因CTGF，Cyr61和内参基因HPRT特异引物，以及Biorad的super SYBRGreen Mix，在Biorad荧光定量PCR仪上反应，每个样品设置三个复孔。引物由Life公司合成,PAGE方式纯化，引物序列如下：

HPRT正向引物:5’-AGCCCTGGCGTCGTGATTA-3’,

HPRT反向引物:5’-ACAATGTGATGGCCTCCCA-3’,

CTGF正向引物:5’-CCAATGACAACGCCTCCTG-3’

CTGF反向引物:5’-TGGTGCAGCCAGAAAGCTC-3’

Cyr61正向引物:5’-GTGGGTCTGTGACGAGGATAGTAC-3’

Cyr61反向引物:5’-AACAGGGAGCCGCTTCAGT-3’

(7)数据分析：用2-△CT计算出mRNA的相对量,在excel中作出柱状图,以NC对照组为1。

实验结果：见图3A，B,C。实验结果表明,miR-130a反义核酸或miR-130a海绵体多拷贝反义核酸质粒可以抑制Hippo信号通路YAP靶基因表达。而这种抑制作用能被敲减VGLL4阻断。

实施实例2：

实验名称：miR-130a反义核酸降低YAP转录活性。

YAP作为一个转录辅激活因子直接结合到靶基因启动子并激活靶基因表达。这一活性可以使用靶基因启动子驱动的报告基因表达水平来检测。CTGF作为YAP的靶基因，其启动子的报告基因是一个被认可并广泛应用的YAP活性标志。因此可以通过检测miR-130a对该报告基因的影响来判断miR-130a能否影响YAP的转录活性。

实验原理：

荧光素酶报告基因是检测转录活性常用的实验方法，荧光素在荧光素酶的催化下能够发出荧光，通过酶标仪检测的荧光强度代表转录活性强弱。

在HEK293细胞中，瞬时转染表达beta-半乳糖苷酶的质粒，以持续表达的beta半乳糖苷酶作为内参，它能够水解无色底物ONPG，生成黄色产物，通过测量吸光值，可以得出beta-半乳糖苷酶的活性。Myc-YAP/TEAD/CTGFpromoter-luciferase荧光素酶活性检测系统中高表达的YAP蛋白通过内源表达的TEAD蛋白作用于CTGF启动子，启动荧光素酶的表达，从而表现出高强度的荧光信号。当YAP活性发生变化时荧光强度会相应变化。

实验方法：

(1)细胞培养：HEK293细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，在细胞汇合度达到40-50％时就转染。

(2)瞬时转染处理：将细胞传到12孔板中,每孔2x10⁵个细胞,转染前半个小时换成新鲜培养液，同时按照图中所示转染表达beta-半乳糖苷酶的质粒，对照或miR-130a反义核酸以及对照或VGLL4小干扰RNA。转染48h之后，检测荧光素酶活性。首先将培养基去除干净，加入300ul细胞裂解液(125mMTris-H3PO4(PH＝7.8),10mM>

实验结果：如图3D。实验结果表明,miR-130a反义核酸(miR-130a inhibitor)抑制Hippo信号通路YAP的转录活性，CTGF启动子活性降低。而当VGLL4被敲减后，miR-130a反义核酸则不起抑制作用。

实施例3：

实验名称：miR-130a海绵体多拷贝反义核酸抑制YAP与其靶基因CTGF的启动子区域结合。

YAP在细胞核内能与转录因子TEAD结合，发挥辅转录因子作用，促进下游基因表达。染色质免疫沉淀实验能够验证转录调控蛋白与基因启动子的结合，因而通过该方法检测YAP蛋白与CTGF启动子区域的结合强弱就可以直接反映YAP的转录活性高低。

实验原理：

使用交联剂处理细胞可以造成DNA与结合在上面的蛋白质被交联到一起。而后超声将DNA片段化，并使用特异性抗体将特定的蛋白沉淀，而与之结合的DNA也就一同沉淀下来。这些DNA可以通过解交联后的PCR反应进行检测定量。该方法反映与特定蛋白结合的DNA的序列和量的多少。

实验方法：

(1)细胞培养：HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，细胞密度达到70-80％时传代。

(2)稳定细胞的建立同实施例1的步骤(3)。

(3)染色质免疫沉淀，每个样品准备1X10⁷个细胞，首先交联，取出培养皿，在15ml培养液中加入37％甲醛至终浓度1％,室温在水平摇床孵育12min,再加入2.5M>

实验结果：如图3E,miR-130a海绵体多拷贝反义核酸质粒稳定表达的HepG2细胞对比稳定表达空载的对照细胞，TEAD与CTGF启动子区域的结合基本不被影响而YAP与CTGF启动子区域的结合减弱，即miR-130a多拷贝反义核酸质粒抑制YAP与其靶基因CTGF的启动子区域结合。

实施例4：

实验名称：miR-130a海绵体多拷贝反义核酸抑制YAP 5SA对细胞生长的促进作用。

YAP 5SA为对Hippo信号通路不敏感的突变体，有促进细胞生长的作用，miRNA-130a多拷贝反义核酸质粒可以抑制YAP活性，因而可以研究miRNA-130a多拷贝反义核酸质粒对细胞生长作用以及作用机制。检测细胞活力常用的方法是利用Cell Titer Blue试剂。

实验原理：

Cell Titer-Blue细胞活性检测用均质、荧光的方法检测细胞活性。原理是活性细胞能将一种氧化还原染料(刃天青)转化成一种荧光终产物(试卤灵)。由于非活性细胞没有新陈代理能力因为不能生成荧光信号。均质的检测方法就是将产生信号的试剂直接加到含有血清的细胞培养基中，经过孵育，用96孔板荧光计(推荐)或分光光度计来记录数据。

实验方法：

(1)细胞培养：HepG2细胞培养于含有10％新鲜胎牛血清的DMEM培养基中。

(2)稳定细胞的建立同实施例1的步骤(3)。

(3)细胞瞬时转染同实施例1的步骤(2)。

(4)细胞活力检测：将瞬时转染的细胞或者构建的稳定细胞株消化后以每孔1000个细胞接种到96孔板中，设置0(细胞贴壁稳定)，1，3，5，7，9天共6个检测时间点，每个时间点设置两个复孔，加入Cell Titer-Blue试剂进行活力检测。方法是在每个检测点将20ul Promega公司的Cell Titer-Blue细胞活性检测试剂直接加入待测96孔的细胞培养基中，37℃培养箱中避光孵育4h后，取出反应后的100ul培养基至非透明的96孔板，设置540激发光/590发射光，读取荧光强度作为细胞活力数据。

实验结果：如图4A，B。在HepG2细胞中，稳定过表达YAP 5SA能够促进细胞增殖，同时共同表达miR-130a多拷贝反义核酸质粒能够一定程度抑制细胞生长速率增加。单独瞬时表达miR-130a反义核酸能抑制细胞增殖，而在此基础上敲减VGLL4又回复了细胞的生长速率。

实施例5：

实验名称：miR-130a反义核酸能够促进细胞悬浮引起的凋亡。

抗细胞悬浮凋亡实验能反映癌细胞在转移过程中存活的能力，一些癌细胞具有较强的抵抗悬浮凋亡的能力。已知YAP能明显促进细胞在悬浮培养中存活，miR-130a反义核酸可以抑制YAP活性，应在悬浮培养中抑制细胞存活。

实验原理：

细胞凋亡在机体胚胎发育、组织修复等方面起着非常重要的作用。凋亡调节失控能引起临床多种疾病。细胞凋亡有一系列细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素(如FITC、PE)或生物素(Biotin)标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。正常上皮细胞在悬浮培养状态下发生凋亡，而具有转移能力的癌细胞者具有较强的抵抗凋亡的能力。

实验方法：

(1)细胞处理：细胞计数后，根据HepG2细胞的生长速率和特性，适量种植在六孔板中，待细胞密度达到60-70％时，换新鲜培养基，用RNAiMax转染试剂在每孔转染20nM对照或者miR-130a反义核酸,转染24h后将两种处理的细胞培养到超低粘附性的六孔板中培养48H，注意每个孔中种的细胞量一致。

(2)收集细胞：胰酶消化细胞，终止消化后，设置1000rpm转速4℃离心5分钟收集细胞沉淀，弃上清，调整待测细胞浓度为2X10⁶/ml,取200ul悬液加入1ml预冷的PBS,震荡使细胞悬浮，1000rpm>

(3)细胞染色：每个细胞沉淀样品加入300ul标记缓冲液重悬后加入5ulAnnexin V/FITC染料探针，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟，立即上机(流式细胞仪)检测，注意设置空白对照和不加染色探针的阴性对照。

实验结果：如图4C，对照HepG2细胞在悬浮培养下有相当部分细胞未发生凋亡(46％)，而转染miR-130a反义核酸后凋亡率明显上升(73.9％)。

实施例6

实验名称：miR-130a海绵体多拷贝反义核酸腺病毒抑制MST1/2条件敲除诱导的肝细胞增殖、肝脏变大和YAP靶基因表达。

MST条件敲除

实验原理：Mst1和Mst2是两个同源的蛋白激酶，是Hippo信号通路中对YAP起抑制作用的核心蛋白。MST1/2敲除能激活YAP活性，促进下游靶基因表达，从而使肝脏变大。这种生理功能是依赖于YAP活性的。在MST1/2条件敲除的基础上注射miR-130a海绵体多拷贝反义核酸腺病毒，观察肝细胞增殖情况、肝脏大小及YAP靶基因表达能进一步证明在体内生理条件下miR-130a的抑制对组织生长的作用。

实验方法：

Mst1/2条件性基因敲除小鼠已有报道(Song H,Mak KK,Topol L,Yun K,HuJ,Garrett L,et al.Mammalian Mst1and Mst2kinases play essential roles in organsize control and tumor suppression.Proc Natl Acad Sci U S A 2010,107(4):1431-1436.)。使用带有Mst2纯合条件性敲除以及Mst1敲除或野生型的基因型小鼠。通过小鼠尾静脉注射5X10⁸带Cre重组酶的腺病毒以及5X10⁹对照或表达miR-130a海绵体多拷贝反义核酸的腺病毒。9天以后处死小鼠取肝脏进行分析，包括肝脏体重比分析，冰冻切片的免疫荧光染色分析以及提取RNA或总蛋白进行基因和蛋白质表达分析。

实验结果：如图4D,E,F，MST1/2条件敲除导致肝脏比重变大，然而miR-130a海绵体多拷贝反义核酸腺病毒在MST条件敲除小鼠上作用后减小了肝脏体重比。Ki67染色结果显示miR-130a多拷贝反义核酸腺病毒注射组增殖标志Ki67和对照组相比恢复了正常。而荧光定量PCR和免疫印迹结果证明了，miR-130a多拷贝反义核酸腺病毒注射组减少了YAP靶基因的表达而VGLL4蛋白表达上升。

实施例7：

实验名称：miR-130a反义核酸抑制YAP 5SA引起的细胞贴壁非依赖性生长。

YAP 5SA过表达促进细胞癌症转化，使细胞获得贴壁非依赖性生长的能力，可以在软琼脂上形成克隆。在该条件下研究miR-130a反义核酸的效果可以显示对抑制细胞癌症转化上的能力。

实验原理：

非贴壁依赖性生长是癌细胞的显著特征。正常细胞不能在软琼脂内生长，而癌细胞获得在软琼脂内生长的能力，进而形成肉眼可见的克隆。克隆形成率反映细胞群体癌症转化的程度。

实验方法：

(1)细胞培养：HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，细胞密度达到70-80％时传代。

(2)稳定细胞的建立同实施例1的步骤(3)。

(3)细胞瞬时转染同实施例1的步骤(2)。

(4)克隆形成实验：培养基加热至37℃，在使用前加热至42℃，同时灭菌PBS配制3％的agarose，高压灭菌后置于60℃待用。用培养基将3％的agarose稀释成0.6％的浓度，六孔板每个孔加入2ml待其凝固。消化细胞，用培养基配成25000/ml的细胞密度，用培养基将agarose稀释成0.5％，每2ml混合1ml细胞悬液，共3ml混合均匀后种于每个孔，设置复孔,上层胶终浓度为0.33％.上层胶凝固后加1ml培养基置于细胞培养箱中培养，20天后观察克隆形成情况，拍照并用结晶紫染色计数。

实验结果：如图5A，HepG2本身不能形成细胞克隆，而表达YAP 5SA后有很强的克隆形成能力，克隆数明显增加，在此基础上瞬时转染miR-130a反义核酸YAP 5SA的克隆形成能力被一定程度抑制。

实施例8：

名称：miR-130a海绵体多拷贝反义核酸抑制YAP S127A诱导的肿瘤形成。

裸鼠皮下成瘤实验能在体内环境中验证肿瘤细胞的成瘤能力，YAP-S127A过表达能够促进细胞成瘤。在此基础上试验miR-130a多拷贝反义核酸的效果可以反映miR-130a的抑制对YAP诱导的肿瘤形成的作用。

实验原理：

由于大部分肿瘤研究使用的是人类细胞，所以由于异种排斥的存在，我们需要免疫缺陷型小鼠来作为移植瘤模型的载体，通过对该小鼠的注射肿瘤细胞，使其成瘤，观察流体的生长来判断其生物学变化。

实验方法：

(1)细胞培养：HepG2细胞培养于含有10％新鲜胎牛血清的DMEM培养基中。

(2)稳定细胞的建立同实施例1的步骤(3)。

(3)裸鼠皮下成瘤：扩增细胞后消化收集，用PBS配置成1X10⁷/ml细胞悬液，以一定的细胞量注射裸鼠，每只裸鼠下肢分成左右两个注射点，每个点注射200ul细胞悬液。饲养裸鼠至肉眼可见瘤体(三周)，取瘤，测量瘤体大小,称重，照相记录处理结果。

实验结果：如图5B,C，miR-130a海绵体多拷贝反义核酸质粒与YAP-S127A共表达后，对照YAP-S127A单独过表达组，肿瘤大小和重量均有明显变化，共表达组肿瘤体积小，重量轻，说明miR-130a多拷贝反义核酸质粒能够一定程度上抑制YAP的成瘤能力。