一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法

技术领域

本发明涉及一种定量测定植物糖代谢中的糖酵解和磷酸戊糖途径份额的方法，属于生物生理生化领域。

背景技术

生物在不利生境条件下，往往通过在形态和生理上发生改变使它们能适应环境的变化以获得生存的机会。生物的生长发育都是以代谢为基础。因此，判断生物在逆境情况下代谢系统发生的复杂变化，是研究植物对环境的适应性的基础。葡萄糖代谢是维持生命体基本活动的最重要的代谢过程，为生命体提供能量、还原力和合成其他生物大分子的底物。生命体内葡萄糖的代谢途径有很多种，分别是糖酵解途径、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径、有氧氧化途径、多元醇途径、糖原合成与糖原分解、糖异生以及其他己糖代谢。其中，糖酵解途径和磷酸戊糖途径是葡萄糖的两个最主要的代谢途径，两者占葡萄糖代谢的份额超过80％，在植物体中占的比例更大。糖酵解途径为生命体提供进行生命活动所必须的能量---ATP，而磷酸戊糖途径为生命体提供物质合成和抵抗不利环境所需的还原力---NAPDH。

研究代谢途径的调控情况，常常通过研究其限速酶的活性变化来进行。在糖酵解途径中，磷酸果糖激酶(PFK)是此途径的限速酶，其功能是不可逆的催化果糖-6-磷酸生成果糖-1，6-二磷酸，导致葡萄糖进入糖酵解途径进行代谢；而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径的限速酶，其功能为催化葡萄糖-6-磷酸不可逆的转化为6-磷酸葡萄糖酸，从而导致葡萄糖进入磷酸戊糖途径进行代谢。

以往常常通过研究一个代谢途径或几个代谢途径的变化情况来研究植物葡萄糖代谢在环境变化时发生的改变，这样的研究方法割裂了各个代谢途径之间的联系，难以反映各代谢途径之间的影响，不能够反映生物葡萄糖代谢整体的变化情况。因此，建立一种能反映葡萄糖代谢整体变化趋势的方法，对研究生物葡萄糖代谢在环境变化时的歧化情况具有极其重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用糖酵解途径和磷酸戊糖途径限速酶酶活力比值判断葡萄糖代谢歧化情况的方法，以克服现有技术难以反映葡萄代谢整体变化情况的弱点。

本发明采取以下技术方案：它包括以下步骤：

第一，选取待测植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；

第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；

第三，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力EA_pfk；

第四，测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA_g6pdh；

第五，将磷酸果糖激酶的酶活力EA_pfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA_g6pdh累加获得糖代谢关键酶的总活性EA_∑，计算公式为EA_∑＝EA_pfk+EA_g6pdh；

第六，依据磷酸果糖激酶的酶活力EA_pfk和糖代谢关键酶的总活性EA_∑，计算出糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP，计算公式为P_EMP＝EA_pfk/EA_∑；

第七，依据葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA_g6pdh和糖代谢关键酶的总活性EA_∑，计算出糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP；计算公式为P_PPP＝EA_g6pdh/EA_∑；

第八，依据糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P，计算公式为P＝P_EMP/P_PPP。

在第二步中，酶液的提取方法为：取的叶片组织放置于冰浴研钵中，加入液氮进行冷冻研磨，待液氮挥发后，加入酶提取液；把研磨后的匀浆移入离心管中，离心，取上清液冷藏待测；其中酶提取液为50mM HEPES Tris-HCl(pH 7.8)，3mM MgCl₂，1mM>

在第四步骤中，酶液中磷酸果糖激酶的酶活力EA_pfk的测定方法为：磷酸果糖激酶的酶活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力；ATP-PFK酶活力的测定方法如下，把200μL酶提取液加入到1.8mLATP-PFK酶活分析液中，利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液中5min的吸光度的变化D1；ATP-PFK酶活分析液pH>2，0.1mM>2，0.1mM>pfk可表示为D1+D2；这里的PFK为磷酸果糖激酶，ATP为三磷酸腺苷，PPi为焦磷酸，NADH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型辅酶I。

在第五步骤中，酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA_g6pdh的测定方法为：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力等于G6PDH和6PGDH总酶活力减去6PGDH酶活力；测定G6PDH和6PGDH的总活力的方法为：把200μL酶提取液加入到1.8mL>T；G6PDH和6PGDH总酶活分析液pH>2，0.5mM>2；6PGDH的酶活力的测定方法：把200μL酶提取液加入到1.8mL>P；6PGDH酶活分析液pH>2，0.5mM>2；酶液中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA_g6pdh可表示为D_T-D_P；这里的G6PDH为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6PGDH为6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，NADPNa₂为氧化型型辅酶II二钠盐。

在第六、七和八步骤中，糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的磷酸戊糖途径份额以及糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例均以百分比值来进行体现。

本发明的优点如下：

1)由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或还原型辅酶II(NADPH)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或还原型辅酶I(NADH)在340nm的毫摩尔消光系数均为6.22mM^-1cm^-1，测出的磷酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力量纲相同，一个单位的葡萄糖通过糖酵解途径消耗2个单位的NADH，而通过PPP途径恰好生成2个单位的NADPH，因此，用磷酸果糖激酶的酶活力和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力代表两个途径无需归一化，计算出的糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的磷酸戊糖途径份额以及糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例具有可靠性

2)能快速定量不同环境下植物体糖代谢中的糖酵解途径份额、糖代谢中的磷酸戊糖途径份额以及糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例，测定结果具有可比性。

3)本方法无需测定酶液中的蛋白质浓度，步骤少，计算简单。

4)本方法克服了现有研究将糖酵解途径和磷酸戊糖途径割裂开来的缺点，可以整体反映植物在环境变化时葡萄糖代谢的歧化情况以及葡萄糖代谢在各途径中的分配情况。

本发明的基本原理为：

对限速酶活力的研究是研究葡萄糖代谢途径的基本手段。限速酶的酶活力能够代表该途径进行葡萄糖代谢的活跃程度。磷酸果糖激酶(PFK)是此糖酵解途径的限速酶，而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖途径的限速酶，而磷酸果糖激酶(PFK)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)酶活力的比值可以代表葡萄糖代谢在糖酵解途径和磷酸戊糖途径之间的分配情况。

当生物体内的葡萄糖通过糖酵解途径进行代谢生成甘油时，会消耗生物体内的还原性辅酶I(NADH)，而还原性辅酶I(NADH)的消耗能够通过吸光度的变化来进行测量，即可以通过测定一定波长下吸光度的变化来测量糖酵解途径关键酶PFK的酶活力。而在生物体内的葡萄糖通过磷酸戊糖途径进行代谢时，会在生物体内生成还原性辅酶II(NADPH)，同样NADPH的增加也能够通过吸光度的变化来进行测量，即也可以通过测定一定波长下吸光度的变化来测量磷酸戊糖途径关键酶G6PDH的酶活力。

生物体酶液的提取。取0.1g的生物组织放置于冰浴研钵中，加入液氮进行冷冻研磨，待液氮挥发后，加入1mL酶提取液，其中含有50mM HEPES Tris-HCl(pH 7.8)，3mM MgCl₂，1mM>

PFK的总活力等于ATP-PFK酶活力加上PPi-PFK酶活力。ATP-PFK酶活力的测定方法如下，把200μL酶提取液加入到1.8mLATP-PFK酶活分析液中以测定ATP-PFK的酶活，ATP-PFK酶活分析液包括50mM HEPES Tris-HCl(pH 7.8)，2.5mM MgCl₂，0.1mM>2，0.1mM>+的速率的变化情况。

G6PDH酶活的值等于G6PDH和6PGDH总酶活值减去6PGDH酶活值。首先测定G6PDH和6PGDH(6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)的总活力，把200μL酶提取液加入到1.8mL G6PDH和6PGDH总酶活分析液中以测定G6PDH和6PGDH的总酶活。G6PDH和6PGDH总酶活分析液包括50mM HEPES Tris-HCl(pH 7.8)，3.3mM MgCl₂，0.5mM>2。把200μL酶提取液加入到1.8mL>2，0.5mM>2。利用紫外分光光度计在340nm处测定反应混合液的光吸收，以测量反应混合液中NADP⁺还原为NADPH的速率的变化情况。

酶活力的计算公式见式1，其单位为nmol min^-1mg^-1Pr。

$\rho =\frac{\left(\frac{\Delta A}{\Delta t}\right)\times \frac{1}{{ϵ}_{\mu M}}\times 1000\mu L}{C_{\mathrm{Pr}}\times V_E\mu L}---\left(1\right)$

ΔA为在测定时间Δt(min)内反应系统在测定波长的吸光值的变化；

V_E为测定的酶液加入的体积(μL)；

ε_μM为所用的底物的微摩尔消光系数，可由底物的标准曲线求出。

C_Pr为酶液的蛋白浓度(g>-1或μg>-1)。

NADPH和NADH在340nm的毫摩尔消光系数均为6.22mM^-1cm^-1，其微摩尔消光系数即0.00622μM^-1m^-1，其意义即在1cm的光路中1.0μmol>-1浓度的NADPH或NADH其在340nm的吸光值为0.00622。

由以上的方法和式1，可以计算出PFK酶活力为EA_pfk，G6PDH酶活力为EA_g6pdh，同时假设生物体内参与葡萄糖代谢的代谢途径的关键酶的总活性为EA_∑，除糖酵解途径和磷酸戊糖途径之外参加葡萄糖代谢的各途径的限速酶活力为EA_else，且各途径的限速酶的活力代表了该途径进行葡萄糖代谢的活跃程度。则生物体内参与葡萄糖通过糖酵解途径代谢的占比P_EMP可表示为：

P_EMP＝EA_pfk/(EA_pfk+EA_g6pdh+EA_else)×100％(2)

同理，磷酸戊糖途径在葡萄糖代谢中的占比P_PPP可表示为：

P_PPP＝EA_g6pdh/(EA_pfk+EA_g6pdh+EA_else)×100％>

在式3和式4中，因为EA_else的占比很小，且我们只研究PFK和G6PDH的酶活力关系，在此我们对其忽略。所以，糖酵解途径进行葡萄糖代谢与磷酸戊糖途径进行葡萄糖代谢之比可简单的表示为：

P＝P_EMP/P_PPP＝EA_pfk:EA_g6pdh>

由于测定时间Δt、酶液加入的体积、所用的底物的微摩尔消光系数ε_μM以及酶液的蛋白浓度相同，所以无论是磷酸果糖激酶的酶活力EA_pfk还是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力都可以以单位体积单位时间吸光度变化值表示其活力，它们的比值更是如此。

具体实施方式

本发明的实例：它包括以下步骤：

第一，选取待测植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；

第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；

第三，分别测定上述提取的酶液中以单位体积单位时间吸光度变化值表示的磷酸果糖激酶活力EA_pfk和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA_g6pdh；

第四，将磷酸果糖激酶的酶活力EA_pfk与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力A_g6pdh代入公式EA_∑＝EA_pfk+EA_g6pdh中，获得糖代谢关键酶的总活性EA_∑；

第五，分别将磷酸果糖激酶的酶活力EA_pfk、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活力EA_g6pdh和糖代谢关键酶的总活性EA_∑代入公式P_EMP＝EA_pfk/EA_∑、P_PPP＝EA_g6pdh/EA_∑计算出糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP；

第六，将糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP代入到公式P＝P_EMP/P_PPP中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P。

实施例1

第一，选取对照环境中构树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；

第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；

第三，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶磷酸果糖激酶(PFK)的酶活力EA_pfk和磷酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶活力EA_g6pdh；计算糖代谢关键酶的总活性EA_∑；

第四，将EA_pfk、EA_g6pdh和EA_∑分别带入P_EMP＝EA_pfk/EA_∑、P_PPP＝EA_g6pdh/EA_∑计算出糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP；

第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP代入到公式P＝P_EMP/P_PPP中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P。

实施例2

第一，选取对照环境中桑树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；

第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；

第三，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶磷酸果糖激酶(PFK)的酶活力EA_pfk和磷酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶活力EA_g6pdh；计算糖代谢关键酶的总活性EA_∑；

第四，将EA_pfk、EA_g6pdh和EA_∑分别带入P_EMP＝EA_pfk/EA_∑、P_PPP＝EA_g6pdh/EA_∑计算出糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP；

第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP代入到公式P＝P_EMP/P_PPP中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P。

实施例3

第一，选取胁迫环境1中构树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；

第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；

第三，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶磷酸果糖激酶(PFK)的酶活力EA_pfk和磷酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶活力EA_g6pdh；计算糖代谢关键酶的总活性EA_∑；

第四，将EA_pfk、EA_g6pdh和EA_∑分别带入P_EMP＝EA_pfk/EA_∑、P_PPP＝EA_g6pdh/EA_∑计算出糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP；

第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP代入到公式P＝P_EMP/P_PPP中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P。

实施例4

第一，选取胁迫环境1中桑树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；

第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；

第三，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶磷酸果糖激酶(PFK)的酶活力EA_pfk和磷酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶活力EA_g6pdh；计算糖代谢关键酶的总活性EA_∑；

第四，将EA_pfk、EA_g6pdh和EA_∑分别带入P_EMP＝EA_pfk/EA_∑、P_PPP＝EA_g6pdh/EA_∑计算出糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP；

第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP代入到公式P＝P_EMP/P_PPP中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P。

实施例5

第一，选取胁迫环境2中构树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；

第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；

第三，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶磷酸果糖激酶(PFK)的酶活力EA_pfk和磷酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶活力EA_g6pdh；计算糖代谢关键酶的总活性EA_∑；

第四，将EA_pfk、EA_g6pdh和EA_∑分别带入P_EMP＝EA_pfk/EA_∑、P_PPP＝EA_g6pdh/EA_∑计算出糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP；

第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP代入到公式P＝P_EMP/P_PPP中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P。

实施例6

第一，选取胁迫环境2中桑树植株，取第二、第三和第四完全展开叶各一片；

第二，将上述叶片剪碎充分混合，取其中0.1g进行酶液的提取；

第三，测定构树叶片中糖酵解途径限速酶磷酸果糖激酶(PFK)的酶活力EA_pfk和磷酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶活力EA_g6pdh；计算糖代谢关键酶的总活性EA_∑；

第四，将EA_pfk、EA_g6pdh和EA_∑分别带入P_EMP＝EA_pfk/EA_∑、P_PPP＝EA_g6pdh/EA_∑计算出糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP；

第五，最后，将糖代谢中的糖酵解途径份额P_EMP和糖代谢中的磷酸戊糖途径份额P_PPP代入到公式P＝P_EMP/P_PPP中，计算出糖代谢中的糖酵解途径和磷酸戊糖途径的比例P。

本发明的实施效果如下：

分别将构树和桑树分成三个处理组培养，三个处理组分别是对照组(1/2Hoagland营养液)、胁迫组1(1/2Hoagland营养液+80g>-1PEG6000)和胁迫组2(1/2Hoagland营养液+30mM>3)。培养6天后分别取叶片测定植株叶片中磷酸果糖激酶(PFK)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的活性，并计算出糖酵解途径和磷酸戊糖途径之间的比值P_EMP：P_PPP，其结果如以下表所示(表1)。

从表1中可以看出，桑树和构树在对照条件下P_EMP：P_PPP的比值分别为74％：26％和76％：24％，其结果较为接近。在胁迫条件下，我们可以看到P_PPP的比值分布在52％—64％之间，这与逆境下植物以增强磷酸戊糖途径来适应环境的事实相符的。也与前人的估算结果相近的。

表1 桑树和构树在不同处理条件下糖酵解途径和磷酸戊糖途径之间的比值

从以上数据可看出，利用本发明获取葡萄糖代谢在EMP途径和PPP途径之间分配比例的方法简单可靠，能够很好的说明在不同环境条件下生物体内葡萄糖在EMP途径和PPP途径之间的歧化情况。