一个双组份的杀草丹降解酶体系及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于环境微生物和农业领域，涉及一个双组份的杀草丹降解酶体系及其编码基因和应用。

背景技术

化学农药作为保障农业丰收的重要手段，在农业生产中发挥着非常重要的作用。然而，由于人们长期的不科学用药，剧毒、高残留、难降解农药的大量使用，我们面临着不断增加的土壤、地下水和大气农药污染的环境问题。鉴于农药残留的持久性、农药施用的普遍性和农药污染的严重性，土壤农药污染的修复成为必须解决的重大问题。微生物修复因其高效、安全、成本低、无二次污染等而具有非常广阔的发展前景，这方面研究的持续快速发展也推动应用的步伐。

杀草丹是一种广泛应用于水稻生产的硫代氨基甲酸酯类除草剂，其主要特性是在禾本科属间具有选择性，通过植物体内吸传导强烈抑制植物生长。杀草丹具有中等毒性，对哺乳动物神经系统具有明显的损害，对水生生物毒性较大。杀草丹若施用不当会转化成严重抑制水稻生长的脱氯杀草丹。杀草丹降解的研究主要集中于土壤中的降解，植物、动物为体内代谢，光解和化学催化降解，而且代谢途径未完全研究清楚。关于微生物的降解途径的研究较为粗略，能够降解杀草丹的基因还未见报道。

获得杀草丹降解菌株和降解基因在治理除草剂残留，消除其药害技术研发中具有以下作用和功能，(一)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，(二)通过现代微生物发酵技术将杀草丹降解菌株和基因制成降解菌剂或酶制剂将土壤中杀草丹残留降解。因此杀草丹降解基因在消除该类除草剂药害及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供降解杀草丹的食酸菌T1及其应用。

本发明的另一目的是一种双组份的杀草丹降解酶体系，由一个单加氧酶基因tmoA和一个黄素还原酶基因tmoB组成。

本发明的又一目的是提供该基因编码的蛋白质及其应用。

一株降解杀草丹的食酸菌T1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年4月18号，保藏编号为CCTCC NO：M2016205。

一个双组份的杀草丹降解酶体系，由单加氧酶TmoA和黄素还原酶TmoB组成，单加氧酶TmoA的氨基酸序列为：SEQ ID NO.2，黄素还原酶TmoB的氨基酸序列为SEQ ID NO.5。

编码所述的单加氧酶TmoA的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

编码所述的黄素还原酶TmoB的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

含有所述的单加氧酶基因或所述的黄素还原酶基因的重组表达载体。

含有所述的单加氧酶基因或含有所述的黄素还原酶基因的基因工程菌。

本发明所述的食酸菌T1在降解和转化杀草丹中的应用。

本发明所述的单加氧酶基因和所述的黄素还原酶基因联合在构建降解杀草丹的转基因作物中的应用。

本发明所述双组份的杀草丹降解酶体系在降解和转化杀草丹中的应用。

本发明所述双组份的杀草丹降解酶体系在去除土壤、水体中杀草丹中的应用。

本发明所述的重组表达载体在降解杀草丹中的应用。

本发明所述的重组表达载体在构建降解杀草丹的转基因作物中的应用。

本发明有益效果：

本发明筛选获得一株食酸菌T1(CCTCC M 2016205)，质谱分析结果表明菌株T1可以断裂杀草丹中的C-S键，从而降解杀草丹。在此基础上，从菌株T1(CCTCC M 2016205)全基因组中克隆到一个双组份的杀草丹降解基因TmoA和TmoB，分别为单加氧酶基因tmoA和黄素还原酶基因tmoB，GenBank比对结果表明tmoA和tmoB为新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)分别为1209bp和501bp，分别编码403和167个氨基酸。该基因是首个公开的能降解杀草丹的降解基因。本发明提供的双组份酶TmoA和TmoB能在1hr内完全降解100mg/L的杀草丹。TmoA和TmoB可用于构建抗杀草丹的转基因作物，也可用于土壤、水体中杀草丹残留的去除，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明：

图1 T1全基因组与T1m全基因组比对

图2 PCR扩增验证丢失片段

图3丢失片段的ORF分析

图4单加氧酶基因tmoA和黄素还原酶基因tmoB在BL21(pET-24b(+))中表达策略图。

图5单加氧酶TmoA和黄素还原酶TmoB蛋白电泳图谱：

A：蛋白marker，B：IPTG诱导的BL24(TmoA)粗酶，C：纯化的TmoA蛋白,D：IPTG诱导的BL24(TmoB)诱导粗酶，E：纯化的TmoB。

图6单加氧酶TmoA和黄素还原酶TmoB催化的降解杀草丹LC/MS图谱；

A为杀草丹空白对照的HPLC图谱；TmoA和TmoB降解杀草丹的HPLC图谱；C和D为杀草丹降解产物的一级质谱和二级质谱图；E为杀草丹的一级质谱图。

图7 TmoA和TmoB降解杀草丹的途径。

生物材料保藏信息:

T1，分类命名为Acidovoroxradicis T1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2016年4月18号，保藏编号为CCTCC NO：M2016205。

具体实施方式

实施例1

1.1杀草丹降解菌株T1(CCTCC M 2016205)的分离

用来富集硫代氨基甲酸酯类除草剂降解菌株的富集基质取自某农药厂农药废水生化处理池的活性污泥，取活性污泥5.0g加入100ml基础盐培养基中，加入50mg·L-1的杀草丹，30℃，180r·min-1培养5d天，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接3次。利用紫外分光光度计和高效液相色谱仪检测第三次转接的富集培养液中杀草丹的残留量以及是否有新的代谢产物的生成。对有降解效果的富集液进行梯度稀释，取10^-4至10^-7梯度稀释富集液各0.1ml，分别涂布于加有100mg/l杀草丹的基础盐固体培养基上，30℃培养3d。挑取平板上的单菌落，进一步划线纯化，将得到的纯化单菌接种于加有100mg/l杀草丹的基础盐液体培养基中，30℃，150r/min培养5d，后验证各单菌落是否有杀草丹降解功能。

基础盐培养基(1L)配方为：5.0g葡萄糖，1.0g NH4NO3，1.0g NaCl，1.5g K₂HPO₄，0.5g>2PO₄，0.2g>4·7H₂O，加水至1L，pH>

通过富集驯化分离筛选得到一株杀草丹降解菌，命名为T1。该菌在36h内对100mgL-1的杀草丹降解率达到90％以上。

1.2杀草丹降解菌T1的鉴定和生物学特性

菌株T1在固体培养基上生长3d后，菌落为白色，不透明，黏度较大，圆形，边缘齐整，凸起，较湿润，不易挑取。菌体杆状，没有观察到鞭毛。以菌株T1的基因组DNA为模板，细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1416bp的T1 16S rRNA基因序列(GenBank：KX162718)。在EZtaxon数据库(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/ezt)中进行Blast，结果指出菌株T1与食酸菌属(Acidovoraxsp.)菌株的同源性最高，与AcidovoraxradicisN35(T)的同源性为99.22％。另外，结合菌株的形态学和生理生化特征将T1鉴定为食酸菌属(AcidovoraxradicisT1)该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2016205。

1.3降解菌株T1的降解特性及降解产物分析

降解特性的研究：将T1接种至LB液体培养基，30℃培养至对数中期，低速离心收集菌体，菌体用新鲜、无菌基础盐培养基洗涤2遍，重悬于基础盐培养基中，调节细胞浓度约为1.0×10⁹cfu/ml，按1％(v/v)接种量，接种到20ml，含100mg/l杀草丹的基础盐培养基中，30℃培养60h。每隔6h定时取样测定菌株生长和降解曲线。

定时取样培养液用等体积的二氯甲烷(色谱纯)剧烈震荡抽提，静置1h后，去除上层水相，下层用无水硫酸钠除水再过氮气干燥。样品用等体积的色谱纯甲醇溶解，滤膜(孔径0.22μm)过滤，高效液相色谱(HPLC)进行检测。HPLC色谱条件：Kromasil 100-5C18反向分离柱(5μm，4.6mm×250mm)，流动相为甲醇：水(80：20，V/V)，柱温为40℃，紫外检测器，测定波长221nm，进样量20μl，流速为1ml/min。外标法按峰面积定量。运用HPLC-MS对代谢产物的分析和鉴定。HPLC条件如上，流速调为0.6ml/min。LTQ Orbitrap XL质谱分析仪(ThermoFisher Scientific)MS/MS分析离子源为ESI，正离子和负离子检测模式。液质检测数据用Xcalibur软件处理分析。

实验结果表明菌株T1能够降解杀草丹，培养36h能降解约99％的100mg/l杀草丹。HPLC-MS分析结果表明T1降解杀草丹得第一步是碳硫键的断裂生成对氯苯甲醛，对氯苯甲醛经化学氧化自发生成对氯苯甲酸(图7)。

实施例2杀草丹降解基因tmoA和tmoB的克隆及功能验证

2.1细菌基因组总DNA的测序分析

2.1.1细菌基因组总DNA的提取

菌株T1(CCTCC M 2016205)及其突变株T1m在LB培养基中大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

2.1.2菌株T1基因组完成图与突变株T1m基因组草图的测序及结果分析

细菌基因组测序要求样品OD值在1.8-2.0之间，浓度越高越好，浓度不低于30ng/μl。将准备好的足量的DNA样品于干冰保温下寄送至美吉生物科技公司测序。

样品检测采用：1.浓度检测，琼脂糖凝胶电泳定量；2.OD260:280和OD260:230

检测方法：NanoDrop。

2.1.3基因组测序结果及比对分析

菌株T1全基因组完成图信息为：全基因组碱基数位4416593bp,其中包含1个染色体与三个大质粒(Plasmid1,2,3)，基因总数为4280，G+C含量为64.108mol％。

突变株T1m基因组草图信息为：全长4214119bp，scaffolds 179个，基因数量3869个，G+C含量为64.19mol％。

将两株菌的全基因组序列导入软件Mauve中，经比对发现菌株T1全基因组当中大约有35个片段(＞1.0Kb)在突变株中找不到相匹配的序列(如图1中红色箭头所示)，将这些片段导入OMIGA2.0中进一步与突变株T1m的全基因组进行比对，发现除了两个片段在突变株当中为连续的碎片状态外，其余的33个片段找不到同源序列。对这33个片段设计引物，分别用T1和T1m的总DNA作为模板进行PCR扩增，结果显示只有一个约8Kb的片段无法用T1m扩增出来，其余片段扩增全都为阳性。为排除PCR技术上的失误导致的扩增失败，特在8Kb片段两端各延伸1Kb处设计引物，再次用T1和T1m的总DNA作为模板进行PCR扩增，结果T1为模板可以扩增出11Kb的完整片段，而T1m只扩增出约3Kb的片段，说明该8Kb片段在突变株T1m中的确丢失了(如图2所示)。

基因组序列比对发现该丢失片段位于大质粒Plasmid 3上，对其进行了ORF分析(图3)。

NCBI blast分析表明，位于该片段上下游的ORF3和ORF4分别为编码Zn-Tnp和DDE-Tnp-Tn3的转座酶基因，同源相似度为100％。比对发现ORF1(tmoA)与PyrimidinemonooxygenaseRutA(Q6FFZ7.1)具有最高的相似度为31％，其次与AlkanesulfonatemonooxygenaseSsuD(P40402.2)相似度为28％,与MethanesulfonatemonooxygenaseMsuD(Q9I1C2.1)相似度为27％。其中后两种单加氧酶所催化的反应为C-S键的断裂，这与我们所推测的杀草丹降解途径中断碳硫键是相吻合的，因此预测该ORF1有可能是降解杀草丹的关键基因。并且以上所提到的具有同源相似度的单加氧酶均为两组分的酶，除了单加氧酶外还需要一个黄素依赖的还原酶为其提供还原力。

进一步分析发现，ORF2(tmoB)和编码非黄素蛋白的黄素依赖还原酶家族具有较高的同源相似度，其中与Nitrilotriacetatemonooxygenase component B，FMN reductase(NADH)NtaB有最高的同源相似度为37％，与Flavin-dependent monooxygenase,reductasesubunit HsaB相似度为34％，与4-HPA3-monooxygenase reductase component相似度为33％，与NADH-flavinreductaseRutF相似度为29％。这恰好补充了上文中预测中所缺少的还原酶的组分，因此我们预测ORF1和ORF2极有可能是降解杀草丹的关键酶基因。

在ORF1和ORF2的下游约300bp处设计引物，扩增包含ORF1和ORF2的基因片段A，将其与广宿主载体pBBR1MCS-2连接并转化E.coli DH5a,检测是否获得杀草丹降解活力。

2.1.4酶连，转化及杀草丹降解检测

酶连反应体系：

10×连接酶缓冲液1μl

A PCR扩增片段(KpnI,XbaI双酶切)3μl

pBBR1MCS-2(KpnI,XbaI双酶切)1μl

T4DNA连接酶0.5μl

dd H2O 4.5μl

16℃温育12小时。

将10μl酶连产物转化100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(TaKaRa，Code:D9057)，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P23。涂布含有50mg/kg卡那霉素的LB平板上，培养24小时。

挑取阳性克隆子进一步验证能否降解杀草丹。克隆子对杀草丹降解试验方法降解效果的验证方法：

在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取1ml下层二氯甲烷挥发完全后，加入1mL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。采用高效液相色谱测定提取液中杀草丹的含量，液相色谱条件：流动相为甲醇：水(80：20，V/V)，Zorbax C218ODS Spherex反相柱，柱温为40度，紫外检测器，测定波长221nm，进样量20μL，流速为1.0mL/min。外标法按峰面积定量。

实施例3杀草丹降解基因tmoA和tmoB在BL21(pET-24b(+))中的高效表达(图4)3.1杀草丹单加氧酶基因的PCR扩增

以正向引物：5’-CATATGTCCACTGAATTGTCAGTCAAAG-3’(SEQID>GTCGACAATCACATCGCGCAGGCCGCGTTCA-3’(SEQ>CATATGACAACAATTGAGCTTCAGCCTG-3’(SEQID>GTCGACTGCGGTGCTGAGTTGGCGGAATGAG-3’(SEQ>

PCR扩增程序：

a.95℃变性3min；

b.95℃变性1.5min，53℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，进行30个循环；

c.取出PCR管，加入0.5μlrTaq酶，72℃延伸10min，冷却到室温。

3.2PCR产物与pMD19-T simple vector相连接后，所得质粒用NdeI和Sal I双酶切。

酶切体系：

在37℃水浴中，反应3h以上。酶切产物进行0.75％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

3.3pET-24b(+)用NdeI和Sal I双酶切(参考3.2)。

3.4转化

3.2中的回收片段和3.3中酶切好的pET-24b(+)进行酶连。将酶连好的含tmoA/tmoB的pET-24b(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL24(TmoA)和BL24(TmoB)。

3.5单加氧酶TmoA和黄素还原酶TmoB的表达、纯化

将BL24(TmoA)和BL24(TmoB)在LB培养基中培养至OD600nm为0.6到0.8之间，加IPTG至浓度50μM，16℃培养10个小时。100ml菌液离心，用10ml(pH 7.4)PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(Auto Science,UH-650B ultrasonic processor,30％intensity)5分钟，离心，收集上清，用钴离子亲和层析柱对TmoA和TmoB进行纯化，纯化后的酶进行蛋白质电泳，见图5。

3.6双组份酶TmoA和TmoB降解杀草丹的活力测定

酶活反应体系(2ml)：(pH 7.4)PBS缓冲液，0.2mM杀草丹、1mMNADH,3μM FMN,0.2mg/ml过氧化氢酶，TmoA和TmoB(图5纯化所得)，30℃反应60min。每个反应以加入酶开始计时，用2ml二氯甲烷终止反应，分层后有机相经无水硫酸钠脱水，杀草丹含量用反向HPLC测定(具体方法见1.3)。一个酶活力单位(U)定义为：在pH 7.4，温度30℃条件下，每分钟催化减少1nmol杀草丹所需的酶量。降解试验表明纯化后的TmoA和TmoB能在1hr内降解0.172mM的杀草丹。酶学试验表明TmoA对杀草丹的比酶活为48.3U/mg protein。

3.7代谢产物的确定

2.7.1杀草丹降解代谢产物的确定

2.6中的杀草丹的酶反应液经二氯甲烷萃取，进行LC-MS，液相色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax XDB-C18柱，流动相：甲醇：水＝80：20，流速0.6ml/min；紫外检测波长221nm。一级质谱条件：离子检测方式为多反应离子检测；离子极性为正离子和负离子；离子化方式为电喷雾离子化；质量扫描范围(m/z)：50-800。二级子离子质谱条件：碰撞电压：90伏；质量扫描范围(m/z)：50-500。

LC-MS的液谱图表明，其产物的一级质谱图(见图6C)显示其有m/z为155.00分子负离子峰，m/z为155.00的分子负离子其二级质谱图(见图6D)中有m/z为154.89，110.80的片段，这与对氯苯甲酸相符。因此，根据杀草丹降解酶TmoA单加氧酶的特性，以及代谢产物的鉴定结果，推测TmoA降解杀草丹的生化反应是加氧断裂C-S键生成对氯苯甲醛，对氯苯甲醛自发氧化为对氯苯甲酸。(图7)。

以上实施例中使用的微生物来源如下：

大肠杆菌DH5α购自宝生物工程(大连)有限公司，

大肠杆菌高表达载体pET-24b(+)购自Novegen公司，

表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。