一种松江鲈Tf‑Hepcidin基因、松江鲈Tf‑Hepcidin成熟肽蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种松江鲈Tf-Hepcidin基因的cDNA全长序列，由其通过酵母真核表达系统表达得到的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白及其应用。

背景技术

松江鲈(Trachidermus fasciatus)又名四鳃鲈，隶属于鲉形目(Scorpaeniforme)，杜父鱼科(Cottidae)，松江鲈属(Trachidermus)，是一种典型的降海洄游性的小型鱼类，整个生长期面临海水与淡水两种更加复杂的生存环境，曾广泛分布于我国沿海。近年来，由于水体污染及兴建河道水利等原因破坏了松江鲈栖息、繁殖和洄游路线，导致该物种种群数量锐减，分布区也急剧缩小，因此，研究、发展松江鲈的养殖和应用，具有重要的意义。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一类由基因编码、核糖体合成的多肽类物质，是生物体先天免疫反应的重要组成部分。抗菌肽作为一种新型的抗菌剂，具有广谱的抗细菌活性、抗真菌、病毒和寄生虫活性，尤其是水产动物来源的抗菌肽，因具有免疫原性低的特点，可充分发挥药物的优势。

Hepcidin是一类富含半胱氨酸、具有二硫键结构的多肽，主要在肝脏内表达，为一类有独特性质的抗菌肽，研究发现，Hepcidin在体内除了和其它抗菌肽一样参与宿主的天然防御功能外，它作为一种新发现的炎症急性反应蛋白，是铁代谢重要的负性调节素，在固有免疫、慢性炎症性贫血、血色病等与铁代谢相关性疾病中发挥重要作用。

鱼源抗菌肽Hepcidin最早在2002年由Shike等从杂交斑纹鲈鱼的鳃中分离到。与其它抗菌肽的应用研究类似，鱼源抗菌肽面临一些亟待解决的问题，例如在体内易失活、易受蛋白酶降解且合成费用昂贵等。因此迄今为止，研究较为成熟的抗菌肽主要来源于昆虫和哺乳类动物，且主要应用于畜禽养殖业， 几乎未见抗菌肽、尤其是水产动物来源的抗菌肽在水产养殖中的应用报道。因此，基于松江鲈独特的生物学和生态生理学特点，如果能够获得松江鲈Tf-Hepcidin基因的全长序列，并由此获得一种性质稳定且能够应用于水产养殖中的鱼源抗菌肽这对于本领域而言将具有的深远意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种松江鲈Tf-Hepcidin基因的cDNA全长序列，由其通过酵母真核表达系统表达得到的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白及其应用。

本发明的一方面提供了一种松江鲈Tf-Hepcidin基因，其序列全长为988bp，包含273bp基因开放阅读框，其核苷酸序列如下：

其中，序列中下划线标示的ATG为起始密码子，下划线标示的TGA为终止密码子，双下划线示出的AATAAA为加尾信号。

本发明的另一方面提供了一种利用上述技术方案所述的松江鲈 Tf-Hepcidin基因编码的蛋白，包括90个氨基酸，其氨基酸序列如下：

其中，1-24位氨基酸为信号肽，25-64位氨基酸为前肽，65-90位氨基酸为成熟肽。

本发明的再一方面提供了一种松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白，由上述技术方案所述的松江鲈Tf-Hepcidin基因通过酵母真核表达系统表达得到。在该技术方案中，所采用的真核表达菌株为毕赤酵母Pichia pastoris GS115，表达载体为pPICZαA。这里需要说明的是，本发明所提供的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白是松江鲈Tf-Hepcidin基因通过酵母真核表达系统而非原核表达系统表达得到的，因为由原核表达系统(pet30a)表达的Tf-Hepcidin原前体肽蛋白和成熟肽蛋白均没有活性。

本发明的又一方面提供了一种如上述技术方案所述的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白在制备抗菌组合物中的应用。可以理解的是，该技术方案所提供的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白可用于制备抗菌组合物，当然，该技术方案并不局限于使用松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白，还可以是使用松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白与其它组分的任意混合物来制备抗菌组合物。其中，该抗菌组合物可以是任一种抗菌产品，也可以是抗菌药物等，本技术方案中对其具体应用范围不做限定。

优选的，所述松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度范围为5-70μg/mL，对革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度范围为30-80μg/mL。

具体的，所述革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌S.aureus、苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis、枯草芽孢杆菌B.subtilis和巨大芽孢杆菌B.megaterium中的至少一种，其中，所述松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白对巨大芽孢杆菌B.megaterium的最小抑菌浓度为8μg/mL，对枯草芽孢杆菌B.subtilis的最小抑菌浓度为5μg/mL，对金黄色葡萄球菌S.aureus的最小抑菌浓度为50μg/mL，对苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis的最小抑菌浓度为70μg/mL。

具体的，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌E.coli、鳗弧菌V.anguillarum、肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae和绿脓杆菌P.aeruginosa中的至少一种，其中，所述松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白对大肠杆菌E.coli的最小抑菌浓度为80μg/mL，对鳗弧菌V.anguillarum的最小抑菌浓度为65μg/mL，对肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae的最小抑菌浓度为30μg/mL，对绿脓杆菌P.aeruginosa的最小抑菌浓度为60μg/mL。

本发明的又一方面提供了一种所述的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白在制备鱼饲料添加剂中的应用。

本发明通过松江鲈Tf-Hepcidin基因的获得，填补了松江鲈Tf-Hepcidin基因研究的空缺。同时，根据松江鲈Tf-Hepcidin基因序列可以人工合成或转基因生物合成具有生物活性的重组蛋白，有助于我们了解松江鲈Tf-Hepcidin基因的基因组结构，分析该基因的表达和蛋白的功能。此外，发明人通过松江鲈Tf-Hepcidin基因序列还构建得到了松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白，可作为鱼饲料的添加剂，有效运用到水产养殖中。

附图说明

图1为本发明实施例2所提供的液体抑菌曲线示意图；

图2为本发明实施例3所提供的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白糖结合定 量表，其中，试验所得数值为3次重复试验平均值；

图3为本发明实施例4所提供的分别注射鳗弧菌、鳗弧菌+松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白后的鲤鱼死亡率示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：松江鲈Tf-Hepcidin基因的克隆以及cDNA全长序列的获得：

首先，利用鳗弧菌及脂多糖(LPS)感染松江鲈2小时后，取松江鲈肝、鳃、胃、肠、脾、肾、皮、脑等多个组织构建松江鲈cDNA全长序列文库，通过随机挑选单克隆测序获得Tf-Hepcidin基因片段信息及单克隆菌株(载体pDNR-LIB)，随后，提取质粒以PCR引物M13-47和RV-M进行PCR获得完整的Tf-Hepcidin基因的cDNA全长序列。其中：

PCR引物：

M13-47：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；

RV-M：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；

PCR反应条件：

94℃预变性5min，94℃变性45s，56℃复性45s，72℃延伸30s，35个循环，72℃总延伸10min，得到序列表中所示的松江鲈Tf-Hepcidin基因的cDNA全长序列，并对其进行编码，得到相应的氨基酸序列。预测蛋白分子9996.7Da，理论等电点(pI)为8.42。

实施例2：抑菌活性检测

本实施例通过管碟法^[137](牛津杯法)检测纯化后的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白是否具有抑菌活性。

选取4种革兰氏阴性菌：大肠杆菌E.coli、鳗弧菌V.anguillarum、肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae、绿脓杆菌P.aeruginosa和4种革兰氏阳性菌： 金黄色葡萄球菌S.aureus、苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis、巨大芽孢杆菌B.megaterium、枯草芽孢杆菌B.subtilis进行抑菌实验。

首先在固体平板上挑取各细菌的单菌落接种于3mL液体培养基中37℃(鳗弧菌28℃)培养，当细菌长到对数生长期时，取50μL均匀涂布于LB固体培养基表面，然后放置3个灭菌的牛津杯，牛津杯中分别加入纯化的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白、卡那霉素作为阳性对照、BSA作为阴性对照，培养1-2天，观察抑菌结果。

本实施例还通过液体抑菌来检测松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白对各种细菌的最小抑菌浓度。将通过管碟法测得有抑菌效果的细菌进行培养，用PBS将菌体洗3次，然后重悬于灭菌后的LB培养基中，并将浓度调至2×10⁶个/mL，取细菌510μL和90μL的不同浓度的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白混合均匀，按照每孔加200μL加入96孔板中，每次实验重复三次，对照组有无菌的LB培养基组和PBS代替重组蛋白组，37℃孵育10h，每隔一小时用酶标仪测量OD₆₃₀值。需要特别注意的是，操作过程中要避免细菌污染，操作过程在无菌工作台里进行。最小抑菌浓度即为各菌株的生长完全被抑制时的蛋白浓度。液体抑菌测得的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白对各种细菌的最小抑菌浓度见表1，并且如图1所示，给出了以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)为代表的革兰氏阳性菌和以鳗弧菌(V.anguillarum)为代表的革兰氏阴性菌的液体抑菌曲线。

表1Tf-Hepcidin蛋白对各细菌的最小抑菌浓度

由此可见，本发明上述实施例提供的松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白抑菌活性显著，可有效添加到抗菌组合物中起到抑菌作用。

实施例3：糖结合试验

为了探索松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白的抑菌模式，通过ELISA检测其是否能与肽聚糖(peptidoglycans,PGN)、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)等病原相关模式分子结合。

分别称取1mg LTA、LPS和PGN，溶于200μl双蒸水中配成母液(多糖20％功率，2×3s超声破碎后即可溶于水)，然后吸16μl母液加入到984μl双蒸水中配成80μg/ml溶液备用。

糖结合试验具体步骤如下：

(1)包板：在96孔板中加入50μL多糖，并置于25℃恒温培养箱中过夜晾干(注意：该96孔板为高亲和性的)。

(2)固定：次日清晨，60℃孵育30min。

(3)封闭：每孔加入200μL含5％的脱脂奶粉的PBS，37℃封闭2h。

(4)洗板：倒掉封闭液，每孔加入200μL的PBST(20％Tween-80∶PBS＝1∶100)洗4次，每次5min。

(5)蛋白结合：每孔加入50μL的蛋白(蛋白用含1％脱脂奶粉的PBS二倍梯度稀释，对照组加入50μL BSA，室温下孵育3h。

(6)洗板：倒掉蛋白，每孔加入200μL的PBST(20％Tween-80∶PBS＝1∶100)洗4次，每次5min。

(7)加一抗：将Tf-Hepcidin的抗体按照1∶300的比例稀释于含1％脱脂奶粉的PBS中，每孔加入100μL，室温条件下反应1-2h。

(8)洗板：倒掉一抗，每孔加入200μL的PBST(20％Tween-80∶PBS＝1∶100)洗4次，每次5min。

(9)加二抗：将辣根过氧化物酶标记羊抗兔(二抗)按照1∶2000的比例稀释于含1％脱脂奶粉的PBS中，每孔加入100μL，室温条件下反应1h。

(10)洗板：倒掉二抗，每孔加入200μL的PBST(20％Tween-80∶PBS＝1∶100)洗4次，每次5min。

(11)显色：按照上海生工IL-TMB显色试剂盒说明书进行显色，37℃条件下显色5-10min，酶标仪450nm处读取吸光值。

结果可见，本实施例用ELISA法对3种糖：肽聚糖(peptidoglycans,PGN)、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)进行糖的直接结合实验，结果如图2所示，糖结合实验表明：松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白可以和以上三种糖特异性结合，并且随着蛋白浓度的增加结合能力呈现出饱和性。这说明松江鲈Tf-Hepcidin蛋白可作为模式识别受体发挥作用，在这种情况下，动物蛋白可通过糖结合等识别致病菌，从而介导下游的免疫效应作用，例如凝集、固化、诱导吞噬作用、激活补体、激活血小板、加强自然杀伤细胞活性。

实施例4：细菌感染试验

将鳗弧菌在28℃温度下振荡培养并转培养至对数生长期后，用TBS洗涤2次后重悬至1％体积。将个体大小相似的鲤鱼(Cyprinus carpio)饲养于充气的淡水中，室温下适应一周后进行试验。实验鲤鱼平行分为3组，分别注射鳗弧菌、0.65％NaCl溶液(阴性对照)、松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白(0.8mg/ml)+鳗弧菌(1:1混合)，每12小时统计死亡率，直至96小时。

结果如图3所示，鳗弧菌刺激后松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白在松江鲈体内的免疫作用实验表明，相比于只注射鳗弧菌组，注射鳗弧菌+松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白组在96小时内的致死率相比降低到30％。由于0.65％NaCl溶液为阴性对照，没有死亡，因此图3中未示出该条曲线。

可以理解的是，鳗弧菌是条件致病菌，当水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇不利刺激或是受伤时，鳗弧菌会诱发水产养殖动物疾病的发生。但结合实施例4所给出的细菌感染试验可知，在向鳗弧菌中加入松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白后，可明显降低鲤鱼在96小时内的致死率，因此，可将松江鲈Tf-Hepcidin成熟肽蛋白作为添加剂加入到鱼饲料中，作为鱼饲料投喂水产动物时，不仅可降低其致死率，而且结合上述实施例可知，松江鲈Tf-Hepcidin成 熟肽蛋白还具有免疫识别效应，因此还可提高水产养殖动物的免疫能力。