一种鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的引物、试剂盒及鉴别方法

技术领域

本发明属于鱼类分子标记技术领域，涉及一种鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的引物、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

真鲷Pagrosomus>属鲈形目、鲷科、真鲷属，黑鲷Spraus>属鲈形目、 鲷科、黑鲷属，它们都是我国重要的海水养殖经济鱼类。真鲷具有个体大、生长快、肉质好、色泽美、抗病能力强等特点，但对盐度、温度变化敏感，抗逆性较差；黑鲷对温度、盐度适应范围较广，但生长慢，养成周期长。通过真鲷和黑鲷杂交育种，可以获得具有双亲优良性状的杂交子代，从而提高鲷鱼养殖经济效益，推动鲷鱼养殖业的发展。但杂交种形态又与亲本很相似，因此，生产上很容易造成鲷鱼种质混杂，导致种质混杂退化。运用分子生物技术在DNA水平上寻找不同鲷鱼的差异，可以快速、准确鉴别不同鲷鱼，为鲷鱼的品种鉴定、种质资源保护和育种等提供重要依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的引物、试剂盒及鉴别方法，有助于快速、准确鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代，在鲷鱼种质鉴定、保种和选育中有极大的应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的扩增引物，该引物的正义引物序列为：5′GACGATTATGATGATGGCCACTGAAC 3′，反义引物为：5′ CTCCCCATCCACCTGGACGAC 3′。

一种用于鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的试剂盒，该试剂盒含A试剂和B试剂，其中

A试剂的组成如下：

2×反应缓冲液；

Mg²⁺>

Taq酶 0.05U/μL

dNTP 400μmol/L；

正义、反义扩增引物各0.4μmol/L；

扩增引物：该引物的正义引物序列为：5′GACGATTATGATGATGGCCACTGAAC 3′，反义引物为：5′ CTCCCCATCCACCTGGACGAC 3′；

B试剂的组成如下：

TaaI内切酶>

2×buffer Tango 。

所述的试剂盒鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的方法，包括以下步骤：

步骤一，采集待鉴别的鲷鱼样品，提取基因组DNA；

步骤二，以步骤一得到的DNA为模板进行PCR扩增；

步骤三，对步骤二的扩增产物进行酶切与电泳检测；

步骤四，通过步骤三的电泳结果鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代，其中真鲷有3条条带，分别为147bp，133 bp和71 bp；黑鲷有2条条带，分别为231 bp和153 bp；杂交鲷有4条条带，分别为231 bp，153 bp，133 bp和71 bp。

所述的鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的方法，其步骤二中PCR扩增体系为：PCR体系总体积20 µL，其中含权利要求2所述的试剂盒A试剂10µL ，DNA模板 100 ng～200 ng，用灭菌双蒸馏水补足体积，最终PCR体系各组份的含量为：1×反应缓冲液，Mg²⁺>

所述的鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的方法，步骤二中PCR扩增条件为：94℃2min；94℃ 40s，60℃退火 40s，72℃ 40min，30个循环；72℃ 延伸5 min，4℃保存。

所述的鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的方法，步骤三中酶切体系为：酶切体系总体积20 µL，其中含权利要求2所述的试剂盒B试剂10µL，步骤二中PCR反应产物10μL，最终酶切体系各组份的含量为：PCR反应产物0.5μL/μL ，1×buffer Tango，TaaI内切酶0.5U/μL；65℃酶切2～16>

所述的鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的方法，其特征在于，步骤三中电泳为琼脂糖凝胶电泳。

本发明的有益效果：运用本发明所述的方法，可以在分子水平快速准确地同时将真鲷、黑鲷及其杂交后代区别开来，可以检测真鲷或黑鲷是否存在种质混杂。

附图说明

图1为本发明实施例1中真鲷、黑鲷及其杂交后代PCR产物酶切电泳结果，

其中M：分子量标准DL1000 DNA Marker

1-8：真鲷和黑鲷杂交后代

9-16：真鲷

16-24：黑鲷

图2为本发明实施例2中待检真鲷PCR产物酶切电泳检测结果，

其中M：分子量标准DL1000 DNA Marker

1-12：待检真鲷

13-18：真鲷和黑鲷杂交后代；

图3为本发明实施例3中待检真鲷，黑鲷PCR产物酶切电泳检测结果，

其中M：分子量标准DL1000 DNA Marker

1-6：真鲷和黑鲷杂交后代

7-13：真鲷

14-21：黑鲷。

具体实施方式

下列实施例中基因组DNA参照文献提取（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著. 分子克隆试验指南 [M]. 3版.黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等，译.北京：科学出版社，2002：463-471）。

实施例1

种类确定的真鲷、黑鲷及其杂交后代各8尾共24个样品，从江苏省海洋水产研究所吕四基地采得。每尾鱼取30μL血细胞抽提基因组DNA，分别以提取得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，正义引物为：5′GACGATTATGATGATGGCCACTGAAC 3′（SEQ ID NO.1），反义引物为：5′CTCCCCATCCACCTGGACGAC 3′（SEQ ID NO.2），PCR体系总体积20 µL，其中含1×反应缓冲液，Mg²⁺>TaaI内切酶10U，灭菌双蒸馏水补足体积，>

实施例2

待检真鲷12尾，以真鲷和黑鲷杂交鲷鱼6尾做对照，剪取每尾鱼尾鳍并抽提基因组DNA，采用如实施例1所述的方法进行PCR扩增、检测、再酶切，酶切产物用3%的琼脂糖电泳拍照记录电泳结果。如图2所示电泳检测发现，待检12尾真鲷都有3条条带，大小分别为147bp，133bp和71 bp；6尾真鲷和黑鲷杂交鲷鱼都有4条条带，分别为231 bp，153 bp，133 bp和71 bp。由电泳图谱可判定：所检测的12尾鲷鱼均为真鲷。

实施例3

待检真鲷7尾，黑鲷8尾，以真鲷和黑鲷杂交鲷6尾做对照。每尾鱼取30μL血细胞并抽提基因组DNA。采用如实施例1所述的方法进行PCR扩增、检测、再酶切，酶切产物用3%的琼脂糖电泳拍照记录电泳结果。如图3所示电泳检测发现，6尾真鲷和黑鲷杂交鲷鱼都有4条条带，分别为231 bp，153 bp，133 bp和71 bp；待检7尾真鲷都有3条条带，大小分别为147bp，133bp和71 bp；待检8尾黑鲷都有2条条带，分别为231 bp和153 bp由电泳图谱可判定：所检测的7尾真鲷，8尾黑鲷都为纯种，没有种质混杂。

实施例4

按照本发明的方法设计一种试剂盒，该试剂盒用来鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代，该试剂盒含A试剂和B试剂。

A试剂的组成如下：

2×反应缓冲液；

Mg²⁺>

Taq酶 0.05U/μL

dNTP 400μmol/L；

正义、反义扩增引物各0.4μmol/L；

扩增引物：该引物的正义引物序列为：5′GACGATTATGATGATGGCCACTGAAC 3′，反义引物为：5′ CTCCCCATCCACCTGGACGAC 3′；

B试剂的组成如下：

TaaI内切酶>

2×buffer Tango 。

使用以上试剂盒鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的方法如下：

步骤一，采集待鉴别的鲷鱼样品，提取基因组DNA；

步骤二，以步骤一得到的DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为：PCR体系总体积20 µL， PCR体系总体积20 µL，取步骤一得到的DNA为模板2μL，A试剂10μL，灭菌双蒸馏水补足体积，最终PCR体系各组份的含量为：1×反应缓冲液，Mg²⁺>

步骤三，对步骤二的扩增产物进行酶切与电泳检测。其中酶切体系总体积20 µL，其中含B试剂10µL，步骤二中PCR反应产物10μL，最终酶切体系各组份的含量为：PCR反应产物0.5μL/μL ，1×buffer Tango，TaaI内切酶0.5U/μL；65℃酶切2～16>

步骤四，通过步骤三的电泳结果鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代，其中真鲷有3条条带，分别为147bp，133 bp和71 bp；黑鲷有2条条带，分别为231 bp和153 bp；杂交鲷有4条条带，分别为231 bp，153 bp，133 bp和71 bp。

序列表

<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏省海洋水产研究所

<120>一种鉴别真鲷、黑鲷及其杂交后代的引物、试剂盒及鉴别方法

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gacgattatg atgatggcca ctgaac26

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctccccatcc acctggacga c 21