用于量化分析物的方法以及配置成实施该方法的自动分析装置

技术领域

本发明涉及一种用于确定样品中的分析物的量的新颖方法，更具体地涉及一种利用免疫测定的方法和配置成实施该方法的自动分析装置。

背景技术

本发明涉及一种用于量化样品中存在的分析物的量的方法，特别是使得能够量化分析物而无需预先进行复杂费力的样品纯化分析前阶段的方法。

本发明还涉及确定用于诊断疾病的分析物的量的方法。

简化提取和分离方法是改进方法的关键特征。要求单独进行纯化步骤会显著延长该方法的时间，且由于存在至少一个手动操作样品的步骤，因此不仅可能在确定浓度时引入潜在误差，而且可能使样品的可跟踪性产生潜在误差。

从样品中除去化合物(例如，脂类)常常需要沉淀步骤，沉淀步骤需要许多手动操作和离心分离。量化之前进行的分析物纯化步骤中的一个步骤可能需要使用有机溶剂，有机溶剂可有毒且可能需要蒸发设备，蒸发设备在临床生化实验室中使用起来很不方便。

发明内容

本发明旨在克服与现有方法关联的问题。

因此，本发明满足对用于量化样品中的分析物的一种简单有效的方法的需求。其基于消除了脱脂-提取-纯化的复杂手动操纵。本发明已实现了使得能够大大降低完成时间的方法，该方法比之前的方法更有效，因此更具成本效益，且允许完全追踪所有操作，因此更适于临床实验室的常规使用。

本发明基于以下发现，即一步式纯化(其中，在同一容器内混合样品、脱脂剂和分析物结合配偶体)有效地工作。

如此，在第一方面，本发明涉及一种用于量化样品中的分析物的方法，包括：

-初始纯化步骤，在第一容器内发生，包括以下步骤：

a)在第一容器内混合样品、脱脂剂和涂覆有第一分析物结合配偶体的第一磁性颗粒，

b)温育容纳第一容器内的混合物，以沉淀样品中所包含的脂类并使样品中包含的分析物结合至第一分析物结合配偶体，

c)将第一容器置于磁场中，以通过磁力将第一磁性颗粒吸引至第一容器的内壁部分，

d)从第一容器中容纳的混合物中除去未结合的试剂，

e)在洗脱溶液中洗脱结合的分析物以将分析物与第一分析物结合配偶体分离，

-转移步骤，包括以下步骤：

f)将第一容器置于磁场中，以通过磁力将第一磁性颗粒吸引至第一容器的内壁部分，

g)将一定体积的包括分析物的洗脱溶液从第一容器转移至第二容器，以及

-量化步骤，该步骤在第二容器内发生，由量化所述洗脱溶液中的分析物的步骤组成。

本发明可用于任何人类含水生物介质，例如血液、血清或血浆。

根据本发明的方面，第一容器和第二容器中的至少之一为透明小容器(cuvette，小玻璃管)、试管或类似的器皿。第一容器和第二容器中的每一个都可以是透明小容器、试管或类似的器皿。

根据本发明的方面，第一容器和第二容器中的至少一个由玻璃或塑料制成。第一容器和第二容器中的每一个均可由玻璃或塑料制成。

所述转移步骤可使用诸如采样和移液装置(pipetting device，吸液装置)的工具进行。

根据本发明的一个方面，温育步骤包括样品脱脂步骤。

应注意，有利的是，脱脂剂有利地配置成有利于样品中所包含的脂类沉淀。

脱脂剂可以是聚阴离子分析物，例如硫酸葡聚糖、磷钨酸，或肝素(在存在II族阳离子的情况下，例如镁、锰或钙)。

这种与脱脂剂的温育允许脂类沉淀(由于脱脂剂)，并允许分析物与磁性颗粒上涂覆的第一分析物结合配偶体结合。

根据本发明的方面，除去步骤包括洗涤步骤，洗涤步骤包括利用洗涤溶液洗涤第一磁性颗粒。

在本发明的特定方面，由将碱性溶液(basic solution)(例如NaOH，例如0.3N至0.6N NaOH)加入包括结合的分析物的第一容器而形成洗脱溶液。然后，将中和溶液(例如，柠檬酸，更具体地说是0.3至0.6M柠檬酸)和方法缓冲液加入第一容器内。

在本发明的更特定的方面，方法缓冲液包括在MOPS缓冲液中的BSA、polypep、甘露醇、蔗糖、氚核-抗氧化剂混合物、抗坏血酸钠、trolox以及碳酸氢钠。

根据本发明的方面，可使用移液工具向第一容器和第二容器内加入以及从第一容器和第二容器除去任何液体(溶液、缓冲液、洗涤溶液等中的试剂)。

根据本发明的一个方面，分析物可以是任何维生素D代谢物，更优选是1,25-二羟基维生素D(1,25D)，或类固醇(例如醛固酮、雄激素、雌激素、孕激素或胆固醇)。维生素D代谢物也可以是25-羟基维生素D，例如25-羟基维生素D₂或25-羟基维生素D₃。

根据本发明的优选方面，分析物为1,25-二羟基维生素D(1,25D)。该分析物在血液中的浓度非常低，且由于其标准浓度是10至100微微克/毫升(picogrammes/ml(皮克/毫升))，因此其测定很具挑战性。

人类血液中的1,25D的浓度可非常好地指示人体维生素D新陈代谢的有效性，并且可很好地指示慢性肾病。

已经很难开发用于确定1,25D水平的方法，这主要是因为血液中的1,25D的浓度非常低。

众所周知，在自动化系统上或利用手动方法进行分析之前，需要费力进行多次提取步骤来测量1,25D。如今市场上可用的现有提取方法需要大量设备，包括纯化柱、旋转器、离心分离机和氮蒸发器。常常需要溶剂。样品的阳性鉴定会受损。

分析物的量化可通过本领域的技术人员所熟知的任何技术进行。本发明总体上涉及以下用于量化分析物的技术：

-临床化学或生物化学测试，该测试使用血清或其它含水生物介质进行，且其中利用的测量原理基本上是分光光度法；

-免疫测定，根据不同的技术方法(例如，ELISA、EIA)进行，测量通过分光光度法、荧光或CLIA(通过发光)进行。

在本发明的特定方面，通过免疫测定来量化分析物，利用第二分析物结合配偶体来进行所述免疫测定。

在本发明的特定方面，第一分析物结合配偶体和第二分析物结合配偶体中的至少一种(以及例如第一分析物结合配偶体和第二分析物结合配偶体中的每一个)可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、工程化或人源化抗体、scFV或Fab片段。

在本发明的特定方面，第一分析物结合配偶体和第二分析物结合配偶体是相同的或不同的。

用于量化低浓度样品中存在的分析物的优选方法之一是通过竞争结合方法。当分析物为小分子且不会有多种结合的可能性时，需要该竞争结合方法。合适的竞争结合方法采用多种形式，且为本领域中的技术人员所熟知。典型的竞争结合方法将包括使分析物结合配偶体与分析物的标记形式和怀疑包含相同分析物的未标记形式的样品接触。

被发现的与分析物结合配偶体结合的标记分析物的量指示样品中的未标记分析物的比例。替代地，竞争结合方法可包括提供与分析物的标记形式结合的分析物结合配偶体，将怀疑包含未标记形式的分析物的样品添加至分析物结合配偶体，并测量指示存在的未标记分析物的量的被取代标记分析物的量。

在更具体和优选的方面，本发明的方法能够以完全自动化的方式进行。根据本发明的更优选的方面，方法通过自动分析装置进行，例如自动免疫测定分析仪。

该方法固有的创新在于分析前阶段在相同仪器上完全自动化，而非手动进行或在分离的设备上进行。

在本发明的一个方面，提供、移液、温育和混合步骤均由自动分析装置管控。

本发明进一步涉及一种配置成实施根据本发明的方法的自动分析装置，更具体地涉及一种自动分析装置，其包括：

-多个容器，

-转子，具有基本竖直的旋转轴线并绕其旋转轴线可旋转地受驱动，该转子界定了径向向外开口的腔，

-装载装置，其适于将容器装载在转子的腔内，

-至少一个采样和移液装置，适于向容置在转子的腔内的容器提供试剂和样品，

-磁性沉降和洗涤模块，适于容置从转子内取出的容器并生成磁场，磁性沉降和洗涤模块包括适于从容置在磁性沉降和洗涤模块内的容器吸取流体的移液器具，

-磁性吸引模块，也称为磁性分离模块，包括适于容置从转子内取出的容器的向上开口外壳，以及位于向上开口外壳附近的第一磁场发生器，以及

-量化装置，适于容置从转子内取出的容器并对所述取出的容器内容纳的分析物进行量化，

其中，采样和移液装置适于将一定体积的溶液从容置在磁性吸引模块内的容器转移至容置在转子内的其它容器。

因此，一旦已利用洗脱溶液使第一容器内容纳的分析物与磁性颗粒分离，转子便将第一容器移动入磁性吸引模块，磁性吸引模块将第一容器内容纳的磁性颗粒吸引至第一容器的内壁。然后，采样和移液装置从第一容器吸取一定体积的无磁性颗粒的洗脱溶液，并将该体积的洗脱溶液分配入容置在转子内的第二容器。

该第二容器专门用于量化溶液中的分析物。洗脱溶液中的分析物的浓度通过本领域的技术人员所熟知的方法(例如，竞争结合方法)来测量，当分析物的分子很小且无多种结合的可能性时，需要用竞争结合方法。合适的竞争结合方法采用多种形式，且为本领域中的技术人员所熟知。

在本发明的一个方面自动分析装置包括配置成控制自动分析装置的若干装置和模块以实施根据本发明的方法的控制单元。

在本发明的一个方面，第一磁场发生器位于向上开口外壳的旁边。

在本发明的一个方面，第一磁场发生器配置成沿容置在向上开口外壳内的容器的侧壁部分延伸。

在本发明的一个方面，第一磁场发生器配置成将容置在向上开口外壳内的容器所容纳的磁性颗粒吸引至所述容器的内壁部分，且有利地的是吸引至容器的内侧壁部分。

在本发明的一个方面，磁性沉降和洗涤模块包括设置成产生磁场的第二磁场发生器。

在本发明的一个方面，移液器具适于向容置在磁性沉降和洗涤模块内的容器提供洗涤溶液。

在本发明的一个方面，至少一个采样和移液装置适于为容置在转子内的容器提供碱性溶液以及方法缓冲液和中和溶液。

在本发明的一个方面，至少一个采样和移液装置适于从容置在磁性吸引模块内的容器吸取一定体积的包含分析物的洗脱溶液，并将该体积的洗脱溶液分配入容置在转子内的其它容器。

在本发明的一个方面，至少一个采样和移液装置适于从第一存储区域和第二存储区域采样待分析样品和试剂，并将所得采样转移入位于转子的腔内的容器。

在本发明的一个方面，磁性吸引模块位于废物容器上方。

在本发明的一个方面，向上开口外壳向外并向内开口，且尤其是径向向外和向内开口。

在本发明的一个方面，量化装置配置成测量或确定取出的容器内容纳的分析物的量，例如浓度。

在本发明的一个方面，量化装置配置成通过结合测定(例如，免疫测定或竞争结合测定)测量或确定分析物的量，例如浓度。

在本发明的一个方面，量化装置为用于显影并读取发光的发光计。量化装置可包括适于容置从转子中取出的容器的不透光室，和适于量化产生的发光的光电倍增管。

附图说明

现在将参考附图进一步对本发明进行详细说明，在附图中：

图1是根据本发明的自动分析装置的透视图。

图2是图1中的自动分析装置的局部透视图。

图3是图1中的自动分析装置的局部透视图。

图4是示出根据本发明的用于确定样品中的分析物的量的方法的图示。

具体实施方式

图1至3描绘了根据本发明的用于确定样品中的分析物的量的自动分析装置2。

自动分析装置2包括用于存储试剂和待分析样品的第一部分3，和用于进行测量和分析的第二部分4。第一部分3包括第一存储区域3a，其适于容置样品盒5，每一个样品盒均包括样品载体5a和定位在样品载体5a上的样品贮存器5b；和第二存储区域3b，其适于容置试剂盒6，每一个试剂盒均包括试剂载体6a和定位在试剂载体6a上的试剂贮存器6b。样品贮存器内容纳的样品可以是血液样品、血清或血浆。试剂贮存器内容纳的试剂可以是洗脱溶液、中和溶液、缓冲液、脱脂剂，或包含枝接(grafted，接枝)或涂覆有分析物结合配偶体的磁性颗粒的溶液，例如包含用与待量化的分析物对应的抗体官能化的磁性纳米颗粒的溶液。

自动分析装置2进一步包括转子或传送带7，转子或传送带具有基本竖直的旋转轴线且可绕其旋转轴线旋转地受电机(未示出)驱动。转子7界定了径向向外开口的腔8。

自动分析装置2进一步包括装载装置9，装载装置适于存储透明反应小容器11并将所述透明反应小容器11装载在转子7的腔8内。

自动分析装置2还包括采样和移液装置13，采样和移液装置适于从容置在第一存储区域3a内的样品盒5中采样样品，并从容置在第二存储区域3b内的试剂盒6内采样试剂。采样和移液装置13还适于将采样的样品和试剂分配在容置在转子7的腔8内的透明反应小容器11内。

具体地，采样和移液装置13包括具有采样针15的采样头部14。采样和移液装置13进一步包括可相对于自动分析装置2的壳体沿第一水平方向D1移动的第一支撑构件16，以及由第一支撑构件16支撑且可相对于第一支撑构件16沿与第一水平方向D1正交的第二水平方向D2移动的第二支撑构件17。采样头部14由第二支撑构件17支撑，且可相对于第二支撑构件17沿竖直方向D3移动。

采样和移液装置13进一步包括适于使第一支撑构件16沿第一水平方向D1移位的第一移位工具18、适于使第二支撑构件17沿第二水平方向D2移位的第二移位工具19，以及适于使采样头部14沿竖直方向D3移位的第三移位工具21。

有利的是，采样头部14适于使采样针15摆动。这使得当采样针15位于透明反应小容器11内时能够混合透明反应小容器11的内容物。

自动分析装置2进一步包括至少一个或多个相对于转子7径向定向的磁性沉降和洗涤模块23。每一个磁性沉降和洗涤模块23均包括沉降部分24，其具有设置成用于生成磁场的磁场发生器，例如永久磁铁或电磁铁；以及移液器具25，设置为用于从定位在沉降部分24内的透明反应小容器11中移出液体内容物，并将洗涤溶液引入所述透明反应小容器11内。

自动分析装置2还包括第一线性致动器(未示出)，每一个第一线性致动器均与磁性沉降和洗涤模块23关联。每一个第一线性致动器均适于在离心径向运动中从转子7中取出透明反应小容器11，并将取出的透明反应小容器11定位在相应磁性沉降和洗涤模块23的磁场发生器旁边。

因此，当将包含涂覆有分析物结合配偶体的磁性颗粒的透明反应小容器11定位在磁性沉降和洗涤工位23中时，相应的磁场发生器将所述透明反应小容器11内容纳的磁性颗粒吸引至透明反应小容器11的内壁部分，且除了磁性颗粒和与所述磁性颗粒结合的分析物之外，透明反应小容器11的其它内容物可被移液器具25抽吸至所述磁性沉降和洗涤工位23的外部。然后，移液器具将洗涤溶液引入透明反应小容器11内以洗涤磁性颗粒。一预定时间后，所述洗涤溶液被移液器具25抽吸至外部。一旦透明反应小容器11已经过处理，其便通过与所述磁性沉降和洗涤模块关联的第一线性致动器的向心运动被再次引到转子7上。

自动分析装置2进一步包括磁性吸引模块26，也称为磁性分离模块，其相对于转子7径向定向并位于采样和移液装置13附近。磁性吸引模块26包括：壳体，其界定了适于容置从转子7取出的透明反应小容器11的向上开口外壳27；以及磁场发生器28，例如永久磁铁或电磁铁，安装在壳体上并位于向上开口外壳27附近。自动分析装置2包括第二线性致动器(未示出)与磁性吸引模块26关联，并适于在离心径向运动中将透明反应小容器11从转子7中取出并将取出的透明反应小容器11定位在向上开口外壳27内，即磁场发生器28附近。有利的是，向上开口外壳27也是径向向外和向内开口。

应注意，采样和移液装置13适于从容置在磁性吸引模块26的向上开口外壳27内的透明反应小容器11中采样一定体积的内容物，并将所述体积的内容物分配在容置在转子7内的透明反应小容器内。

因此，当将包含洗脱溶液、分析物和磁性颗粒的透明反应小容器11定位在磁性吸引模块26中时，相应的磁场发生器28将所述透明反应小容器11内容纳的磁性颗粒吸引至透明反应小容器11的内壁部分，且除了磁性颗粒之外，透明反应小容器11的其它内容物被采样和移液装置13抽吸并分配至容置在转子7内的其它的透明反应小容器11中。

优选地，磁性吸引模块26位于废物容器上方，并配置成使得当有透明反应小容器11被新引入向上开口外壳27内时，所述新引入的透明反应小容器11将之前引入的透明反应小容器11推至向上开口外壳27外部。然后，所述被推动的透明反应小容器11在重力作用下落入废物容器内。

自动分析装置2进一步包括适于量化透明反应小容器11内容纳的分析物的量化装置29。量化装置29优选为用于显影并读取发光的发光计。值得注意的是，量化装置29可包括适于容置从转子7中取出的透明反应小容器11的不透光室31，以及已知的适于量化产生的发光量的光电倍增管(未示出)。该测量取决于待测量分析物的浓度。一旦完成测量，透明反应小容器11便通过量化装置29所配备的线性致动器的运动从量化装置29中被取出，并被搬移至废物容器内。

自动分析装置2还包括配置成控制自动分析装置2的上述装置和模块的控制单元31。

自动分析装置2进一步包括冲洗和净化系统(未示出)，其适于冲洗和净化采样和移液装置13的采样针15。

图4描绘了根据本发明的用于确定样品中的分析物的量的方法。所述方法由根据本发明的自动分析装置2进行。

根据本发明的用于确定样品中的分析物的量的方法包括以下步骤：

-利用采样和移液装置13在容置在转子7内的第一透明反应小容器11内混合包含待量化的分析物33的样品、脱脂剂34和涂覆有第一分析物结合配偶体36的磁性颗粒35的第一溶液(步骤S1)；

-利用转子7温育第一透明反应小容器11内容纳的混合物以便脂类因脱脂剂34而沉淀，且分析物33与第一分析物结合配偶体36结合(步骤S2)；

-利用转子7将第一透明小容器11输送在磁性沉降和洗涤模块23的前面；

-从转子7中取出第一透明反应小容器11并将所述第一透明反应小容器11定位在所述磁性沉降和洗涤模块23的磁场发生器附近，以便其磁场发生器将磁性颗粒35吸引至第一透明反应小容器11的内壁部分；

-利用磁性沉降和洗涤模块23的移液器具25从第一透明小容器11中抽吸未结合的试剂(步骤S3)；

-利用移液器具25将洗涤溶液引入透明反应小容器11内，以洗涤磁性颗粒；

-利用移液器具25从第一透明小容器11中抽吸洗涤溶液；

-将已经洗涤的第一透明反应小容器11重新装载在转子7中；

-利用采样和移液装置13向第一透明反应小容器11内提供洗脱溶液，以洗脱结合的分析物，即将分析物33与磁性颗粒35分离(步骤S4)；

-利用转子7将第一透明小容器11输送磁性吸引模块26的前面；

-从转子7中取出第一透明反应小容器11并将所述第一透明反应小容器11定位在磁性吸引模块26内，使得其磁场发生器28将磁性颗粒35吸引至第一透明反应小容器11的内壁部分；

-利用采样和移液装置13从第一透明反应小容器11中抽吸洗脱溶液和分析物(步骤S5)；

-利用采样和移液装置13将洗脱溶液和分析物33分配至容置在转子7内的第二空透明反应小容器11'内(步骤S6)；

-利用采样和移液装置13向第二透明反应小容器11'提供包含涂覆有第二分析物结合配偶体38的磁性颗粒37的第二溶液(步骤S7)；以及

-量化第二透明反应小容器11'内容纳的洗脱溶液中的分析物。

将参考以下非限制性且非穷举的实例对本发明进行说明：

实例：

实例1：根据本发明测量样品中的1.25D浓度的量

对人类血液中的1,25D的测定可非常好地指示身体维生素D新陈代谢的有效性。

已经很难开发用于确定1,25D水平的测定方法，这主要是因为血液中的1,25D的浓度非常低。

众所周知，在自动化系统上或利用手动方法进行分析之前，需要费力进行多次提取步骤来测量1,25D。如今市场上可用的现有提取方法需要大量设备，包括纯化柱、旋转器、离心分离机和氮蒸发器。常常需要溶剂。样品的阳性鉴定会受损。

根据本发明对样品中的1,25D进行测量首先从在第一透明小容器内进行样品脱脂的为1,25D进行样品预处理开始。利用来自西格玛(Sigma)目录编号为D8787的22μL、10g硫酸葡聚糖(50k)在一升0.5M氯化镁和218μL样品中进行脱脂。

之后，1,25D立即被捕获到与314μL优化取代剂溶液结合的46μL涂覆有抗-1,25D抗体的磁性颗粒(MP)上。取代剂试剂由1升中的4.035g三水合磷酸氢二钾、0.489g磷酸二氢钾、19.5g氯化钠、4.19gANSA、0.209g华法林和104.7mL甲醇构成。通过以每1克Speedbeads羧酸盐改性颗粒36-144mg抗体耦合抗-1,25D抗体制成涂覆抗-1,25D的MP。从Thermo Scientific目录编号45152105050350获得的MP直径为0.8μm。已发现，使脱脂样品与MP在37℃的温度下温育十分钟足以将1,25D捕获到颗粒上。

利用由0.6g三水合磷酸氢二钾、0.97g磷酸二氢钾、1.0g氯化钠、1.0g吐温-20、1.0g Proclin-300和0.1g氮化钠(IDS目录编号为IS-CW100)溶于1升水组成的洗涤溶液来洗涤MP。至少需要对MP进行4次单独洗涤，之后还需用MOPS缓冲液(包括231mg MOPS钠盐、209mg MOPS和0.9g叠氮化钠)洗涤，以除去反应混合物中的未结合物和沉淀。

利用75μl的0.4N氢氧化钠对MP上捕获的1,25D进行6分钟的洗脱。接着，利用25μL的0.4M柠檬酸和100μL的测定缓冲液进行中和步骤,以产生与测定校准物相同的基本成分。将120μL洗出液从第一透明小容器转移至第二透明小容器进行1,25D测量。

利用1,25-二羟基维生素D测定试剂(IDS目录编号为IS-2400)来测量1,25D。将120μL包含提取的1,25D的洗出液与生物素化羊抗-1,25D抗体温育。然后，添加1,25D-吖啶共轭物，共轭物会争夺抗体结合位点。然后，添加涂覆抗生蛋白链菌素的磁性颗粒，且在进一步的温育步骤之后，洗涤磁性颗粒以除去未结合的材料。添加触发试剂之后，闪光型化学发光反应开始。通过作为相对光单元(RLU)的光电倍增管测量光信号，光信号与样品中存在的1,25D的量成反比。

该方法能够处理达3g/dL甘油三酯、300mg/dL胆固醇和7.55g/dL蛋白质的高脂类样品。观察到，完全自动化的方法与实例2中的IDS-iSYS1,25D免疫胶囊提取方法具有很好的相关性。

此处发现，可以利用涂覆抗-1,25D抗体的磁性颗粒和优化提取试剂直接从人类血清中提取1,25D，除了使用磁力分离器来洗涤MP之外，无需使用多项设备，且可以从MP中收集洗出液。整个提取过程需要大约21分钟。得出第一结果的时间为93分钟。

实例2：根据之前已知的方法测量样品中的1.25D浓度的量

通过向带标记的玻璃或塑料试管内添加500μL样品，之后添加50μL脱脂剂(包括一升0.5M氯化镁中的10克硫酸葡聚糖(50k)，Sigma目录编号为D8787)，在试管中对样品进行脱脂。混合并以2000g离心15分钟。

对胶囊贴标签。除去胶囊螺帽。向包含固相悬浮液的胶囊内添加150μL脱脂样品，固相附着有对1,25D高度特异的单克隆抗体。安全地使螺帽回位。在室温下将胶囊上下转动90分钟以使1,25D与单克隆抗体结合。

使胶囊直立3至5分钟以使凝胶沉淀。移除螺帽并使底塞脱离胶囊。将每一个胶囊放置在玻璃或塑料试管内以500至1000g离心1分钟。

用水洗涤胶囊3次，每次进行1分钟温育，之后以500-1000g进行离心1分钟，以除去可能的干扰物质。

将胶囊转移至适当标记的2mL聚丙烯锥形有缘基管。利用150μL的乙醇洗脱捕获的1,25D三次，每次进行1至2分钟温育，之后以500-1000g离心1分钟。

丢弃胶囊。将容纳洗出液的微量试管放置在加热块或水浴中以40℃的温度在温和的氮气流下蒸发45至60分钟。用200μL的测定缓冲液重构每一个微量试管。

利用1,25-二羟基维生素D测定试剂(IDS目录编号为IS-2400)来测量重构的免疫纯化样品，如实例1所描述的那样。

整个提取过程需要大约4个小时。得出第一结果的时间为大约5小时。

当然，本发明并不限于以上通过非限制性实例描述的实施方式，相反，本发明包含其所有实施方式。