一种用于鱼类单殖吸虫的体外培养方法

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体涉及了一种用于鱼类单殖吸虫的体外培养方法。

背景技术

单殖吸虫病是养殖鱼类最严重的寄生虫病之一。单殖吸虫种类繁多，幼虫直接发育成成虫，没有中间宿主，繁殖速度非常快。它们通常以其后附着器的几丁质结构插入鱼类的组织，破坏鳃及皮肤组织，单殖吸虫寄生后通过继发感染致病细菌和真菌，造成鱼类“烂鳃病”的临床症状，引起养殖鱼类大量死亡。

目前，研究用于单殖吸虫的活体样本，主要方法是借助寄生在鱼鳃和幼鱼鳍条上的单殖吸虫，在自然繁殖下感染其它健康鱼体获得。该方法存在一些弊端：

(1)单殖吸虫病的流行具有明显的季节性，一年的流行时段只有3～4个月左右，除了这段时间就很难找到携带大量单殖吸虫的活体样本，并且单殖吸虫(包括幼虫、成虫)离开鱼体后，几个小时内大多就死亡，这就给药物筛选和药理研究造成了极大的限制；

(2)借助鱼体培养的方法不利于实验观察和数据统计，因为单殖吸虫在鱼鳃上分布不均匀，在实验操作过程中鱼鳃位置容易移动变化，不利于进行单殖吸虫的观察，且不同鱼的鳃上寄生的虫体数量差别较大，不同的实验技术人员的检测结果存在较大差异，人为影响因素较大，实验可重复性不佳；

(3)借助鱼体培养的方法不便于单殖吸虫的机理研究，水环境是非常复杂的，在研究单个环境因素对单殖吸虫的作用时难以控制。

因此，提供一种可行的单殖吸虫体外培养的方法，对于单殖吸虫的研究及其防治技术研究具有重要的应用价值和意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种用于鱼类单殖吸虫的体外培养方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种用于鱼类单殖吸虫的体外培养方法，包括如下步骤：

(1)无菌条件下，将经传代培养的细胞重悬于第一培养基中，调整细胞密度后转接于培养皿中，置于第一培养条件下培养，待细胞贴壁后，弃去所述第一培养基，加入第二培养基，待用；

(2)将从鱼体剥离的单殖吸虫重悬于第二培养基，然后转接于步骤(1)所述培养皿中，于第二培养条件下培养，获得在体外存活的鱼类单殖吸虫。

上述方案中，所述细胞密度为1.0×10⁶～3.0×10⁶个/mL。

上述方案中，所述单殖吸虫为指环虫。

上述方案中，所述细胞为鲤鱼上皮细胞。

上述方案中，所述第一培养基为M199培养基、胎牛血清(FBS)和抗生素的混合液，所述M199培养基和胎牛血清的体积比为9:1，所述抗生素为青霉素和链霉素的混合液，所述青霉素的工作浓度为100U/mL，所述链霉素的工作浓度为100μg/mL。

上述方案中，所述第一培养条件为：培养温度25℃，通入体积浓度为5％的CO₂气体。

上述方案中，所述第二培养基为第一培养基和细胞等渗液的混合液，所述细胞等渗液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。

上述方案中，所述第一培养基和细胞等渗液的体积比为1:9～7:3。更为优选地，所述第一培养基和细胞等渗液的体积比为5:5。

上述方案中，所述第二培养条件为：培养温度25℃。

本发明用于鱼类单殖吸虫的体外培养方法，可以广泛推广应用于多种鱼类寄生虫的体外培养，对于不同寄生虫的体外研究具有更好地指导性意义。

本发明的有益效果：(1)本发明提供了一种用于鱼类单殖吸虫的体外培养方法，解决了传统的鱼类单殖吸虫必须寄生在鱼体上，无法离体存活的问题；(2)本发明采用鲤鱼上皮细胞作为寄生载体，鲤鱼上皮细胞贴壁生长后固定附着在培养皿底部，因此可以较好的观察单殖吸虫的形态，并且可以根据研究条件选择不同规格的培养皿，加入确定数量的单殖吸虫，便于数据统计。(3)本发明所述体外培养方法的模型为细胞模型，所采用的寄生载体(鲤鱼上皮细胞)非常容易大量获得，不受时间限制，因此，可以极大地缩短单殖吸虫创新药物的筛选周期，同时更方便进行单殖吸虫食性研究。

附图说明

图1为本发明所述指环虫体外培养的光镜下形态观察图，×80，其中1为指环虫，11为指环虫的固着盘，12为指环虫的头器，2为鲤鱼上皮细胞。

图2为本发明所述指环虫体外培养作尺蠖运动的光镜下形态观察截图，×80；其中，

(A)指环虫体外培养作尺蠖运动0秒时的光镜下形态观察图，×80；

(B)指环虫体外培养作尺蠖运动1秒时的光镜下形态观察图，×80；

(C)指环虫体外培养作尺蠖运动2秒时的光镜下形态观察图，×80；

(D)指环虫体外培养作尺蠖运动3秒时的光镜下形态观察图，×80；

(E)指环虫体外培养作尺蠖运动4秒时的光镜下形态观察图，×80；

(F)指环虫体外培养作尺蠖运动5秒时的光镜下形态观察图，×80；

(G)指环虫体外培养作尺蠖运动6秒时的光镜下形态观察图，×80；

(H)指环虫体外培养作尺蠖运动7秒时的光镜下形态观察图，×80；

(I)指环虫体外培养作尺蠖运动8秒时的光镜下形态观察图，×80；

(J)指环虫体外培养作尺蠖运动9秒时的光镜下形态观察图，×80；

(K)指环虫体外培养作尺蠖运动10秒时的光镜下形态观察图，×80；

(L)指环虫体外培养作尺蠖运动11秒时的光镜下形态观察图，×80。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

图1示出了本发明的指环虫体外培养的光镜下形态观察图，×80，示出了本专利的单殖吸虫寄生在细胞的形态。

本发明所述用于鱼类单殖吸虫的体外培养方法，包括如下步骤：

(1)无菌条件下，将经传代培养的鲤鱼上皮细胞重悬于第一培养基中，调整细胞密度为1.0×10⁶～3.0×10⁶个/mL后转接于培养皿中，置于第一培养条件下培养，待细胞贴壁后，弃去所述第一培养基，加入第二培养基，待用；

(2)将从鱼体剥离的单殖吸虫重悬于第二培养基，然后转接于步骤(1)所述培养皿中，于第二培养条件下培养，获得在体外存活的鱼类单殖吸虫。

显微镜下观察所述单殖吸虫，可见所述单殖吸虫稳定粘附于细胞上作尺蠖状运动，与所述单殖吸虫在鱼鳃上和鳍条上的运动方式一致。步骤(1)中的高密度细胞在贴壁后，形成一层紧密排列的单层细胞层，意在模拟鱼鳃鳃丝表面结构，为单殖吸虫提供寄生载体，并且将细胞固定在细胞平皿上，待单殖吸虫粘附到细胞表面后，便于单殖吸虫的观察与计数，这种培养方法可以让单殖吸虫在脱离寄生宿主后，在体外条件下存活较长时间，便于研究的进行。

所述单殖吸虫为指环虫。图1中为指环虫1的固着盘11吸附在鲤鱼上皮细胞2上，头器12伸缩活动，图2为指环虫1粘附在鲤鱼上皮细胞2上后作尺蠖运动，从第0秒～第10秒，每隔1秒截取的光镜下形态观察静态图，可见指环虫1的活性非常好，与寄生在鱼鳃上一致。

所述细胞为鲤鱼上皮细胞。鲤鱼上皮细胞为贴壁生长细胞，最适培养温度为25℃，单殖吸虫的最适培养温度也为25℃，因此在培养条件上比较合适。

所述第一培养基为M199培养基、胎牛血清(FBS)和抗生素的混合液，所述抗生素为青霉素(工作浓度为100U/mL)和链霉素(工作浓度为100μg/mL)，所述M199培养基和胎牛血清的体积比为9:1。M199培养基是培养鲤鱼上皮细胞的培养基，富含比较全的营养成分，相比其他培养基而言，并且在相同的实验条件下，M199培养基比RPMI1640培养基培养出的单殖吸虫活力更强，由于青霉素和链霉素是细胞培养所需的主要抗生素，且具有广谱抑菌作用，故选择这两种抗生素作为本发明的抗生素，但其他抗生素亦可以得到相同效果，并不局限于此。

所述第一培养条件为培养温度25℃，通入体积浓度为5％的CO₂气体。鲤鱼上皮细胞的培养条件为最适培养温度为25℃，该温度下培养的细胞拥有较好的形态及活力。

所述第二培养基为所述第一培养基：细胞等渗液的体积分数比为1:9～7:3。当第一培养基：细胞等渗液的体积分数比为1:9～7:3时，短时间内，第二培养基可以保持无菌状态，且单殖吸虫可以短时间内体外存活。

所述第二培养基为所述第一培养基：细胞等渗液的体积分数比为5:5。当第一培养基：细胞等渗液的体积分数比为5:5时，第二培养基可以长期保持无菌状态，且单殖吸虫可以体外存活更长时间。

所述细胞等渗液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。与水相比，细胞等渗液能更好地维持单殖吸虫形态和活性，由于鱼是变温动物，所以细胞等渗液使用两栖类动物生理盐水更为合适，但细胞等渗液不仅仅指0.65％的NaCl溶液，D-Hanks溶液和PBS溶液亦可达到相同效果。

所述第二培养条件为：培养温度25℃。鉴于25℃为鲤鱼上皮细胞和单殖吸虫的最适培养温度，缺乏通入体积浓度为5％的CO₂气体不会对细胞形态造成变化，并且通入体积浓度为5％的CO₂气体会造成单殖吸虫的死亡，故选择25℃作为第二培养条件。

下面通过实验对本发明的有效性作进一步说明。

实验一

为了摸索M199培养基和胎牛血清(FBS)按体积比9:1混合的混合液对单殖吸虫的影响，设计了以下实验：取25个从鱼鳃剥离的单殖吸虫，分为5组，每组5个单殖吸虫，置于等倍稀释(稀释液为细胞等渗液，实验一～实验四中的稀释液均为质量分数为0.65％的NaCl溶液)的不含抗生素的混合液中培养，培养温度为25℃，每隔24小时显微镜下观察一次。

表1 M199培养基和胎牛血清(FBS)的混合液对单殖吸虫的影响

通过上述实验结果可知，M199培养基和胎牛血清(FBS)混合液(无抗生素)稀释后虽然可以延缓细菌繁殖速度，但最终还是无法控制，仍需要添加抗生素；推测高浓度的混合液可能不适合单殖吸虫的生长。

实验二

为了确定高浓度的M199培养基和胎牛血清(FBS)的混合液对单殖吸虫生长的影响，设计了以下实验：取55个从鱼鳃剥离的单殖吸虫，分为11组，每组5个单殖吸虫，向混合液(M199培养基和胎牛血清(FBS)按体积比9:1混合)中加入抗生素，将单殖吸虫置于抗生素浓度逐步稀释的混合液中培养，培养温度为25℃，每隔24小时显微镜下观察一次，其中，工作浓度为100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素的抗生素混合液的浓度，记为1×；含有1×抗生素的混合液即为第一培养基。

表2含抗生素的M199培养基和胎牛血清(FBS)的混合液对单殖吸虫生长的影响

通过上述实验结果可知，未经稀释液稀释的混合液(无论是否添加抗生素)对单殖吸虫都是有伤害的；抗生素工作浓度在0.3×～1×时，都是有较好的抑菌效果的。

实验三

为了进一步摸索单殖吸虫体外培养的合适培养基及抗生素工作浓度，设计了以下实验：取55个从鱼鳃剥离的单殖吸虫，分为11组，每组5个单殖吸虫，置于用稀释液(质量分数为0.65％的NaCl溶液)逐步稀释的第一培养基中培养，培养温度为25℃，每隔24小时显微镜下观察一次。

表3稀释液稀释的第一培养基对单殖吸虫生长的影响

通过上述实验结果可知，体外培养适宜条件为实验组第六组和第七组，但考虑到实验一和实验二中高浓度的混合液和高浓度的抗生素对单殖吸虫有不好的影响，故选择第六组为第二培养基作为后面单殖吸虫离体培养的培养基。

实验四

在实验三中，与在稀释液中相比，单殖吸虫可以在第二培养基中存活两天，但仍然时间不够长，因此，推测单殖吸虫的离体培养的难点不仅仅是营养因素，还存在缺乏寄生载体的原因。为了模拟鱼鳃表面层，选择培养至形成单分子层的鲤鱼上皮细胞(EPC)做为寄生载体，设计以下实验：取30个从鱼鳃剥离的单殖吸虫，分为6组，包括4个对照组和两个实验组，每组5个单殖吸虫，培养温度25℃，每隔24小时于显微镜下观察单殖吸虫的状态。

表4寄生载体EPC细胞对单殖吸虫生长的影响

通过上述实验结果可知，对比照组1和对照组2，我们发现在没有EPC细胞作为寄生载体时，即便培养介质是第二培养基，通入体积浓度为5％的CO₂气体仍会造成单殖吸虫的死亡；对比对照组3和对照组4可知，在有或无5％CO₂下，第二培养基均可以长期维持EPC细胞的形态不变；对比实验组1和实验组2，发现单殖吸虫可以粘附在EPC细胞上，EPC细胞可作为单殖吸虫体外培养的寄生载体，并且在无5％CO₂环境下的EPC细胞上附着存活更长时间。

该发明解决了单殖吸虫必须寄生在鱼鳃或幼鱼鳍条上，无法离体存活的问题，不会像传统的单殖吸虫病研究受到流行季节的限制，因此具有缩短单殖吸虫病新药创制研究周期的作用。

该发明使用细胞模型体外培养单殖吸虫，方便移植到其他鱼类寄生虫的体外培养，不仅可以让鱼类寄生虫的研究不受活体样本的限制，还可以人为地控制接种寄生虫的密度，使得各种实验数据更为准确。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。