一种高效液相色谱拆分手性药物拉米夫定的方法

【技术领域】

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种手性药物拉米夫定的拆分方法。

【背景技术】

手性药物是指药物分子结构中引入手性中心后，得到一对互为实物与镜像的对映体。目前发现合成的很大一部分药物具有手性，而手性药物中的一个对映体可能是有效成分，可以与人体的手性环境相匹配，从而发挥应有的药效；而另一个对映体可能是低效无效甚至是有毒的。因此，开发和研究手性对映体的拆分技术以用于医药质量控制具有非常重要的现实意义。

拉米夫定是一种嘧啶核苷类抗病毒药物，主要用于慢性乙型肝炎的治疗，它也存在两种异构体，拉米夫定(左旋体)和拉米夫定右旋体，其结构式如下：

拉米夫定(左旋体)主要抑制HBV DNA多聚酶，基本不与人类DNA多聚酶发生反应，是拉米夫定的有效成分。而拉米夫定右旋体可抑制人线粒体DNA的合成，引起周围神经病变，属于拉米夫定的杂质部分。

目前，常用于手性药物拆分的方法有酶法、化学法、超临界色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法和分子印迹法等。与其他手性拆分方法相比，高效液相色谱法具有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广的优点，用它对手性药物拉米夫定进行拆分，可以快速准确的将拉米夫定的两种对映体拆分开来，并且可进一步对拉米夫定进行定量分析。

【发明内容】

本发明的发明目的在于：提供一种手性药物拉米夫定的高效液相色谱系统的拆分方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种高效液相色谱拆分手性药物拉米夫定的方法，是以环糊精类手性柱作为固定相，以缓冲液磷酸三乙胺和有机改性剂作为流动相，采用正相流动相系统，在设定的温度、流速和紫外检测波长条件下，对手性药物拉米夫定进行拆分；所述的有机改性剂为甲醇和四氢呋喃的混合液，两者以体积比9:1混合，且在使用前使用0.22μm的有机过滤膜进行抽滤，并用超声波进行5～10min的脱气处理。

在本发明中，进一步地，所述的环糊精类手性柱的填料为双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]-β-环糊精，缩写为β-CD-B₂。

在本发明中，进一步地，所述的缓冲液磷酸三乙胺的浓度为5×10^-3mol/L，pH＝3.6-4.8，且在使用前使用0.22μm的水系膜进行抽滤，并用超声波进行5～10min的脱气处理。

在本发明中，进一步地，所述流动相中缓冲液磷酸三乙胺：有机改性剂的体积比为40-50％：60-50％。。

在本发明中，进一步地，所述的正相流动相系统的正相柱再生方法为：依次以20～30倍的色谱柱体积的正乙烷、异丙醇、二氯甲烷和甲醇(B泵，100％体积)作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗；本发明使用的色谱柱体积为8mL,则上述每种流动相的使用体积应为200mL(取25倍)，以1mL/min的流速进行清洗，即每种流动相冲洗色谱柱200min，且正乙烷、异丙醇、二氯甲烷和甲醇在使用前均需用0.22μm的有机过滤膜进行抽滤，并用超声波进行5～10min的脱气处理。

在本发明中，进一步地，所述的手性药物拉米夫定的浓度为2.26×10^-4mol/L,进样量为20μL。

在本发明中，进一步地，所述的温度为22-25℃。

在本发明中，进一步地，所述的所述的流速为0.5-1.0mL/min.。

在本发明中，进一步地，所述的紫外检测波长为260-275nm。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)采用的拆分方法为高效液相色谱法，与其他拆分方法相比，高效液相色谱法具有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广的优点。能够快速准确的对手性药物进行拆分。

(2)本发明所使用的色谱柱为自己设计填充的类环糊精手性柱，填料为双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]-β-环糊精，具有良好的刚性和热稳定性，使得色谱柱更加耐用和高效，提高了拆分的效率和准确度。

(3)本发明采用高效液相色谱对手性药物拉米夫定进行拆分，是一个创新型的拆分方法，根据检索的资料显示，对于手性药物拉米夫定拆分方面的研究寥寥无几，仅有一篇资料显示过利用高效毛细管电泳法对拉米夫定进行了手性拆分，目前还没有利用高效液相色谱对拉米夫定进行拆分的发明，因此，该发明无论是对于学术方面还是制药方面，都具有重大的现实意义。

【具体实施方式】

在不同的色谱条件下，使用高效液相色谱仪对手性药物拉米夫定进行拆分前，都要先实施以下几个实验步骤：

1)高效液相色谱仪的清洗

以蒸馏水和甲醇作为流动相(均分别用0.22μm的水系膜和有机过滤膜过滤，并进行脱气处理)，A泵连接蒸馏水，B泵连接甲醇。以流速为1mL/min进行清洗，流动相中蒸馏水的比例从100％-0％(依次增加15％)，甲醇的比例从0％-100％(依次增加15％)，每个比例梯度清洗1h。

2)色谱柱填料的选择

本发明选用的色谱柱填料为双[-6-氧-(3-脱氧柠檬酸单酯-4)]-β-环糊精(缩写为β-CD-B₂)。

3)色谱柱的清洗

本发明选择正相流动相系统的再生：依次以20-30倍的色谱柱体积的正乙烷、异丙醇、二氯甲烷和甲醇(B泵，100％体积)作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗。本实验使用的色谱柱体积为8mL,则上述每种流动相的使用体积应为200mL(取25倍)，以1mL/min的流速进行清洗，即每种流动相冲洗色谱柱200min。

4)药品前处理

将高浓度的手性药物拉米夫定用蒸馏水进行稀释，配制成2.26×10^-4mol/L的样品溶液，并用0.22μL的微孔滤膜过滤；将有机改性剂甲醇和四氢呋喃以体积比9:1进行混合，并用0.22μm的有机过滤膜过滤；配制浓度为5×10^-3mol/L，pH分别为3.6、4.2和4.8的缓冲液磷酸三乙胺，并用0.22μm的水系膜过滤；流动相在使用前用超声波进行5-10min的脱气处理。

实施例1

1.色谱条件的设定

(1)缓冲液磷酸三乙胺pH为3.6，流动相中缓冲液磷酸三乙胺：有机改性剂甲醇和四氢呋喃混合液的体积比为40％：60％，并用超声波进行5min脱气处理。

(2)检测温度为22℃。

(3)流动相的流速设为0.5mL/min。

(4)紫外检测波长设为260nm。

2.进样进行拆分

按上述的色谱条件运行高效液相色谱柱，待基线平稳且基线波动在0.2mAu范围内时，用微量进样器取处理好的手性药物拉米夫定20μL,注射到高效液相色谱仪的进样系统中，进行拆分。

实施例2

1.色谱条件的设定

(1)缓冲液磷酸三乙胺pH为4.2，流动相中缓冲液磷酸三乙胺：有机改性剂甲醇和四氢呋喃混合液的体积比为45％：55％，并用超声波进行7min脱气处理。

(2)检测温度为23℃。

(3)流动相的流速设为0.7mL/min。

(4)紫外检测波长设为270nm。

2.进样进行拆分

按上述的色谱条件运行高效液相色谱柱，待基线平稳且基线波动在0.2mAu范围内时，用微量进样器取处理好的手性药物拉米夫定20μL,注射到高效液相色谱仪的进样系统中，进行拆分。

实施例3

1.色谱条件的设定

(1)缓冲液磷酸三乙胺pH为4.8，流动相中缓冲液磷酸三乙胺：有机改性剂甲醇和四氢呋喃混合液的体积比为50％：50％，并用超声波进行10min脱气处理。

(2)检测温度为25℃。

(3)流动相的流速设为1.0mL/min。

(4)紫外检测波长设为275nm。

2.进样进行拆分

按上述的色谱条件运行高效液相色谱柱，待基线平稳且基线波动在0.2mAu范围内时，用微量进样器取处理好的手性药物拉米夫定20μL,注射到高效液相色谱仪的进样系统中，进行拆分。

在上述3个实施例所设定的色谱条件下，对手性药物拉米夫定进行的拆分，都实现了基线分离，分离度分别为4.36、4.43和4.40，且保留时间均在7min内，峰型好。