一种提高孕妇血浆游离DNA测序文库中胎儿游离DNA占比的方法

技术领域

本发明涉及生物技术遗传工程领域。更具体地，涉及一种提高孕妇血浆游离DNA测序文库中胎儿游离DNA占比的方法。

背景技术

染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色体数目增加或减少，染色体数目特别是非整倍数的改变与人类一些疾病密切相关，也与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切的关系。该类疾病随着孕妇年龄的提高而提高。据文献报道中国每年出生的染色体异常的新生儿约10万人，在活产婴儿中，染色体异常占比达到0.3％，染色体异常是造成大量先天缺陷的主要原因。其中异常主要是指染色体的数目或者结构发生异常，其中最为常见的是唐氏综合征(T21)、爱德华氏综合征(T18)、帕陶氏综合征(T13)等，占染色体非整倍体畸变95％以上，这些染色体异常占全部染色体异常的80–90％。

1997年，Lo等人(Lo Y.M.et al.,1997)在孕妇的外周血浆中发现了胎儿的游离DNA，使得科学家在理论上可以通过母亲血液检测胎儿DNA，从而检测胎儿的出生缺陷。然而血液中的游离DNA片段较短，一般为166bp左右，而且其中胎儿游离DNA的含量较少，一般能够占总的游离DNA的5–30％，因而给全面检测胎儿游离DNA带来了困难。

目前，中国国内对孕妇外周血游离DNA的研究多集中在富集胎儿游离DNA进行相关检测。如吴雪花等在《孕妇血浆中胎儿游离DNA的提取》一文中通过胶回收法富集胎儿DNA进行Y染色体检测，但同时也提到由于DNA含量低导致检测成功率很低。近年来，随着高通量测序技术的发展，科学家可以通过测序技术来分析孕妇外周血中的胎儿游离DNA，这时候，无创DNA产前检测技术便从理论变成了现实。随后大量的临床试验验证了此技术，准确率到99％以上。

即便是无创产前检测具有这么高的准确率，但还是存在一些问题。目前无创产前检测的样本为全部的孕妇血浆游离DNA，但游离DNA中存在大量的母源游离DNA，胎儿游离DNA含量因个体差异而大不相同，部分样本胎儿游离DNA含量过低，导致准确性降低、测序通量低和检测成本较高等。ACOG指南中强调，由于个体原因可能会导致胎儿游离DNA含量过低，进而无法获得检测结果，此时重复检测获得准确结果的可能性只有50–60％，因此在胎儿游离DNA含量过低的时候，无创产前检测结果准确性也相对降低。为了保证每个样本检测的准确度，目前通用做法是提高样本的检测数据量，从而降低了每次测序运行的样本量，导致检测成本比较高，。这就迫使急需开发一种新的无创产前筛查方法，以有效提高孕妇外周血胎儿游离DNA占比和提高一次检测的样本通量，降低检测成本。

2012年，Jiang等(Jiang FM.et al.,2012)文章研究表明，当孕妇外周血胎儿含量低于3.5％以下时，检测样本的测序数据需要以指数方式增加。进而随着人们对孕妇外周血胎儿游离DNA的更深入研究，许多文献研究表明胎儿DNA片段长度相对短于母体血浆中游离DNA长度。2014年，Lo等人(Lo Y.M.et al.,2014)文章报道表明，胎儿DNA片段长度会比孕妇外周血中游离DNA片段长度小10bp左右，因此通过回收120-140bp左右片段，能够提高胎儿游离DNA的占比。Yin等人研究报道，胎儿游离DNA片段含量占比越大，需要的测序数据越少，检测准确性越高；相反，则测序深度需要相对增加才能达到准确检测(Yin A.H et al.,2015)。

发明内容

本发明目的在于提供一种提高孕妇血浆游离DNA测序文库中胎儿游离DNA占比的方法，使用所述方法进行无创产前检测，不但对孕妇外周血胎儿游离DNA含量过低的样本进行准确检测，而且降低了样本的测序数据，提高了一次测序反应的样本通量，降低了检测成本，有利于大规模推广。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明方法为一种提高孕妇血浆游离DNA测序文库中胎儿游离DNA占比的方法，通过对孕妇血浆游离DNA进行特异性序列标签连接，扩增后，富集特定片段范围的测序文库，提高胎儿游离DNA的占比，再通过高通量测序技术进行检测。所述方法具体包括如下步骤：

提取孕妇血浆游离DNA；

在孕妇血浆游离DNA的两端添加特异性序列标签获得具有孕妇个体识别标记的血浆游离DNA；

对具有孕妇个体识别标记的血浆游离DNA进行PCR扩增，获得该个体原始文库；

在选定的血浆游离DNA长度范围内，对获得的个体原始文库中的DNA进行回收，获得用于高通量测序的回收文库；或

将多个不同孕妇个体的所述个体原始文库进行混合，获得混合文库，并在选定的长度范围内，对混合文库中的DNA进行回收，获得用于高通量测序的回收文库。

进一步的，所述特异性序列标签包括基于半导体测序法的Ion Torrent平台的接头、引物和Illumina平台的接头、引物。

进一步的，所述Ion Torrent平台的接头包括：

P1接头和A接头；

P1接头序列：

5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT–3'3'—T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'；

A接头序列：

5'—CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'

3'—C-GCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'；

其中N为A、C、G或T；

所述Ion Torrent平台的PCR扩增引物序列包括P1引物序列和A引物序列，

P1引物序列：

CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT；

A引物序列：

CCATCTCATCCCTGCGTGTC。

进一步的，所述Illumina平台的接头为：

接头序列：

TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG；

所述Illumina平台的引物为：

PCR引物序列：

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC

5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG，

其中N为A、C、G或T。

进一步的，所述选定的血浆游离DNA长度范围为120-140bp。

进一步的，所述混合为等质量混合，所述多个孕妇个体的数量优选为5个。

进一步的，所述回收为使用琼脂糖凝胶电泳以及具有同等功能的DNA片段回收设备进行回收。

本发明所述方法的有益效果如下：

1.本发明所述方法能够显著提高孕妇外周血胎儿游离DNA含量占比，由于孕妇外周血游离DNA分布范围广(75–250bp)，但是胎儿游离DNA的分布主要集中在150bp以下，致使产生较多无效测序数据；本发明首先是针对孕妇外周血游离DNA添加特异性序列标签，然后进行PCR扩增达到一定量的积累，获得原始文库，原始文库再进行文库固定DNA长度范围回收，获得回收文库，回收的文库胎儿游离DNA片段长度为120–140bp，回收文库与原始文库上机测序数据分析比较，前者比后者胎儿游离DNA含量占比提高1.7–3.2倍；研究表明，胎儿游离DNA含量占比在3.5％以上时，仅需要三百万测序片段就可作为准确检测样本，而通过本发明文库回收，可使胎儿游离DNA片段含量占比在3.5％以上，这使得测序数据量由原来的五百万测序片段降低为三百万测序片段，可显著提高一次上机测序样本通量，可提高60％的检测通量。

2.本发明所述方法能够对胎儿游离DNA含量过低的样本进行准确检测。常规的NIPT检测对胎儿游离DNA含量占比在3％的检测结果不准确，而通过片段回收文库样本进行上机测序，可以将胎儿游离DNA含量占比提高到5％以上，从而可以准确检测。

3.本发明所述方法能够提高一次上机测序反应通量。根据胎儿DNA占比提高倍数(1.7-3.2倍)，可将检测通量提高60％，从而降低检测成本，更加有利于无创产前检测的大规模推广。

附图说明

图1本发明所述方法的实验流程图；

图2为原始文库Agilent 2100bioanalyzer检测的片段分布图；

图3为本发明回收文库Agilent 2100bioanalyzer检测的片段分布图；

图4为本发明DNA片段回收的实验过程图；

图5为15个原始文库(半导体测序法)一次性上机测序检测结果图；

图6为本发明30个孕妇外周血样本的回收文库(半导体测序法)一次性上机测序检测结果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明方法以及流程，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明，实施例均使用半导体测序法Ion Torrent测序平台。

本发明所述的原始文库是指对提取的孕妇血浆游离DNA两端添加特异性序列标签并经PCR扩增后获得的文库。

本发明所述的回收文库是指对原始文库或混合文库进行指定长度范围内的DNA片段回收获得的文库。

实施例1

不同数量原始文库混合测序数据量比较

实验方法

1.采集54例孕妇血浆样本并进行游离DNA提取

(1)用EDTA抗凝采血管抽取孕龄为12-24周的孕妇静脉血5ml，将抽完血的EDTA抗凝采血管在4℃条件下，1600×g离心10min；吸取全部的上层血浆分装于2ml离心管中，将第一次离心分离得到的血浆在常温条件下，16000×g离心10min，小心吸取第二次离心得到的上层血浆于新的离心管中，用于游离DNA提取；

(2)吸取600μl经过两次离心的血浆样品于新的2ml离心管中；

(3)向600μl血浆中依次加入1000μl Lysis Buffer，60μl Magnetic beads，35μl Proteinase K，14μl Acryl Carrier，震荡，上下颠倒混匀10min后，置磁力架上静置4min，澄清后弃去管内液体，取下离心管；

(4)向上一步的离心管中加入500μl Wash Buffer I后混匀溶液，重悬磁珠，置磁力架上静置4min,吸附完全后，保留磁珠在离心管内，将澄清液体弃去；

(5)向上一步的离心管中加入500μl Wash Buffer II,重悬磁珠，置磁力架上静置4min,吸附完全后，保留磁珠在离心管内，将澄清液体弃去；

(6)向上一步的离心管中加入550μl Wash Buffer III,尽量不要冲起磁珠，30s后，置磁力架上静置4min，保留磁珠在离心管内，将澄清液体弃去；

(7)将上一步的离心管保持敞开状态，室温静置2min，待管内液体挥发干净；

(8)向上一步的离心管中加入35μl事先在60℃预热的Elution Buffer，置于60℃条件下重悬磁珠10min，期间轻轻晃荡两次充分洗脱，不要把液体弹到管壁上；

(9)将步骤(8)中在60℃反应完的离心管置于磁力架上4min，待磁珠吸附完全后，将溶液即提取出游离DNA的溶液吸到新的离心管内即完成对血浆中游离DNA的提取，使用1μl含有游离DNA的溶液进行Qubit定量检测，经Qubit定量检测质量合格的血浆游离DNA用于下一步的文库制备。

2.文库制备

用提取到的血浆游离DNA构建原始文库，原始文库构建需要3步酶促反应(末端修复、连接反应和PCR反应)；每位孕妇的血浆游离DNA构建一个原始文库。

1)末端修复

取30μL提取出的含游离DNA的溶液于1.5mL的离心管中，向管中加入表1中的试剂：

表1

将离心管室温静置30min之后，加入Agencourt Ampure XP Beads 75μl，进行磁珠纯化，纯化得32μl末端修复产物进行下一步反应；

2)连接反应

在上一步纯化得到的末端修复产物中加入表2中的试剂：

表2

特异性接头X有30种，各自的序列如表3所示：

表3

将离心管室温静置30min之后，加入Agencourt Ampure XP Beads 75μl，进行磁珠纯化，纯化得15μl接头连接产物；

3)PCR反应

取部分上一步纯化得到的接头连接产物于0.2mL的PCR管中，并加入表4中的试剂：

表4

将PCR管放入PCR仪中反应，反应条件如表5：

表5

PCR反应结束后，将PCR管中的液体转移到1.5mL的离心管中，向离心管中加入Agencourt Ampure XP Beads 97μl，进行磁珠纯化，获得25μl原始文库，使用1μl原始文库样本进行Qubit定量及Agilent 2100生物分析仪检测，合格的原始文库片段范围分布应如图2所示，文库的片段主峰应该在260bp左右，副峰较小。

3.原始文库上机测序及生物信息学分析

对每位孕妇血浆游离DNA构建的原始文库进行Qubit定量及在Agilent2100生物分析仪上进行检测，检测合格的原始文库用于后续的测序，采用IonTorrent测序系统进行测序，通过生物信息学的方法分析测序结果，计算每个原始文库中胎儿游离DNA的含量占比。

4.文库片段回收

随机挑选2个合格的原始文库按照等质量比进行混合形成混合文库，使用琼脂糖凝胶电泳对混合文库中的120–140bp的DNA片段进行回收，回收的DNA片段组成回收文库，对回收文库使用Agilent 2100生物分析仪以及Qpcr定量方法进行文库质检，Qpcr定量试剂盒为KAPA Library QuantificationKits(for Ion Torrent platform)，本实施例中，还进行了3个、4个…10个原始文库的等质量比混合，并对这些混合文库进行了120-140bp长度范围内的DNA回收，获得了相应的回收文库，图4为从E-Gel电泳系统回收的实验过程展示；图3为对由5个原始文库混合形成的回收文库进行生物分析，分析的结果表明构建的回收文库合格。

5.回收文库上机测序及生物信息学分析

对构建的每个回收文库，采用Ion Torrent测序系统进行测序，通过生物信息学的方法分析测序结果，计算回收文库中胎儿游离DNA的含量占比。

实验结果

利用高通量测序技术，表6中为步骤3中的原始文库测序结果和步骤5中回收文库的测序结果。

测序数据分析比较结果表明，由5个随机挑选的原始文库按质量比1:1:1:1:1的比例进行混合制备成的混合文库，经过DNA片段回收获得的回收文库，和每个原始文库测序结果一致，各个样本测序数据在五百万左右，结果最均一；由5个以上的随机挑选的原始文库形成的回收文库，出现测序数据不均一的现象(表6中的黑色斜体数据为测序数据偏多或偏少的样本)；由5个以下的随机挑选的原始文库混合可以达到与每个原始文库测序数据均一的效果，但是未能实现试剂的合理利用。因此，选择5个随机挑选的原始文库按等质量比混合制备成一个混合文库，再进行固定范围内的DNA片段回收，是较优的选择。

表6

实施例2

使用高通量测序技术及数据分析系统对根据本发明方法构建的孕妇血浆游离DNA原始文库及回收文库中胎儿游离DNA含量占比的分析比较

实验方法

1.血浆样本制备及DNA提取

收集14例经检测怀有男胎的孕妇外周血样本，按照实施例1中的方法进行血浆分离及游离DNA提取，使用1ul含有游离DNA的溶液样本进行Qubit定量检测，检测合格的血浆游离DNA进行下一步文库制备。

2.文库制备

同实施例1中的文库制备。

3.原始文库上机测序及生物信息学分析

同实施例1中的原始文库上机测序及生物信息学分析。

4.文库片段回收

随机挑选5个经过定量合格的原始文库进行混合，按照1:1:1:1:1的质量比将5个原始文库制备成1个混合文库，使用琼脂糖凝胶电泳对混合文库中的120–140bp的DNA片段进行回收，回收的DNA片段组成回收文库，对回收文库使用Agilent 2100生物分析仪以及Qpcr定量方法进行文库质检，Qpcr定量试剂盒为KAPA Library Quantification Kits(for Ion Torrent platform)；14例孕妇血浆样本构建14个原始文库，这14个原始文库按照上述方法混合出对应的回收文库。

5.回收文库上机测序及生物信息学分析

将第4步中获得的回收文库，采用Ion Torrent测序系统进行回收文库样本上机测序，通过生物信息学的方法分析测序结果。

实验结果

利用高通量测序技术，表7为步骤3中的原始文库测序结果和步骤5中的回收文库的测序结果，数据分析比较结果表明，回收文库比相应的原始文库中的胎儿游离DNA含量占比提高1.7–3.2倍，平均可提高2.44倍左右。

表7.

表7中的实验结果说明，本发明针对血浆游离DNA进行PCR扩增，达到一定量的积累再进行DNA回收能够满足高通量测序文库质量要求，可显著提高胎儿游离DNA含量占比。

实施例3

本发明方法对孕妇血浆中不同含量占比的胎儿游离DNA检测灵敏性

实验方法

1.血浆样本制备及游离DNA提取

收集经测序，已知怀核型为21号染色体三体、男性胎儿的孕妇血浆样本，且前期已经通过高通量测序技术测定了血浆中胎儿游离DNA的含量，使用该已知胎儿DNA含量的血浆样本和未怀孕的血浆样本进行不同比例的血浆混合，制备胎儿游离DNA含量占比分别为2％、3％、4％、5％和10％的混合血浆。混合血浆制备见下表8：

表8

对表8混合好的血浆按照实施例1中的提取方法进行游离DNA提取，使用1μl含有游离DNA的溶液样本进行Qubit定量检测，检测合格的血浆游离DNA进行下一步的文库制备。

2.文库制备

同实施例1中的文库制备。

3.原始文库上机测序及生物信息学分析

同实施例1中的原始文库上机测序及生物信息学分析。

4.文库片段回收

同实施例2中的文库片段回收。

5.回收文库上机测序及生物信息学分析

同实施例1中的回收文库上机测序及生物信息学分析。

实验结果

如表9所示，使用高通量测序检测方法，对胎儿游离DNA含量占比低于2％的原始文库进行检测，检测的灵敏性为0％，假阴性率为100％，而按照本发明方法将原始文库混合后再进行回收，则回收后的文库的检测灵敏性为100％，假阴性率为0。

表9

表9中的实验结果说明，本发明针对文库片段选定范围回收，可准确检测原始文库中胎儿游离DNA含量低至2％的孕妇外周血样本。

实施例4

不同样本数量同时检测的结果准确性比较(15个和30个样本通量)

实验方法

1.血浆样本制备及游离DNA提取

收集30例经唐筛检测为低风险的孕妇外周血样本，按照实施例1中的方法进行血浆分离及游离DNA提取，使用1ul含有游离DNA的溶液样本进行Qubit定量检测，检测合格的血浆游离DNA进行下一步文库制备。

2.文库制备

同实施例1中的文库制备。

3.原始文库上机测序及生物信息学分析

经过Qubit检测后的原始文库采用Ion Torrent测序系统进行文库样本上机测序，每次上机测序同时检测15个原始文库，通过生物信息学的方法分析测序结果。图5为15个孕妇血浆游离DNA构建的15个原始文库同时检测的测序结果图。

4.文库片段回收

将30个经过定量合格的原始文库进行混合，按照等质量比将随机挑选的5个原始文库混合制备成1个混合文库，30个原始文库共制备出6个混合文库，使用琼脂糖凝胶电泳对混合文库中的120–140bp的DNA片段进行回收，回收的DNA片段组成回收文库，对回收文库使用Agilent 2100生物分析仪以及Qpcr定量方法进行文库质检，Qpcr定量试剂盒为KAPA LibraryQuantification Kits(for Ion Torrent platform)。

5.回收文库上机测序及生物信息学分析

将第4步中获得的6个回收文库，采用Ion Torrent测序系统进行回收文库样本上机测序，并通过生物信息学的方法分析测序结果。图6为6个回收文库一次测序的测序结果图。

实验结果

利用高通量测序技术，表10为步骤3中的原始文库测序结果和步骤5中的回收文库的测序结果，结果显示13、18和21号染色体Z值均在【-3,3】的范围，即没有异常出现；这说明回收文库将样本通量提高对检测结果准确度没有影响。

表10

表10中的实验结果说明，本发明方法使用的回收文库可以将样本通量提高为30个孕妇外周血样本，进而降低样本测序成本。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。