鸟苷酸结合蛋白5在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及鸟苷酸结合蛋白5(GBP5)的药物新用途，具体是其在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

鸟苷酸结合蛋白(guanylate binding proteins,GBPs)最早发现由干扰素γ诱导产生的，是干扰素诱导蛋白(interferon stimlate gene,ISG)的一员。干扰素γ诱导包括Mx蛋白在内的大量三磷酸鸟苷酶(Guanosine triphosphate enzyme,GTPase)，这些GTP酶包括p47免疫相关GTP酶(immunity-related GTPase,IRG)和鸟苷酸结合蛋白(guanylatebinding proteins,GBP)。GBP蛋白家族目前已经鉴定出11种鼠源的GBP蛋白以及7种人源的GBP蛋白。人源鸟苷酸结合蛋白5属于干扰素γ诱导的p65三磷酸鸟苷酶家族，与GTP、GDP和GMP有较强的亲缘关系，具有与鸟嘌呤结合的能力。GBP5被证明对γ磷酸基、β磷酸基有较强的连续水解功能。近年来的一些研究表明GBP5能促进炎症小体的形成，刺激炎症因子的表达。

I型干扰素包括IFNα、IFNβ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-ζ、IFN-κ、IFN-ν、IFN-τ、和IFN-ω。I型干扰素运用两条信号通路，Toll样受体(TLRs)和胞浆受体(cytosolic receptor)。I型干扰素有多种功能，例如抗病毒、抑制细胞生长和免疫调节作用。III型干扰素(Type IIIinterferon,IFNs),是一个新型的干扰素家族，位于第19号染色体q13上，包括3种λ干扰素：IFN-λ1(也被称为IL-29)、IFN-λ2(也被称为IL-28A)和IFN-λ3(也被称为IL-28B)。III型干扰素的信号转导与I型干扰素类似，激活Jak/STAT信号通路，转录多种IFN相关的基因。III型干扰素抑制病毒的复制保护宿主细胞免于病毒感染。

发明内容

本发明的目的是提供鸟苷酸结合蛋白5(GBP5)在制备抗病毒药物中的应用。

本发明通过体外实验发现流感病毒感染细胞后诱导GBP5上调，然后促进I型及III干扰素表达；以及GBP5能刺激免疫细胞产生I型和III型干扰素而具有广谱抗病毒功效。

具体采用以下技术方案：

GBP5在细胞和分子水平上对流感病毒复制有抑制作用，预示GBP5可以做为临床抗病毒药物而进一步研究开发。首先我们在季节性流感病人的临床样本包括血液PBMC和咽拭子中发现了GBP5的高表达，且与流感病毒呈正相关。然后我们在A549细胞、人外周血淋巴细胞和人肺泡二型原代细胞系中，发现A型流感病毒感染时诱导GBP5在mRNA和蛋白水平上的高表达。GBP5过表达能激活I型和III型干扰素以及干扰素诱导基因PKR、OAS、Mx的表达进而抑制病毒的复制，包括EV71、VSV、IAV等病毒。总体实验首次发现了GBP5能促进免疫细胞产生干扰素且激活下游通路而达到广谱抗病毒效果的机制。

进一步地，本发明提供GBP5在制备检测病毒感染的试剂盒中的应用。

本发明揭示了GBP5的一种新的生物学功能，能够诱导免疫细胞产生干扰素且激活干扰素下游通路进而发挥广谱抗病毒的作用，这一新发现为研制抗病毒药物提供理论基础。

本发明采用体内天然存在的蛋白GBP5，促进人体免疫细胞产生干扰素，不仅保证了其完整的生物学功能，而且避免了因引入异源性的成分而导致产生毒副作用。

附图说明

图1A型流感病毒可以上调GBP5在病人和原代细胞中的表达

A.A型流感病人和正常人咽拭子样本中GBP5的检测

B.临床水平上，A型流感病人咽拭子中GBP5与NP mRNA相关性分析

C.A/Hong Kong/H3N2感染PBMC细胞后，激活GBP5的表达

D.A/Hong Kong/H3N2感染ATII细胞后，激活GBP5的表达

E.A/Hong Kong/H3N2感染A549细胞后，激活GBP5的表达

F.A/Hong Kong/H3N2感染A549细胞后，激活GBP5蛋白水平的表达

图2 GBP5在A549细胞中能激活干扰素通路

A.瞬时转染GBP5蛋白到293T细胞中，IFNβ,IL29(IFNλ1),ISRE,NF-κB的启动子活性增强

B.瞬时转染GBP5蛋白到A549细胞中，I和III型干扰素mRNA水平表达上升

C.瞬时转染GBP5蛋白到A549细胞中，干扰素下游产物OAS1、PKR、MxA的mRNA和蛋白水平表达上升

图3 GBP5蛋白具有广谱抗病毒功能

A.A549细胞瞬时转染GBP5蛋白后感染A/Hong Kong/H3N2病毒，病毒三种RNA复制水平均被抑制

B.Huh7细胞瞬时转染GBP5蛋白后感染VSV病毒24小时后收集上清检测VSV病毒含量

C.Huh7细胞瞬时共转染GBP5和HBV1.3倍体，36小时后收集上清检测HBV的表面抗原和核心抗原，HBV的复制水平被抑制

D.RD细胞瞬时转染GBP5蛋白后感染EV71病毒12小时后收集细胞检测病毒VP1蛋白，病毒复制水平被抑制

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】流感病毒感染上调GBP5在A549细胞和PBMC中的表达

实验材料

1、临床样本

健康人全血和咽拭子来自献血志愿者，流感病人血清、咽拭子来自医院。

2、细胞、病毒毒株及质粒

人肺癌细胞系A549和A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，由本实验室保存。ATII细胞购自武汉原生原代生物医药科技有限公司。

3、生化试剂及试剂盒

F12K培养基,RPMI 1640培养基和胎牛血清(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)购自武汉生命生物技术公司

4、逆转录酶等

M-MLV逆转录酶和RNA抑制剂(RNasin)购自Promega公司

Trizol、dNTP和Oligo dT(18T)购自Invitrogen公司

SYBR Green PCR Master Mix，购自ABI公司

5、耗材及仪器

细胞培养板、细胞培养皿和细胞培养瓶购自Corning公司

4℃高速离心机、小型高速离心机、二氧化碳细胞培养箱和细胞操作台购自Herus

超纯水系统购自millipore

荧光定量PCR系统LightCycler480II购自Roche

RNA提取所使用的RNase free的各种型号枪头和EP管购自Eppendorf

ELx800^TM酶标仪购自Instruments，Inc

常规PCR仪购自东胜创新

实验方法

1、哺乳动物细胞(贴壁)的培养

细胞复苏

1)预先准备好37℃-38℃温水，从液氮罐中取出需要复苏的细胞，用眼科手术镊子固定，迅速置于水中，保证冻存管完全浸没于水中，使其均匀受热，直到冻存管内的细胞完全融化；

2)用酒精消毒冻存管；

3)用吸管预先吸取5ml细胞培养基于T25细胞培养瓶中，再用新的吸管将融化的细胞转移到细胞瓶中并轻轻吹打一遍；

4)盖好细胞瓶盖，将细胞瓶放置于细胞培养箱中，37℃，5％CO₂静置培养；

5)约6-8小时后(取决于不同的细胞)，更换新培养基以消除细胞冻存液中存留的DMSO对细胞生长的影响。

细胞的传代和冻存

1)当细胞长满T25细胞瓶后，用吸管吸取培养基并弃去；

2)加入10ml的PBS，轻柔洗涤细胞后用吸管吸取并弃去；

3)用吸管吸取1-1.5ml胰酶，使其覆盖住细胞瓶底部，将细胞瓶放入37℃，5％CO₂细胞培养箱静止3-5min(消化时间的长短取决于细胞种类)；

4)显微镜观察，贴壁细胞变圆并且全部从细胞瓶壁脱离；

5)在细胞操作台内，用吸管吸取约4ml培养基，加入细胞瓶内，轻柔的吹打，以吹散细胞和中和胰酶的消化效果；

6)用吸管吸取吹匀的细胞悬液(体积约1/3-2/3)到另一新的细胞瓶，再补加5ml的培养基，放置于细胞培养箱中，37℃，5％CO₂的环境下继续静置培养。

2、H3N2感染A549细胞

H3N2感染A549前，将含有胎牛血清的完全培养基换成无血清培养基，H3N2感染的剂量为1MOI,感染或处理24h后，收集培养上清进行下一步实验。

3、哺乳动物细胞的转染(以Lipofectamine 2000转染6孔细胞培养板为例)

1)细胞转染前，调整细胞密度，达到85％-90％，并将含胎牛血清的全培养基更换为无血清培养基；

2)按转染6孔板所需的质粒DNA的量和转染试剂的量分别稀释质粒DNA和转染试剂；6空板每空需4μg质粒DNA，用250μL opti-MEM稀释，转染试剂需要8μL，用250Μl opti-MEM稀释；

3)将稀释好的转染试剂溶液逐滴滴加到稀释好的质粒DNA溶液中，一边滴加一边轻弹EP管，注意，滴加的顺序一定不能反；

4)滴加混合好质粒DNA/转染试剂混合物后，放置室温孵育15-20min；

5)孵育完成后，将质粒DNA/转染试剂混合物滴加到细胞培养基中，轻柔混匀，放置37℃，5％CO₂细胞培养箱静置培养4-6h；

6)如果细胞株很敏感，培养培养4-6h后应更换培养液，除去转染复合物并加入新鲜含胎牛血清的完全培养基；

7)培养24-48h后，根据实验设计进行下一步实验。

4、逆转录荧光定量PCR检测目的基因mRNA的表达水平

1)逆转录反应体系如下

逆转录反应条件：37℃1h，75℃10min

2)Real-time反应体系

①目的基因的检测引物和内参引物

GBP5:5′-TCCTCGGATTATTGCTCGGC-3′(sense)

5′-CCTTTGCGCTTCAGCCTTTT-3′(antisense)

NP:5’-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3’(sense),

5’-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3’(antisense)

GAPDH:5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’(sense)

5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’(antisense)

②反应体系

③反应程序：

5、H3N2拷贝数快速检测方法(Real time PCR)

1)质粒浓度与拷贝数换算

①在分光光度计上，取2μL质粒溶液测定其浓度，重复几次，要求测得浓度值稳定，初步估计质粒纯度以及是否有蛋白质污染的状况。

②配制琼脂糖凝胶，检测质粒纯度及条带亮度。

③根据以下公式将浓度换算为质粒拷贝数：

amount：OD值(ng/μL)；

length：质粒DNA碱基对数目(bp)。

2)标准品制备

将上述已知拷贝数的质粒用灭菌去离子水进行稀释，如稀释到1×10¹⁰copies/μL，然后再进行倍比稀释，浓度依次为10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹copies/μL。以此作为测定H3N2拷贝数的标准品。

3)Real-time PCR

①反应体系：

②NP检测片段引物：

NP:5’-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3’(sense),

5’-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3’(antisense)

③反应程序：

实验结果和讨论

用检测试剂盒检测18份正常人和19份A型流感病人血清中的GBP5含量，发现流感病人组血清中的GBP5含量要明显高于正常人组(图1A)。收集了19份A型流感病人和正常人的咽拭子样本后，提取mRNA后用realtime PCR进行拷贝数绝对定量分析，发现A型流感的特异性基因NP与GBP5有显著的相关性(图1B)。当A型流感病毒1MOI A/Hong Kong/H3N2感染PBMC,ATII和A549细胞24小时发现GBP5的RNA水平(图1C,1D,1E)和蛋白水平(图1F)的表达量都有显著提高。

该部分实验表明临床结果中A型流感病人血清中GBP5水平要高于正常人，且咽拭子定量分析表明NP与GBP5具有相关性。而流感病毒感染A549细胞后也能上调GBP5的表达则为我们的后续实验，即A549细胞可以作为细胞模型来研究流感病毒诱导GBP5表达的分子机制。

【实施例2】GBP5可以激活干扰素及其下游通路反应

实验材料

1、细胞

PBMC来自献血志愿者、人肺癌细胞系A549来自保藏中心

2、生化试剂及试剂盒

Mx、PKR、OAS和IFNαR2抗体购自Santa Cruz Biotechnology,Inc.

人外周血单核细胞(PBMC)分离试剂pyrogen-free saline over Histopaque(Sigma,St.Louis,MO,USA)购自武汉天源生物技术公司

荧光素酶活性报告基因试剂盒购自Promega公司

3、耗材及仪器

超声破碎仪购自Fisher公司

凝胶成像系统、电泳仪及Western转膜仪购自北京君意东方公司

Western扫描系统购自日本富士公司

实验方法

1、逆转录荧光定量PCR检测目的基因mRNA的表达水平

1)细胞RNA提取及逆转录方法同前所述

2)荧光定量PCR引物

IFNα:5’-TTTCTCCTGCCTGAAGGACAG-3’(sense),

5’-GCTCATGATTTCTGCTCTGACA-3’(antisense)

IFNβ:5’-AAAGAAGCAGCAATTTTCAGC-3’(sense),

5’-CCTTGGCCTTCAGGTAATGCA-3’(antisense)

IFNλ1:5’-CTTCCAAGCCCACCCCAACT-3’(sense),

5’-GGCCTCCAGGACCTTCAGC-3’(antisense)

IFNλ2:5’-TTAAGAGGGCCAAAGATGC-3’(sense),

5’-TGGGCTGAGGCTGGATACAG-3’(antisense)

PKR:5’-AGAGTAACCGTTGGTGACATAACCT-3’(sense),

5’-GCAGCCTCTGCAGCTCTATGTT-3’(antisense)

OAS:5’-AGAAGGCAGCTCACGAAACC-3’(sense),

5’-CCACCACCCAAGTTTCCTGTA-3’(antisense)

Mx:5’-GCCGGCTGTGGATATGCTA-3’(sense),

5’-TTTATCGAAACATCTGTGAAAGCAA-3’(antisense)

2、荧光素酶活性的测定(以Promega Luciferase试剂盒为例)

1)取出Luciferase试剂盒，室温平衡1h；

2)荧光测定仪开机自检，并设定相应的参数；

3)待测细胞样品，弃去细胞培养基，并用预冷的PBS洗涤一次，加入Luciferase细胞裂解液，轻柔混匀，37℃裂解15min；

4)用移液枪吹打裂解物，并转移到新的EP管中；

5)4℃，12000rpm离心1min，转移上清至新的EP管中，弃去沉淀；

6)取样品100μL，加入Luciferase底物100μL，移液枪吹打混匀后，上机测定；

7)每次测定设3个平行复孔，最后的数据以Luciferase的读值和Renila读值的比值来表示。

3、Western检测蛋白表达水平

1)蛋白制样(以6孔细胞培养板培养细胞为例)：

①贴壁细胞弃去培养基贴壁细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗涤一次，再加入一定量的PBS，细胞刮轻柔刮动细胞生长面，收集细胞；

②4℃，2000rpm离心10min，收集细胞，弃去PBS上清；

③加入60-80μL已预先加好蛋白酶抑制剂Cocktail和终浓度为0.5mMDTT，预冷的细胞裂解液，用移液枪吹打，重悬细胞；

④超声破碎仪调至3档，冰上超声，每次3-5s，重复3次；

⑤4℃，12000rpm离心10min，将上清转移至另一新的EP管，即得到细胞总蛋白；

⑥测定样品蛋白浓度；

⑦按实验设计的上样量分装，加入loading buffer，煮沸样品5min制样，2)SDS-PAGE分离蛋白和转膜曝光：

①SDS-PAGE胶上样，Tris-gly缓冲液系统电泳分离蛋白，90V进浓缩胶，110V进分离胶，以预染的蛋白质marker为指示；

②将SDS-PAGE胶从电泳系统中取下，浸入转膜缓冲液平衡，同时将相应大小的NC膜也浸入转膜缓冲液平衡；

③按转膜垫、三层滤纸、NC膜、SDS-PAGE胶、三层滤纸、转膜垫的三明治模型制备转膜芯体系，放入转膜槽，负极对SDS-PAGE胶，正极对NC膜，并且NC膜和SDS-PAGE胶的接触面事先做好标记；

④4℃，70V恒压转膜2h；转膜结束，撤下NC膜，用圆珠笔根据预染的蛋白质marker的位置，划定标识，用丽春红预染，粗略判断目的蛋白是否转膜成功；

⑤PBS洗去丽春红，5％的脱脂牛奶室温封闭1-2h；PBS洗去脱脂牛奶，用PBS根据说明书的介绍稀释一抗，室温孵育1h；

⑥TBS-T洗膜缓冲液，摇床洗膜5次，每次5min；用PBS根据说明书的介绍稀释二抗，室温孵育30min；

⑦TBS-T洗膜缓冲液，摇床洗膜5次，每次10min；

⑧滤纸吸干膜上的洗膜缓冲液，按比例加入曝光底物，暗处孵育5min；

⑨Western扫描系统采集信号分析

实验结果和讨论

通过前面的实验我们已经证明，A型流感病毒感染A549细胞后会上调GBP5，作为一种炎症因子，在病毒刺激后高水平的表达，必然会激活下游的特定的通路来调节体内炎症因子网络以达到一种动态的平衡或者起到抑制病毒复制的效果。在A549中瞬时转染GBP5蛋白，在启动子水平检测了IFNβ,IFNλ1(IL29)，ISRE和NF-κB启动子的活性，在mRNA水平检测了IFNα、IFNβ、IFNλ1(IL29)三种干扰素的表达水平，发现GBP5能激活干扰素启动子的表达(图2A)以及mRNA水平的表达(图2B)。于是为了进一步确定GBP5是否能促进干扰素通路的激活，我们做了干扰素下游产物OAS1、PKR、MxA的mRNA水平和蛋白水平的检测，发现GBP5蛋白确实能够在A549细胞中促进I型干扰素的表达并激活其下游的通路(图2C)。

综合这部分的实验，我们可以得出A型流感病毒感染细胞后促进GBP5表达，从而上调干扰素，激活干扰素下游通路，这可能为后续研究GBP5在免疫炎症网络中的新的生物学功能提供了前提。

【实施例3】GBP5具有广谱抗病毒的功效

实验材料

1、细胞、病毒株及质粒

人肺癌细胞系A549、横纹肌肉瘤RD细胞、Huh7细胞和A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2均由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，由本实验室保存；

EV71(C4型)：由湖北省襄樊市一例EV71感染死亡幼儿脑内分离得到，本实验室保存；

VSV-eGFP:由武汉大学陈明周实验室提供，本实验室保存；

pBlue-HBV1.3-NEO质粒由本实验室任文丹构建并保存；

2、生化试剂及试剂盒

转染试剂Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen)

高纯度转染用质粒提取试剂盒购自博大泰克公司

乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒和乙型肝炎病毒s抗原诊断试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司

3、耗材及仪器

荧光显微镜

荧光定量PCR仪

ELx800^TM酶标仪

实验方法

1、荧光定量PCR测定H3N2病毒各种RNA含量(Real-Time PCR)

1)H3N2感染A549细胞前，将含有胎牛血清的完全培养基换成无血清培养基，H3N2感染的剂量为1MOI,感染或处理3h后，收集细胞进行下一步实验；

2)按照说明书提取RNA，并进行逆转录以及Real-time PCR，方法同前所述；3)荧光定量PCR中所使用的引物：

逆转录：mRNA(5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)，

cRNA(5’-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3’)，

vRNA(5’-CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3’)，

定量PCR：NP(sense 5’-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3’

antisense 5’-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3’)

γ-actin(sense 5’-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3’

antisense 5’-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3’)，

2、哺乳动物细胞的转染

同前所述。

3、乙型肝炎病毒e/s抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)

1)每孔加入待测样品50μL，设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照(或阳性对照)各50μL，并设空白对照1孔；

2)每孔加入酶结合物50μL(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37度孵育30分钟；

3)手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干；

4)每孔加显色剂A液、显色剂B液各50μL，充分混匀，封板，置37度孵育15分钟；

5)每孔加入终止液50μL，混匀；

6)用酶标仪读数，取波长450nm，参考波长630nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值；

实验结果和讨论

已有很多研究结果报道干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用，而前面的实验已经证明GBP5能够在A549细胞中上调干扰素并激活其下游通路。所以我们进一步研究GBP5是否能够通过介导干扰素而发挥广谱抗病毒的功效。

为了验证是否sGBP5激活的I型干扰素能够发挥抗病毒作用，我们首先瞬转GBP5到A549细胞中，然后用1MOI A/Hong Kong/H3N2感染A549细胞1.5h，孵育6h后收集细胞，检测病毒3种RNA的表达水平。结果显示，瞬时转染了GBP5蛋白与对照相比，细胞感染病毒后的mRNA、cRNA、vRNA水平均被明显抑制(图3A)，这说明GBP5在A549细胞中对A/Hong Kong/H3N2病毒复制有抑制作用。

其次，Huh7细胞瞬时转染GBP5蛋白后，用1MOI的VSV病毒感染24小时后收集上清，接着同时用上清稀释成不同浓度感染vero细胞2小时候洗去，用病毒噬斑检测VSV病毒含量，发现转染了GBP5的huh7细胞能抑制VSV的复制(图3B)。然后，我们用构建的HBV侵染性克隆质粒pBlue-HBV1.3-NEO瞬时转染Huh7细胞同时瞬转GBP5蛋白，收集上清用ELISA法检测HBeAg和HBsAg的表达量，发现GBP5在Huh7细胞中对乙肝病毒有抑制作用(图3C)。最后，RD细胞瞬时转染GBP5蛋白后，加入1MOI EV71(C4型)病毒感染12h，再收集细胞，western检测病毒VP1蛋白，发现病毒VP1蛋白含量同样减少，表明转染GBP5后在RD细胞中对EV71(C4型)病毒复制有抑制作用。(图3D)。

以上实验结果表明，GBP5对H3N2、EV71、HBV和VSV病毒复制都具有一定程度的抑制作用，对GBP5具有广谱抗病毒效果做了验证，为进一步研究其抗病毒机制以及生物医药应用提供了依据。