法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-02-12
授权
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2016-09-28
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N23/225 申请日:20160414
实质审查的生效
2016-08-31
公开
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技术领域：
本发明涉及一种定量评估围种植窗期子宫内膜胞饮突的方法，一种通过子宫内膜胞饮突的扫描电镜观察与Image J软件计量相结合来定量评估子宫内膜胞饮突的方法。
背景技术：
据世界卫生组织(WHO)评估，每7对夫妇中约有1对夫妇存在生殖障碍。我国近期调查，国内不孕症者占已婚夫妇人数的10％，比1984年调查的4.8％增加一倍多，发病率呈上升趋势。人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology，ART)可在一定程度上治疗不育夫妇以达到生育的目的。其主要包括人工授精、体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer，IVF-ET)、卵胞浆内单精子注射、胚胎植入前遗传学诊断、精液冷冻、胚胎冷冻等技术。试管婴儿就是使用体外受精-胚胎移植技术所生育的婴儿。体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)又称“第一代试管婴儿”，是指分别将卵子与精子从人体内取出并在体外受精，发育成胚胎后，再移植回母体子宫内，以达到受孕目的的一种技术。
近30年来辅助生殖技术(ART)得到了迅猛发展。在体外受精和胚胎移植(IVF-ET)中，控制性超排卵(COH)技术，新的胚胎培养系统以及超声介导胚胎移植等技术的应用，极大地提高了临床妊娠率[1]。然而，在不孕症的治疗中，胚胎种植失败仍然是一个主要问题，国内外许多生殖中心的临床妊娠率一直徘徊在22.8％～40.5％[2,3]。众所周知，胚胎质量和子宫内膜容受性是决定胚胎种植率和临床妊娠率的两个主要因素。优质胚胎的获得与患者年龄、超促排卵方案和实验室培养体系等因素相关，当优质胚胎的获得达到稳定水平时，子宫内膜容受性以及内膜和胚胎的同步性因素对胚胎种植就显得非常重要。
1976年Psychoyos[4]首次提出子宫内膜容受性这一概念，即子宫内膜允许胚胎着床的能力，是特定时期的一种状态，也被称为“种植窗”(WOI)。在这特定的时期内，子宫内膜在雌、孕激素作用下发生一系列与胚胎粘附、侵入相关的形态结构变化，能够最大限度的接纳胚胎，使胚胎顺利着床，过早或过晚都不接纳胚胎种植，亦即种植窗关闭。一般认为种植窗在黄体中期开放，最佳的子宫内膜容受性大约发生在LH峰出现后的6-8天[5，6]，且出现特征性的产物。
在细胞形态学方面，胞饮突作为评价子宫内膜容受性标志物已被多数学者所接受。它是种植窗期子宫内膜上皮细胞顶端出现的大而平滑的膜状突起，最早在小鼠的子宫内膜中被发现的，后来在人着床期
2 子宫内膜也出现类似结构[7,8]。胞饮突的演化过程经过几个形态上截然不同的阶段，因此可以将它分为发育中(developing；D期)、发育完全(Fully>
目前评估胞饮突的方法主要有两种，一种方法是单纯评估胞饮突的发育形态而未对数量进行客观的定量[9]；该方法详细地描述了胞饮突的3个时期，认为图片视野中FD期胞饮突占整个内膜百分比大于60％就处于最佳子宫内膜容受期，而未对各个时期的胞饮突数量进行定量，也没有给出客观的定量方法。另一种方法是目前大家比较认同的[10]。该方法分别对胞饮突的发育形态和数量进行主观评分:D期胞饮突记为1分，FD期记为3分，R期记为1分；胞饮突数量占该视野总内膜细胞数的百分比为0％记为0分，1％-20％记为1分，21％-50％ 记为2分，大于50％记为3分。最后求得所有图片总的平均分，平均分高，则容受性相对较好。上述两种方法相对来说比较主观，粗略，变异性大，不能客观的评估胞饮突的形态发育以及数量的表达，进而更不能准确的评估子宫内膜容受性。
发明内容：
为了解决现有评估方法中主观较大、准确性较差等问题，本发明提供了一种相对客观的评估围种植窗期子宫内膜胞饮突的方法。
本发明所述的一种定量围种植窗期子宫内膜胞饮突的方法，包括如下步骤：
步骤1.围种植窗期子宫内膜样本经过处理后，通过扫描电子显微镜对子宫内膜上皮细胞存在胞饮突的视野进行拍照，统一放大倍数×2000,以BMP格式保存图片；
步骤2.通过Image J软件将图片打开(File-open)，再插件-分析-细胞计数(Plugins-Analyze-Cell Counter),Type 1代表D期胞饮突，Type 2代表FD期胞饮突，Type 3代表R期胞饮突；分别记录图片中处于D期，FD期和R期胞饮突的数量，最后结果(Results)分别求得三个时期胞饮突的数量；
步骤3.因为胞饮突存在三种不同的发育形态以及在子宫内膜上的分布存在异质性，所以通过连续观测值的平均值方法(The Running Average Method)得出至少需要拍摄N张胞饮突的视野图片才能达到稳定计数，具体操作方法如下：
(a)首先绘制一个坐标轴，X轴为拟计数胞饮突的扫描电镜拍摄的视 野数(1，2，3，.....N)，Y轴为FD期的胞饮突数占胞饮突总数的百分比，以FD％表示；
(b)第N个视野的Y轴FD％值,为第1至第N个视野中，发育完全的胞饮突总数占N个视野中胞饮突总数的百分比；
(c)计数N个视野，以N个视野所得到的FD％为该内膜样本中FD期胞饮突所占胞饮突总数的百分比作为基数值；通过Running average的方法，找出可获得与FD％基数值变异范围于5％以内的视野数；将第1个视野的FD％,至第N个视野的FD％值绘至纵坐标轴，以折线连接；绘出FD％基数值±5％的区域，若随视野数逐步增加，连续≧5个FD％值位于该区域内，表示通过计数这N个视野，所获得的FD％值趋于稳定。
(d)我们通过上述方法，得出扫描电镜拍摄胞饮突的视野数N＝60时，大部分患者的FD期胞饮突数量比较稳定。
该发明的优点是：客观准确地评估了不同发育形态的胞饮突数量，为后续的科研研究及应用提供了一种可靠的评估子宫内膜容受性方法。在IVF-ET中，反复种植失败的不孕患者，主要原因可能是子宫内膜容受性较差或者子宫内膜与胚胎发育不同步，用胞饮突来评估者子宫内膜容受性以及根据FD期胞饮突的表达数量来调整胚胎移植时间，有望提高临床妊娠率。在个体化治疗方案中，客观的评估胞饮突方法可能有很好的临床应用价值。
附图说明：
图1是子宫内膜胞饮突的三种发育形态A:发育中胞饮突；B:发育完全胞饮突；C萎缩期胞饮突。
图2是Image J软件的操作流程示意图。
图3是通过连续观测值的平均值方法(The running average)测得需要多少个视野才能得到稳定的发育完全胞饮突计数，a,b,c分别代表三个不同样本FD期胞饮突稳定的图片视野数，图中连续3个点开始进入灰色区域就算趋于稳定。从a图中可以看出，从第33个视野，FD期胞饮突趋于稳定。b图中，第20个视野FD期胞饮突趋于稳定。c图中，第45个视野FD期胞饮突趋于稳定。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明。
本发明所述的一种定量围种植窗期子宫内膜胞饮突的方法，包括如下步骤：
1.围种植窗期子宫内膜样本经过处理后，通过扫描电子显微镜对子宫内膜上皮细胞存在胞饮突的视野进行拍照，统一放大倍数×2000,以BMP格式保存图片。
2.通过Image J软件将图片打开(File-open)，再插件-分析-细胞计数(Plugins-Analyze-Cell Counter),Type 1代表D期胞饮突，Type 2代表FD期胞饮突，Type 3代表R期胞饮突。分别记录图片中处于D期，FD期和R期胞饮突的数量，最后结果(Results)分别求得三个时期胞饮突的数量。如图2。
3.因为胞饮突存在三种不同的发育形态以及在子宫内膜上的分布存 在异质性，所以我们通过连续观测值的平均值方法(The Running Average Method)得出至少需要拍摄60张胞饮突的视野图片才能达到稳定计数，图3示例，具体操作方法如下：
(1)首先绘制一个坐标轴，X轴为拟计数胞饮突的扫描电镜拍摄的视野数(1，2，3，.....60)，Y轴为FD期的胞饮突数占胞饮突总数的百分比(以FD％表示)。
(2)第1个视野FD％为发育完全胞饮突占第1个视野所有胞饮突的百分数。若有2个视野，第2个视野的Y轴FD％值代表第1个视野和第2个视野中FD期的胞饮突总数占2个视野中胞饮突总数的百分比。依次类推，第N个视野的Y轴FD％值,为第1至第N个视野中，发育完全的胞饮突总数占N个视野中胞饮突总数的百分比。
(3)我们初步计数了60个视野，以60个视野所得到的FD％为该内膜样本中FD期胞饮突所占胞饮突总数的百分比(作为基数值)。我们预期通过Running average的方法，能找出可获得与FD％基数值变异范围于5％以内的视野数(我们期望这个视野数≤60个，也即，我们可以通过计数相对少的视野数，即可达到接近FD％基数值的水平)。我们将第1个视野的FD％,至第N个视野的FD％值绘至纵坐标轴，以折线连接。绘出FD％基数值±5％的区域，若随视野数逐步增加，连续≧5个FD％值位于该区域内，表示通过计数这N个视野，所获得的FD％值趋于稳定。
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