一类GLP‑1R/GCGR双重激动剂在用于降糖和减肥药物中的运用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂制备用于降糖和减肥药物的应用。

背景技术

肥胖是2型糖尿病、高血脂和高血压等的重要危险因素。目前全球有三分之一的人超重或肥胖，预计到2025年将增加至5亿。目前关于肥胖的治疗主要通过手术治疗，有关肥胖的治疗药物非常有限。

胰高血糖素原基因位于2号染色体长臂，由6个外显子和5个内含子组成，在胰腺和肠道L细胞内表达，生成由160个氨基酸组成的胰高血糖素原(proglucagon，PG)。胰高血糖素原在胰腺和肠道中裂解后转化的产物不同。PG在肠道中主要裂解为：肠高血糖素(Glicentin：PG1～69)，肠高血糖素分子继续裂解为GRPP(PG1～30)和胃泌酸调节素(Oxyntomodulin：PG33～69)；插入肽-2(IP-2：PG111～123)；胰高血糖素样肽-2(GLP-2：PG126～158)；和GLP-1(1～37)-OH(PG72～108)。

胰高血糖素(Glu)：含29个氨基酸组成的，胰脏胰岛α-细胞分泌的激素。肽序结构为：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH。它能激活GLP-1受体(GLP-1R)和胰高血糖素受体(GCGR)，其中对GCGR的激动活性远远强于对GLP-1R的激动活性，因此主要表现出GCGR激动活性，表现出升糖效果，具有很好的减肥作用。

Glu是一种促进分解代谢的激素，作用途径如下：

Glu具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高。胰高血糖素通过cAMP-PK系统，激活肝细胞的磷酸化酶，加速糖原分解。加速氨基酸进入肝细胞，并激活糖异生过程有关的酶系，糖异生增强，促进氨基酸的代谢分解。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多。胰高血糖素可促进胰岛素和胰岛生长抑素的分泌。药理剂量的胰高血糖素可使心肌细胞内cAMP含量增加，心肌收缩增强。表现出一定的生热作用，能一定程度降低体重。

因此通过对Glu进行结构改造，改变两受体的激活比率，有可能使得激动GLP-1R表现出降糖作用，很好的克服激活GCGR引起的升糖作用，并协同发挥降低体重效果。本发明基于Glu，采用丙氨酸、半胱氨酸等定点替换方法，打破传统，获得更优减肥疗效并且具有很好降糖效果的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽药物。

发明内容

本发明涉及一类胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂。其序列为：

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Cys-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Cys-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Cys-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Cys-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Cys-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Ala-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ala-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Ala-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Ala-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

本发明的第二个目的是提供了胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的肽链。

本发明的优点在于：

1.微波促进固相合成的胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的肽链大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。

2.微波促进固相合成胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽得到肽链的粗品的纯度大于60％，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作。

3.微波促进固相方法合成GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽，其成本低，由于偶合效率较高，所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。

4.微波促进固相合成GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。

因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的GLP-1R/GCGR双重激动剂，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的GLP-1R/GCGR双重激动剂，协同发挥两受体的激动作用，克服了天然胰高血糖素可能引起高血糖的风险，表现出更好的减肥和降糖效果。

具体实施方式

在本说明书全文中采用以下缩写：

Et₃N：三乙胺；NMM：N-甲基吗啉；DIEA：N，N′-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；CDI：N，N’-羰基二咪唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；Gly：甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：苏氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天门冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸。Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺。

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。

实施例1

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Cys-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

(1)树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mL NMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

(2)微波促进Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

(3)微波促进Fmoc-Thr(tBu)-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Thr(tBu)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

(4)偶合效率的检测

用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。

茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

(5)肽链的延长

按照多肽的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合微波促进反应时间5～20min不等。得到连有Cys₁₃-Glu-NH₂的树脂。

(6)树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有(SEQ.ID NO：1)多肽序列的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/ED T，82.5∶5∶5∶5∶2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到Cys₁₃-GluNH₂粗品63.2mg，收率为94.3％。

将上述多肽粗品溶于2mL水中，直接进制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液 冻干得纯品30mg。理论相对分子质量为3421.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1141.0，[M+4H]⁴⁺855.9；calcu[M+3H]³⁺1141.6，[M+4H]⁴⁺856.4。

实施例2～22

根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2～22的胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。

实施例2

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Cys-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3471.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1158.0，[M+4H]⁴⁺868.6；calcu[M+3H]³⁺1158.2，[M+4H]⁴⁺868.9。

实施例3

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3468.6。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1157.5，[M+4H]⁴⁺868.3；calcu[M+3H]³⁺1157.2，[M+4H]⁴⁺868.6。

实施例4

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3495.6。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1166.2，[M+4H]⁴⁺875.0；calcu[M+3H]³⁺1166.2，[M+4H]⁴⁺874.9。

实施例5

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3426.5。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1143.8，[M+4H]⁴⁺858.3；calcu[M+3H]³⁺1143.2，[M+4H]⁴⁺857.6。

实施例6

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Cys-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3426.5。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1144.6，[M+4H]⁴⁺857.6；calcu[M+3H]³⁺1143.2，[M+4H]⁴⁺857.6。

实施例7

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3513.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1172.1，[M+4H]⁴⁺879.0；calcu[M+3H]³⁺1172.3，[M+4H]⁴⁺879.5。

实施例8

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Cys-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3456.6。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1153.2，[M+4H]⁴⁺865.2；calcu[M+3H]³⁺1153.2，[M+4H]⁴⁺865.2。

实施例9

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Cys-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3469.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1157.3，[M+4H]⁴⁺867.6；calcu[M+3H]³⁺1157.6，[M+4H]⁴⁺868.5。

实施例10

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Cys-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3437.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1146.4，[M+4H]⁴⁺860.3；calcu[M+3H]³⁺1146.9，[M+4H]⁴⁺860.4。

实施例11

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Cys-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3485.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1162.6，[M+4H]⁴⁺872.2；calcu[M+3H]³⁺1162.9，[M+4H]⁴⁺872.4。

实施例12

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH2(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3456.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1153.0，[M+4H]⁴⁺865.1；calcu[M+3H]³⁺1153.2，[M+4H]⁴⁺865.2。

实施例13

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Ala-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3389.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1130.6，[M+4H]⁴⁺848.2；calcu[M+3H]³⁺1130.9，[M+4H]⁴⁺848.4。

实施例14

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Ala-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3439.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1147.5，[M+4H]⁴⁺860.8；calcu[M+3H]³⁺1147.6，[M+4H]⁴⁺860.9。

实施例15

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3347.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺⁺1146.7，[M+4H]⁴⁺860.4；calcu[M+3H]³⁺1146.9，[M+4H]⁴⁺860.5。

实施例16

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Ala-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3396.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1133.0，[M+4H]⁴⁺850.1；calcu[M+3H]³⁺1133.2，[M+4H]⁴⁺850.2。

实施例17

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3437.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1146.6，[M+4H]⁴⁺860.4；calcu[M+3H]³⁺1146.9，[M+4H]⁴⁺860.5。

实施例18

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Ala-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3405.7。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1136.0，[M+4H]⁴⁺852.3；calcu[M+3H]³⁺1136.2，[M+4H]⁴⁺852.4。

实施例19

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Ala-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3453.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1152.1，[M+4H]⁴⁺864.1；calcu[M+3H]³⁺1152.3，[M+4H]⁴⁺864.4。

实施例20

His-Ser-Gln-Gly-Thr-phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Cys-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3444.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1149.2，[M+4H]⁴⁺862.1；calcu[M+3H]³⁺1149.3，[M+4H]⁴⁺862.2。

实施例21

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Cys-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3460.8。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1154.5，[M+4H]⁴⁺866.1；calcu[M+3H]³⁺1154.6，[M+4H]⁴⁺866.2。

实施例22

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Cys-Arg-Arg-Cys-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-NH₂(SEQ.ID>

理论相对分子质量为3530.0。ESI-MS m/z：found[M+3H]³⁺1177.4，[M+4H]⁴⁺883.2；calcu[M+3H]³⁺1177.6，[M+4H]⁴⁺883.5。

实施例23

GLP-1R/GCGR双重激动剂的GLP-1R和GCGR受体激动活性筛选

HEK293细胞分别共转染编码GLP-1R或GCGR的cDNA，细胞系表达并利用WesternBlot检测已构建的HEK293细胞中GLP-1R或GCGR的蛋白水平，以考察是否建立了稳定高表达细胞株HEK293。

测定化合物的试验中，提前2h将细胞种于96孔板中，化合物用DMSO溶解，使用含有0.1％牛血清蛋白的培养基稀释至不同倍数，加入共转染的细胞中。细胞孵化20min后，使用Cisbo公司的ELISA试剂盒，使用酶标仪测定荧光读数，建立标准曲线将荧光读数转化为相应的cAMP数值，使用Graphpad Prism 5.0软件的非线性回归计算化合物的EC₅₀数值。

如表1所示，得到的绝大部分化合物较原型胰高血糖素相比，对GLP-1R的激动活性有不同程度的提高，而略降低了GCGR的激动活性。其中SEQ.ID NO：4和SEQ.ID NO：16对GLP-1R激动活性提高明显，分别提高了7.17和9.68倍。

表1 GLP-1R/GCGR双重激动剂对GLP-1R和GCGR激动活性

实施例24

GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽的体内降血糖活性

同时给予葡萄糖、受试化合物：10周龄雄性ICR小鼠，随机分组，每组6只。只给饮水，禁食过夜。一组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液(浓度20％)和生理盐水；其他组按照小鼠体重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液和1μmol/L的胰高血糖素类化合物溶液。在0，15，30，45，60min用血糖仪测定血糖水平。

如表2所示，绝大部分GLP-1R/GCGR双重激动剂多肽其体内降血糖活性明显提高。其中SEQ.ID NO：4和SEQ.ID NO：5表现出明显的降糖活性，很好的克服了Glu的升糖风险，与这些化合物有较好的GLP-1R激动活性，而适度降低了GCGR激动活性有关。

表2胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂降血糖效应

n＝6，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001>

实施例25

胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂长期给药体内控制体重活性

雄性清洁级小鼠16-20g，随机分组，8只为一组，共8组。适应性喂养2周，饲养期间，皮下给生理盐水0.25ml，使小鼠适应。给药前一天为第0天，第0天晚上小鼠禁食不禁水，次日腹腔给药后，正常给食给水。分别在第3，5，7，9，11和13天继续给药(重复第1天实验方案)，测试第14天各组小鼠的空腹体重，考察各组小鼠的平均体重变化。

由表3可以看出，由于选取的小鼠是8周龄小鼠还处于生长期，因此所有给药组小鼠体重均增加。绝大部分化合物体重增加值缓慢，表现出明显的控制体重增长，尤其以SEQ.ID NO：4、SEQ.ID NO：5、SEQ.ID NO：7、SEQ.ID NO：15和SEQ.ID NO：16控制体重最显著，明显优于对照Glu和OXM，该结果与我们所获得的化合物具有较好的GLP-1R/GCGR的激动活性数据相一致。

表3胰高血糖素相关的GLP-1R/GCGR双重激动剂的长期给药体重变化情况

^*p＜0.05，^**p＜0.01>***p＜0.001>#p＜0.05，^##p＜0.01>###p＜0.001compared>