基于桑白皮中雌激素样成分的筛选方法、雌激素作用验证方法及应用

技术领域

本发明涉及中药有效成分的新用途，具体涉及基于桑白皮中雌激素样成分的筛选方法、雌激素作用验证方法及应用。

背景技术

目前，由发现的植物雌激素的化学结构主要包括黄酮类、香豆素类、木脂素类及二苯乙烯类、萜类、甾醇类等。因其与内源性雌激素结构相似，可与ER结合，作用于靶基因调节区域的雌激素受体反应原件上，启动下游靶基因的转录，可发挥雌激素样作用或抗雌激素样作用，在女性更年期疾病的治疗中有较为显著的疗效。随着研究的系统深入，发现植物雌激素不仅是作为雌激素的替代品出现，还可以治疗或辅助治疗多种疾病，对人体的生殖系统、免疫系统、神经系统、循环系统等都有显著效应。

桑白皮作为临床常用药，其应用研究融合了现代科学与中医理论。近年来，桑白皮不仅引起了中药化学研究领域极大的关注，同时其药理作用也被广泛挖掘。随着分离筛选纯化方法的发展，桑白皮中多种新的药用成分和生物活性不断被发现。目前桑白皮已分离鉴定的化学成分有黄酮类、呋喃类、香豆素类、萜类、甾醇类、糖类及挥发油类、茋类等。而黄酮类、茋类物质分别具有黄酮母核、二苯乙烯的化学结构，它们是雌激素样作用活性物质发挥作用的重要药效结构。但关于桑白皮雌激素样作用的报道还没有。

发明内容

本发明设计开发了基于桑白皮中雌激素样成分的筛选方法，目的是筛选出桑白皮中具有雌激素样活性的药效成分。

本发明还设计开发了基于桑白皮中雌激素样成分的雌激素样作用验证方法，目的是验证桑白皮中具有雌激素样作用的活性单体氧化白藜芦醇的雌激素作用。

本发明还设计开发了基于桑白皮中雌激素样成分的应用，目的是为临床提供新的可作为用于雌激素的替代治疗的植物雌激素。

本发明提供的技术方案为：

基于桑白皮中雌激素样成分的筛选方法，包括：

选取桑白皮中多种待测试化合物；

在所述待测试化合物中通过雌激素活性筛选实验筛选出显著促进乳腺癌细胞增殖的化合物；以及

通过分子对接实验筛选出对乳腺癌细胞具有较强亲和力的化合物；

在筛选后的所述化合物中确定最终具有雌激素样的化合物。

优选的是，所述最终具有雌激素样的化合物为氧化白藜芦醇。

优选的是，所述雌激素活性筛选实验包括如下步骤：

使用10％胎牛血清的DMEM含酚红的培养基对乳腺癌细胞进行常规培养，待细胞铺满瓶壁80％以上时，对细胞进行消化后，取1/3接种于新的培养瓶内，置于培养箱内培养，在增殖实验前一代将培养基换为10％经活性炭处理的胎牛血清无酚红的DMEM培养基，置于培养箱内培养至对数生长期时，调整细胞浓度，用2.5％经活性炭处理的胎牛血清无酚红的DMEM培养基进行接种后在培养箱内培养24小时，后加入含有不同浓度化合物的2.5％经活性炭处理的胎牛血清无酚红的DMEM培养基继续培养72小时，加入MTT，4小时后吸弃培养板内液体，加入DMSO 100μL/孔，对所述细胞进行光密度值检测。

优选的是，所述雌激素活性筛选实验以及分子对接实验中使用所述待测试化合物浓度为0.1μM～10μM。

优选的是，在所述分子对接实验中，对所述待测试化合物进行去盐、加氢以及离子化处理，对所述乳腺癌细胞中的结合受体去除蛋白周围的水分子和共晶的小分子配体，并对蛋白结构加氢进行能量最小化处理。

优选的是，在所述分子对接实验中，筛选出所述待测试化合物中与雌激素受体ERα和/或ERβ的具有较强亲和力的化合物。

通过细胞转染实验对桑白皮中雌激素样成分的雌激素作用验证方法，包括：所述细胞转染实验包括人宫颈癌细胞和/或乳腺癌细胞的细胞转染实验；

其中，人宫颈癌细胞转染实验包括如下步骤：准备待转染细胞，采用脂质体法转染质粒后加入含有浓度为0.1μM～10μM的氧化白藜芦醇，在孵箱中培养，采用双荧光素酶报告检测系统测定其发光值，与空白组对照组进行比较，氧化白藜芦醇增强人宫颈癌细胞ER转录活性；

乳腺癌细胞转染实验包括如下步骤：准备待转染细胞，加入携带有GFP表达基因的质粒和转染试剂的混合液后，培养6小时，加入含有浓度为0.1μM～10μM的氧化白藜芦醇，培养24小时后观察荧光结果，与空白对照组进行比较，氧化白藜芦醇增强乳腺癌细胞ER转录活性。

通过乳腺癌细胞ER基因表达实验对桑白皮中雌激素样成分的雌激素作用验证方法，包括如下步骤：向待实验细胞内加入浓度为0.1μM～10μM的氧化白藜芦醇培养24小时后，对细胞进行总RNA提取及浓度测定，通过RNA进行逆转录合成cDNA，通过cDNA合成RT-PCR，测定每个实验中的反应体系内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，与拷贝量呈负对数关系，与空白对照组进行比较，氧化白藜芦醇促进乳腺癌细胞的ER诱导基因表达。

通过乳腺癌细胞蛋白表达实验对桑白皮中雌激素样成分的雌激素作用验证方法，包括如下步骤：向待实验细胞内加入含有浓度为0.1μM～10μM的氧化白藜芦醇进行培养，然后对细胞进行蛋白提取，对ERα、ERβ蛋白进行含量检测，与空白对照组进行比较，氧化白藜芦醇增强ERα、ERβ蛋白表达。

基于桑白皮中雌激素样成分的应用，包括：

使用桑白皮中雌激素样成分氧化白藜芦醇用于增强人宫颈癌细胞的ERα和/或ERβ转录活性；或

使用桑白皮中雌激素样成分氧化白藜芦醇用于增强乳腺癌细胞的ERα和/或ERβ转录活性；或

使用桑白皮中雌激素样成分氧化白藜芦醇用于促进乳腺癌细胞的ER诱导基因CTSD、PGR、pS2mRNA的表达；或

使用桑白皮中雌激素样成分氧化白藜芦醇用于增强乳腺癌细胞的ERα和/或ERβ蛋白表达。

本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：通过本发明提供的筛选方法，能够筛选出雌激素中雌激素样作用活性较强的单体成分氧化白藜芦醇，并且通过雌激素样作用实验从蛋白水平，更为全面的多角度去阐述桑白皮中具有雌激素样作用的活性单体成分的雌激素作用，并且通过桑白皮中具有雌激素样成分的应用提供了桑白皮作为植物雌激素用于雌激素的替代治疗的选择可能性。

附图说明

图1为本发明所述的氧化白藜芦醇对Hela细胞ERα转录活性的影响。(与空白对照组相比**P﹤0.01；与E₂组相比^##P﹤0.01)

图2为本发明所述的氧化白藜芦醇对Hela细胞ERβ转录活性的影响。(与空白对照组相比**P﹤0.01；与E₂组相比^##P﹤0.01)

图3为本发明所述的GFP-ERα、GFP-ERβ质粒大量提取后电泳图。(M：1kb Plus DNA Ladder；1：ESR1；2：ESR2)

图4为本发明所述的氧化白藜芦醇对MCF-7细胞GFP-ERα、GFP-ERβ转录活性的影响。

图5为本发明所述的氧化白藜芦醇对MCF-7细胞CTSD mRNA表达的影响。(与空白对照组相比**P﹤0.01；与E₂组相比^##P﹤0.01)

图6为本发明所述的氧化白藜芦醇对MCF-7细胞PGR mRNA表达的影响。(与空白对照组相比**P﹤0.01；与E₂组相比^##P﹤0.01)

图7为本发明所述的氧化白藜芦醇对MCF-7细胞pS2mRNA表达的影响。(与空白对照组相比*P﹤0.05，**P﹤0.01；与E₂组相比^##P﹤0.01)

图8a、8b为本发明所述的氧化白藜芦醇对MCF-7细胞ERα蛋白表达的影响。(与空白对照组相比**P﹤0.01；与E₂组相比^##P﹤0.01)

图9a、9b为本发明所述的氧化白藜芦醇对MCF-7细胞ERβ蛋白表达的影响。(与空白对照组相比**P﹤0.01；与E₂组相比^##P﹤0.01)

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供了一种基于桑白皮中雌激素样成分的筛选方法，包括：

选取桑白皮中多种待测试化合物，在选取后的待测试化合物中通过雌激素活性筛选实验筛选出显著促进乳腺癌细胞增殖的化合物以及通过分子对接实验筛选出对乳腺癌细胞具有较强亲和力的化合物，在筛选后的化合物中确定最终具有雌激素样的化合物；

其中，选取的待测试化合物结构式如下所示：

化合物1为化合物2为

化合物3为化合物4为

化合物5为化合物6为

化合物7为化合物8为

化合物9为化合物10为

在另一种实施例中，最终具有雌激素样的化合物为化合物4，即为氧化白藜芦醇(Oxyr)。

在另一种实施例中，雌激素活性筛选实验包括如下步骤：

使用10％胎牛血清的DMEM含酚红的培养基对乳腺癌细胞进行常规培养，待细胞铺满瓶壁80％以上时，对细胞进行消化后，取1/3接种于新的培养瓶内，置于培养箱内培养，在增殖实验前一代将培养基换为10％经活性炭处理的胎牛血清无酚红的DMEM培养基，置于培养箱内培养至对数生长期时，调整细胞浓度，用2.5％经活性炭处理的胎牛血清无酚红的DMEM培养基进行接种后在培养箱内培养24小时，后加入含有不同浓度化合物的2.5％经活性炭处理的胎牛血清无酚红的DMEM培养基继续培养72小时，加入MTT，4小时后吸弃培养板内液体，加入DMSO 100μL/孔，对所述细胞进行光密度值检测。

在另一种实施例中，雌激素活性筛选实验以及分子对接实验中使用所述待测试化合物浓度为0.1μM～10μM。

在另一种实施例中，在分子对接实验中，对待测试化合物进行去盐、加氢以及离子化处理，对乳腺癌细胞中的结合受体去除蛋白周围的水分子和共晶的小分子配体，并对蛋白结构加氢进行能量最小化处理。

在另一种实施例中，在分子对接实验中，筛选出待测试化合物中与雌激素受体ERα和/或ERβ的具有较强亲和力的化合物。

本发明提供了一种通过细胞转染实验对桑白皮中雌激素样成分的雌激素作用验证方法，包括：所述细胞转染实验包括人宫颈癌细胞和/或乳腺癌细胞的细胞转染实验；

其中，人宫颈癌细胞转染实验包括如下步骤：准备待转染细胞，采用脂质体法转染质粒后加入含有浓度为0.1μM～10μM的氧化白藜芦醇，在孵箱中培养，采用双荧光素酶报告检测系统测定其发光值，与空白组对照组进行比较，氧化白藜芦醇增强人宫颈癌细胞ER转录活性；

乳腺癌细胞转染实验包括如下步骤：准备待转染细胞，加入携带有GFP表达基因的质粒和转染试剂的混合液后，培养6小时，加入含有浓度为0.1μM～10μM的氧化白藜芦醇，培养24小时后观察荧光结果，与空白对照组进行比较，氧化白藜芦醇增强乳腺癌细胞ER转录活性。

本发明提供了一种通过乳腺癌细胞ER基因表达实验对桑白皮中雌激素样成分的雌激素作用验证方法，包括如下步骤：向待实验细胞内加入浓度为0.1μM～10μM的氧化白藜芦醇培养24小时后，对细胞进行总RNA提取及浓度测定，通过RNA进行逆转录合成cDNA，通过cDNA合成RT-PCR，测定每个实验中的反应体系内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，与拷贝量呈负对数关系，与空白对照组进行比较，氧化白藜芦醇促进乳腺癌细胞的ER诱导基因表达。

本发明提供了一种通过乳腺癌细胞蛋白表达实验对桑白皮中雌激素样成分的雌激素作用验证方法，包括如下步骤：向待实验细胞内加入含有浓度为0.1μM～10μM的氧化白藜芦醇进行培养，然后对细胞进行蛋白提取，对ERα、ERβ蛋白进行含量检测，与空白对照组进行比较，氧化白藜芦醇增强ERα、ERβ蛋白表达。

本发明提供了一种基于桑白皮中雌激素样成分的应用，包括：使用桑白皮中雌激素样成分氧化白藜芦醇用于增强人宫颈癌细胞的ERα和/或ERβ转录活性；或

使用桑白皮中雌激素样成分氧化白藜芦醇用于增强乳腺癌细胞的ERα和/或ERβ转录活性；或

使用桑白皮中雌激素样成分氧化白藜芦醇用于促进乳腺癌细胞的ER诱导基因CTSD、PGR、pS2mRNA的表达；或

使用桑白皮中雌激素样成分氧化白藜芦醇用于增强乳腺癌细胞的ERα和/或ERβ蛋白表达。

下面结合具体的实施例和实验例对本发明做出进一步的阐述。

实验材料

E₂为ERs的激动剂；在本实施例中，E₂为雌二醇；

ICI 182,780为ERs完全拮抗剂；

Hela人宫颈癌细胞购自上海细胞生物研究所；

MCF-7(ERα+,ERβ+)人乳腺癌细胞株购自上海细胞生物研究所；

FBS为胎牛血清；

CS-FBS为经活性炭处理过的胎牛血清；

MTT为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐。

实施例1桑白皮雌激素样活性物质筛选实验

1、雌激素活性筛选实验(E-screen实验)

细胞从液氮中取出后，直接于37℃～40℃温水中，迅速摇动并不断观察融化情况，避免温度过高使细胞损伤。然后在无菌条件下，吸出细胞冻存液，移至离心管并加入DMEM培养基。800rpm离心3min，去除上清液，再重复用培养基洗涤一次。加入足量培养液轻轻吹打成为细胞悬液，移入培养瓶(接种密度为5×10⁵个/ml)，置于5％CO₂、37℃饱和湿度的培养箱内培养，24h后更换培养基继续培养。

根据已有的细胞倍增时间进行细胞消化和传代，待细胞处于对数生长期或铺满培养瓶底后，吸弃瓶内培养基，PBS洗去残留的培养液，加入1ml 0.25％的胰酶，晃动培养瓶保证胰酶与细胞充分接触，置于37℃培养箱，1min后于显微镜下进行观察细胞形态，若胞质出现回缩，成球形，立即吸弃消化液，加入全培养基终止消化，反复吹打贴壁的细胞形成单细胞悬液。细胞计数后，取1/3的混悬液接种于新的培养瓶内，置于5％CO₂、37℃饱和湿度的培养箱内继续培养。

细胞冻存前24h更换培养基，待细胞铺满瓶壁80％以上时，消化、离心收集细胞，以含10％DMSO、20％FBS的DMEM培养基调整细胞浓度至108个/ml，分装于冻存管中，1.5ml/管，放入冻存盒中于-80℃冰箱中24h后存放于液态氮中保存。

MCF-7细胞以含10％FBS的DMEM含酚红的培养基常规培养，增殖实验前一代换为10％CS-FBS无酚红的DMEM培养，以消耗细胞内激素类物质。至80％融合时取状态良好的细胞胰酶消化，用2.5％CS-FBS无酚红的DMEM以5000个细胞每孔接种于96孔板。37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，细胞贴壁良好，铺展生长。此时吸去培养液，用D-Hank’s液200μl每孔洗涤1次，加入含有不同浓度药物的2.5％CS-FBS无酚红的DMEM继续培养72h。设溶剂对照组(0.1％DMSO)、E₂组(0.01μM)、E₂(0.01μM)+ICI(0.1μM)组、药物各浓度组、以及药物+ICI(0.1μM)组。

待加药处理72h后，取出培养板，小心吸弃培养液，加入MTT试剂，使其终浓度为5mg/ml。用锡箔纸包裹培养板，37℃孵育4h。吸弃MTT试剂，加入DMSO，100μl/孔。振荡器上振荡15min，490nm处检测光密度值(OD值)。

2、分子对接实验

使用高通量虚拟筛选体系：(1)各小分子的数据库是由软件中的LigPrep模块进行准备的，用作对接实验的配体库；(2)使用软件中的Protein preparation wizard模块准备ERα、ERβ的蛋白，通过GLIDE模块生成grid文件，即对接试验的受体文件；(3)将上述2个文件经任务管理程序投送至分布式计算集群中，由软件中的GLIDE模块进行对接试验；(4)通过Pipeline Pilot对上一步骤结果进行排序分析，输出化合物打分列表，保留前几位分子进行下一步筛选；(5)通过对分子目视筛选，选出结合方式合理，模拟结合力较强的分子作为候选化合物，进入后续生物活性测定步骤。

应用software suite 2015中的GLIDE模块进行了分子对接研究，用来确定化合物Oxyr与雌激素受体ERα、ERβ的结合模式。首先通过software suite中的LigPrep模块进行小分子准备，分子去盐，加氢，离子化状态参数设置，pH为7.0±2.0，多样化对接模式，空间异构体，环式结构生成的多种构象可产生多种可能的结构。最小化的能量以产生最稳定或最佳结合模式，立场参数设定为OPLS_2005(Optimized Potentials for Liquid Simulations)，并且对全部分子产生互变异构体。

雌激素受体ERα、ERβ的晶体结构(PDB:1GWR、3OLL)于Protein Data Bank数据库下载，该共晶结构原子的坐标数据采用X射线衍射法收集得到，分辨率分别为二者均为共晶分子，配体分子结合于活性口袋空间体积较大的中心位置。用software suite中的Protein preparation wizard功能分别进行ERα、ERβ蛋白的准备，在该过程中将去除蛋白周围的水分子和共晶的小分子配体，并对蛋白结构加氢最终进行能量最小化。参照共晶结构中的配体位置坐标对接Grid的生成，通过中的GLIDE模块自动生成。对接结果中应用glide_gscore作为打分函数，用以评价对接构象的结合模式；在本实施例中，实验数据用SPSS17.0软件包进行统计学处理。实验结果以均值±标准差进行表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义，进行三次独立实验，其中(n＝6)。

作为一种优选，在本实施例中采用的软件为software suite2010(64位)、Discovery Studio 3.5、Pipeline Pilot 8.5以及Pymol 1.4，配备的硬件设备为Dell Optiplex 380台式计算机以及HP ProLiant DL388G7塔式服务器用于中小型运算量的计算任务。

3、实验结果

3.1、桑白皮雌激素活性成分对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

MTT法进行MCF-7细胞增殖实验及ICI182,780干预的细胞增殖抑制实验，结果显示，E₂组处理72h可显著促进MCF-7细胞增殖，ICI>2的促增殖作用；受试单体中的二苯乙烯类化合物1的促增殖作用不明显，化合物2、3、4可显著促进MCF-7细胞增殖，其效价约为E₂的(1/100-1/1000)，该作用可被ICI>

表1桑白皮提取的10种单体成分对MCF-7细胞增殖的影响(n＝6)

(注：与空白对照组相比*P﹤0.05，**P﹤0.01；与E₂组相比^##P﹤0.01)

3.2分子对接结果

10个化合物经过分子对接筛选，依据docking score打分排序，选出结合作用较强的分子，如表2和3所示，Oxyr与蛋白的结合方式比较合理，进行后续研究

表2氧化白藜芦醇与ERα分子对接Score

表3氧化白藜芦醇与ERβ分子对接Score

Glide对接结果显示，化合物4，即氧化白藜芦醇(Oxyr)和阳性对照分子E₂均成功对接到雌激素受体ERα、ERβ的活性口袋中。ER的活性口袋包含于分子内部，为略呈狭长的囊状结构，雌激素结合区多为疏水氨基酸残基分布排列，两端有少数亲水性残基与配体形成氢键。与E₂相比，Oxyr获得了更多的结合位点但结合分数略低于E₂。化合物Oxyr与雌激素受体ERα的Leu346、Glu353、Arg394、Met421、Gly521等氨基酸残基形成了5个氢键，使分子定位于活性口袋之内，Leu384、Phe404等氨基酸形成空间位阻作用，进一步稳定了Oxyr在活性口袋内的结合。雌激素受体ER-β中，Oxyr与Leu298、Glu305、Arg346、His475形成了4个氢键，Phe356、Ile373等残基形成的空间位阻稳定了Oxyr与ERβ的结合。

实施例2桑白皮活性单体成分氧化白藜芦醇雌激素样作用实验

1、Hela细胞转染实验

为了消除干扰，至少提前一代使用1％CS-FBS-DMEM培养细胞。于转染前一天，取生长状态良好的细胞，用0.25％胰酶消化离心后，调整细胞浓度，用适量的1％CS-FBS-DMEM培养液重悬，种于96孔板中，100μl/孔，10⁴个/孔。使得37℃，5％CO₂条件下培养8-10h后细胞汇合率达70％-90％。

转染：吸弃孔内培养液，加入90μl 1％CS-FBS-DMEM。采用脂质体法共转染质粒。A液：pTk-ERE-luc：ERα：pTk-Renila＝2：1：1。每孔质粒DNA总量为0.1μg，5μl基础培养液轻轻混匀；B液：0.3μl lipofectamine 2000用5μl基础培养液混匀。室温孵育5min，混合A、B两液，室温孵育20min。10μl/孔加入96孔板中。

加药：孵箱中培养，8-18h内吸弃孔内培养液，PBS洗涤细胞。分别加入培基，E₂，不同浓度的受试药物(DMSO溶解配制为10^-2M的母液，4℃保存，每次实验均用母液等级稀释，使细胞培养液中DMSO的终浓度﹤1‰)，孵箱中培养24h。

检测：采用双荧光素酶报告检测系统试剂盒进行检测，检测试剂盒内容物如下：

1)5×PLB；

2)Luciferase Assay Reagent II substrate，Luciferase Assay Reagent II buffer；LAR II substrate与buffer混合后，分装保存于-80℃冰箱。实验时将混合物超纯水稀释5倍使用。

3)Stop&GloTM substrate，Stop&GloTM buffer(现用现配substrate:buffer＝1：49)实验中超纯水稀释5倍后使用。

取给药后24h的细胞，PBS洗涤细胞，1×PLB(Passive Lysis Buffer)20μl/孔裂解细胞5min，封口膜将96孔板封口置于-40℃冰箱冻存4h后取出融化，将细胞内容物移入白板中。避光加入超纯水稀释5倍的Luciferase Assay Reagent II(LAR II，分装保存于-80℃冰箱)，100μl/孔，立即放入酶标仪中，使用1-2秒延迟，测定其5-10s的发光值。随即迅速加入的超纯水稀释5倍的Stop&GloTM(现用现配substrate:buffer＝1：49)100μl/孔，立即放入酶标仪中，使用1-2s延迟，测定其5-10s的发光值。以Firefly Luciferase/Renila Luciferase值作为结果，分别对每孔结果进行统计，每组三孔取均值，比较统计各组比值差异。

2、MCF-7细胞转染实验

E.coli DH5α购于北京索莱宝生物技术有限责任公司。

按照如下步骤在12孔板中转染MCF-7细胞(步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积)。

1)在100μl无血清Opti-MEM培养基中稀释替换成携带有GFP表达基因的ERα、ERβ质粒，并轻轻混匀；

2)使用前轻轻混匀LipofectamineTM 2000转染试剂，取4μl在96μl Opti-MEM培养基中稀释。室温下静置5分钟；

3)室温下静置5min后，混合LipofectamineTM 2000和DNA的稀释液(总体积为200μl)。轻轻混匀并在室温下静置30分钟；

4)将12孔板中的旧培养液弃掉，使用无血清Opti-MEM培养基将细胞洗涤一次，然后每孔加入800μl预热的无血清Opti-MEM培养基，最后在12孔板中的每个孔中加混合液200μl，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀；

5)将孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养6h后，更换为含有不同浓度药物的培养基培养，分组如下：

空白组：含有0.1％DMSO的2.5％CS-FBS无酚红的DMEM处理；

给药组：含有不同药物的2.5％CS-FBS无酚红的DMEM处理，分组为：E₂组(0.01μM)、E₂(0.01μM)+ICI组(0.1μM)、氧化白藜芦醇组(10μM)、以及氧化白藜芦醇(10μM)+ICI(0.1μM)组；

6)24h后在倒置荧光显微镜下观察结果。

3、桑白皮雌激素活性成分对MCF-7细胞ER诱导基因表达的影响

为了消除干扰，至少提前一代使用10％CS-FBS-DMEM培养细胞。于实验前一天，取对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化离心后，按面积调整细胞浓度，用适量的10％CS-FBS-DMEM培养液重悬，种于6孔板中。使得37℃，5％CO₂条件下培养24h后细胞汇合率达90％。吸弃培养基加入含药培养基培养24h。分组如下：

空白组：含有0.1％DMSO的2.5％CS-FBS无酚红的DMEM处理；

给药组：含有不同药物的2.5％CS-FBS无酚红的DMEM处理，分组为：E₂组(0.01μM)、E₂(0.01μM)+ICI组(0.1μM)、药物各浓度组、以及药物+ICI(0.1μM)组。

给药处理24h后提取RNA。

3.1细胞总RNA提取

弃去培养液，预冷的PBS洗涤细胞2次，加入1ml Trizol试剂对细胞进行裂解，反复用枪吹打以裂解细胞；将细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温放置5min；向离心管中加入三氯甲烷200μl，剧烈震荡使其充分乳化，溶液无分相现象后，室温静置5分钟。12000g 4℃离心，15min；此时，离心管中液体分为三层：上清液、中间蛋白层及下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)；向该离心管中加入所取上清液等体积的异丙醇，上下颠倒使离心管中的液体充分混匀，室温静置10min。12000g 4℃离心，10min。管底会出现白色沉淀；弃上清，加入75％的乙醇l ml，温和地上下颠倒，洗涤离心管管壁，12000g 4℃离心，5min。弃去乙醇，尽量除净乙醇；室温放置2-5min，不能过久，否则RNA将会很难溶解，加入适量的RNase-free水(常用体积为30-40ul)溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后备用或放置于-80℃冰箱保存。

3.2总RNA浓度测定

取1μl RNA溶液，加入99μl DEPC水中，以DEPC水作空白对照。在紫外分光光度计上分别读取260nm、280nm波长下的光密度值(OD值)。计算A260/A280的比值；其中，总RNA浓度(μg/μl)＝OD260值×40×稀释倍数/100

3.3逆转录合成cDNA

按照Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书依次在PCR管中加入以下反应物，模板上样量为100ng。

表4逆转录反应体系(20μl体系)

将PCR小管放入C-1000PCR仪进行反转录。反应条件：25℃10min，48℃30min，95℃5min。得到的cDNA产物可于当天检测或放置于-80℃冰箱保存。

3.4RT-PCR

按照SYBR GREEN PCR Master Mix试剂盒说明书，在PCR管中依次加入以下反应物。

表5PCR反应体系(25μl体系)

反应参数如下：95℃：20sec；95℃：3sec；60℃：30sec；循环数：40

溶解曲线步骤：每个循环在72℃时采集荧光，40个循环之后测定溶解曲线。

溶解参数如下：95℃：20sec；95℃：3sec；60℃：30sec；

表6RT-PCR所用引物序列

注：以上引物均由上海生物工程公司合成。

Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，与拷贝量呈负对数关系。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。ΔCt＝待测基因Ct值-内参照基因Ct值。应用Bio-Rad实时定量PCR仪分析软件调整阈值后，查看并分析数据，得到每个样品反应的Ct值，计算得到ΔCt，并与对照组比较，取2^-ΔΔCt值进行数据统计。

4、MCF-7细胞蛋白提取、Western-Blot实验

4.1细胞蛋白提取与定量

4.1.1细胞样品的制备

为了消除干扰，至少提前一代使用10％CS-FBS-DMEM培养细胞。于实验前一天，取对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化离心后，按面积调整细胞浓度，用适量的10％CS-FBS-DMEM培养液重悬，种于6孔板中。使得37℃，5％CO₂条件下培养24h后细胞汇合率达90％。吸弃培养基加入含药培养基培养24h。分组如下：

空白组：含有0.1％DMSO的2.5％CS-FBS无酚红的DMEM处理；

模型组：含有LPS(1μg/ml)的2.5％CS-FBS无酚红的DMEM处理；

给药组：含有不同药物的2.5％CS-FBS无酚红的DMEM处理，分组为：E₂组(0.01μM)、E₂(0.01μM)+ICI组(0.1μM)、药物各浓度组、以及药物+ICI(0.1μM)组。

4.1.2蛋白提取

用冷的PBS洗涤细胞2次，吸弃洗涤液；每孔加入500μl PBS，用细胞刮将细胞板内的细胞收集于底角，并收集于1.5ml的EP管中，再用500μl PBS将细胞刮冲洗干净，将冲洗液收集于EP管中；于3000rpm，4℃，5min的条件下离心得到细胞；尽可能吸弃上清，加入蛋白裂解液(RIPA：PMSF＝100：1现用现配)，吹吸混合液，至蛋白充分裂解，冰上放置30min，期间可上下颠倒离心管使蛋白充分裂解；将蛋白裂解物10000g，4℃，离心5min，将上清收集于新的EP管中。

4.1.3蛋白浓度检测及定量

配制BCA工作液：将BCA试剂盒中的试剂A和试剂B按A：B＝50：1的比例混合备用，现用现配；配制蛋白标准品梯度浓度。

4.2操作步骤

4.2.1聚丙烯酰胺凝胶的配制

配制8％分离胶混合液，小心地将混合液在50ml离心管中混匀，然后立刻轻轻地将胶倒入配胶槽内，胶的表面距上端2cm左右，注意不要产生气泡。在分离胶的表面加上一层纯水，使胶的表面平整。经过大约30min分离胶凝固。胶凝固后，倒掉上面的纯水，然后用滤纸吸干胶表面的水分。

配制5％浓缩胶混合液，小心地将胶液混合，加到分离胶上面，并插入相应厚度的梳子。浓缩胶凝固后，室温放置。

一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶和浓缩胶注配胶板中，防止其在离心管内凝固。

4.2.2准备及上样

待到浓缩胶凝固后，用记号笔画出齿槽所在位置以方便后面上样，然后两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。取下配好的胶将其放入电泳槽中。(玻璃板向外，白板面向内，用红色夹子固定好。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块玻璃板且同样用红色夹子固定好)。加入之前配好的足量的1×电泳缓冲液；

上样：试先取出之前变性好的蛋白，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。按照计算好的上样量，用微量移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器枪头插至加样孔中缓慢加入样品，不要有气泡。逐孔加完，最后加入蛋白Marker。按照红色对红色，黑色对黑色盖上电泳槽的盖，时间一般3-4h，电压开始在浓缩胶里可以为80V，待蛋白在浓缩胶内浓缩成较粗一条时，把电压调成100V。电泳至SDS刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

4.2.3电泳

将电泳装置与电源连接。设置电压和时间，在稳压下浓缩胶用80V，直到溴酚兰示踪染料进入分离胶，将电压调成120V；直至溴酚兰到达分离胶的底部，关闭电源；拆除电泳装置：用薄板撬开玻璃平板，暴露凝胶，用边缘整齐平整的薄板截取目的蛋白所在处的凝胶，以备后用。

4.2.4转膜

据蛋白所占据的大小和位置裁剪大小合适的PVDF膜，并在边缘处做好标记，操作过程中需带手套，以免污染膜，用镊子夹住切好的PVDF膜一侧，置于有甲醇的容器中浸5min才可使用；将转膜缓冲液倒入搪瓷盘中，放入夹子，并把滤纸润湿，夹子黑色的一面在下边，铺好夹子和厚滤纸；取电泳后取材好的凝胶，铺于滤纸上，凝胶与滤纸之间不要有气泡，将泡好的PVDF膜铺于凝胶上，使二者间没有气泡，在该膜上覆盖另一层厚的滤纸，加好夹子，将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。将转移槽放入有冰的泡沫盒内，盖上盖子。一般用250mA或者300mA转移适当的时间即可。(转膜时间根据蛋白大小而定，蛋白多大kD即转膜多少分钟)

4.2.5免疫反应

封闭：将转膜完成的PVDF膜放入试先配制好的5％脱脂奶粉封闭液中，置于脱色摇床上摇动封闭1.5h-2h；

孵育一抗：封闭快完成的时候，用试先自制的塑料袋用TBST液配制所需浓度的一抗稀释液，待转膜后，将膜在TBST下洗去封闭液，然后放入装有一抗溶液的塑料袋内，4℃下封闭过夜。次日用TBST在室温下脱色摇床上洗5次，每次5min；

孵育二抗：同法配制二抗稀释液并放入洗好的膜，室温下脱色摇床上孵育2h。同样用TBST在室温下脱色摇床上洗5次，每次5min，进行化学发光；

4.2.6化学发光、显影与定影

将A和B两种试剂在平皿里等体积混匀，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触1min。在X-光片夹中铺上一层保鲜膜，然后将膜移至保鲜膜上，再轻轻的盖上一层保鲜膜，用手轻轻的赶走两层保鲜膜之间的气泡，盖上X-光片夹；

在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中，在红灯下取出X-光片，用剪刀裁成适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)，根据荧光信号的强弱适当调整曝光时间；曝光完成后，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1-2min(20-25℃)，显影结束后，把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5-10min，以胶片透明为止；用水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

4.2.7凝胶成像分析

将胶片进行扫描或拍照，用多功能成像分析系统MP5000及自带软件扫描计算目标带的灰度值。

在本实施例中，实验数据用SPSS17.0软件包进行统计学处理。实验结果以均值±标准差进行表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。进行三次独立实验，其中(n＝3)。

5、实验结果

5.1桑白皮中雌激素活性成分Oxyr对Hela细胞ER转录活性的影响

10nmol/L的E₂可显著促进Hela细胞的ERα转录活性，荧光素酶活性为空白对照组的2倍，E₂和ICI(182,780)共同处理后，E₂的促ER转录活性被抑制；0.1μmol/L、1μmol/L的Oxyr对ERα、ERβ转录活性均无影响，而10μmol/L的Oxyr可显著增强对ERα、ERβ转录活性，且荧光素酶活性约为空白对照组的1.5倍，该作用也可被ICI(182,780)阻断，结果如图1和2所示。

5.2MCF-7转染实验结果

携带有GFP表达基因的ERα、ERβ质粒(即：ESR1和ESR2质粒)经转化得到培养皿中的菌落，在抗性筛选平板上随机挑取单菌落接种至LB液体培养基中振荡培养。质粒大量提取后进行凝胶电泳实验，结果如图3所示。验证重组质粒的品质，其碱基对为6600bp，结果显示，ESR1和ESR2重组质粒质量完好。将上述两种质粒分别转染到MCF-7细胞，6h后给予不同药物处理，24h后在倒置荧光显微镜观察结果，如图4所示，当携带GFP的ERα、ERβ转录表达时，在蓝色激发光照射下可观察到绿色荧光。给予10nmol/L的E₂处理后，视野下的绿色荧光多且强，提示E₂可显著促进MCF-7细胞的ER转录活性，ICI(182,780)可减弱该上调作用，给予10μmol/L的Oxyr后视野中绿色荧光蛋白表达上调，提示Oxyr可显著增强对ERα、ERβ转录活性，ICI(182,780)可减弱该上调作用。

5.3Oxyr对ER诱导基因表达的影响

与空白对照组相比，E₂组可显著促进MCF-7细胞的ER诱导基因CTSD、PGR、pS2mRNA的表达，E₂和ICI(182,780)共同处理后，E₂的上调作用被抑制。结果如图5、图6所示，10μmol/L>

5.4Oxyr对MCF-7细胞ER蛋白表达的影响

ERα、ERβ是MCF-7细胞中的标志性蛋白，当给及激素样活性物质处理时，两者的表达上调，如图8、图9所示，与空白对照组相比，10nmol/L的E₂可促进MCF-7细胞的ER诱导基因ERα、ERβ蛋白的表达，E₂和ICI(182,780)共同处理后，E₂的上调作用被抑制，与E₂相似，1μmol/L、10μmol/L的Oxyr可显著增强ERα、ERβ蛋白的表达。当Oxyr和ICI(182,780)共同处理后，该上调作用被阻断。

综上所述，十种受试桑白皮单体成分中，苯并呋喃类化合物、萘类化合物和部分黄酮类化合物呈现抑制MCF-7细胞增殖的作用。二苯乙烯类的化合物可显示出促进MCF-7细胞的增殖，且该作用可被ICI182,780所阻断，提示其发挥促MCF-7细胞增殖的作用可能是ER介导的。其中活性最强的Oxyr也可通过诱导契合作用使蛋白发生一定的形态变化可与ERα、ERβ的活性口袋匹配结合，显示出较强的雌激素活性，桑白皮单体成分Oxyr可激活ERs，表现出一定的雌激素活性，桑白皮中单体成分Oxyr对ERβ的激活作用强于对ERα的激活作用。此外，Oxyr通过与ER结合，作用于激活下游雌激素信号通路，作用于靶基因DNA结合位点，上调雌激素诱导基因和ERα、ERβ蛋白表达。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。