一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的PCT与CRP双标记时间分辨荧光免疫分析方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的PCT与CRP双标记时间分辨荧光免疫分析方法。

背景技术

中枢神经系统感染是儿科常见病和多发病，以细菌性脑膜炎和病毒性脑膜、脑炎最为多见，其中以细菌性脑膜炎最为常见，约占中枢神经系统感染的75％。细菌性脑膜炎是一类严重感染性疾病，病死率和后遗症发生率高，其中脑膜炎球菌、流感杆菌、肺炎球菌、大肠杆菌及其他革兰阳性杆菌等均是细菌性脑膜炎的致病菌，它要求急症处理，诊断和治疗上的任何拖延都将造成永久性的残废和死亡。病毒性脑膜炎是一组由各种病毒感染引起的软脑膜弥漫性炎症综合征，主要表现发热、头痛、呕吐和脑膜刺激征，是临床最常见的无菌性脑膜炎。大多数为肠道病毒感染，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A和B、埃可病毒等，主要是对症治疗和防治并发症，病程呈良性，有自限性，预后较好。及早鉴别诊断和采取有效的治疗措施是降低细菌性、病毒性脑膜炎致死率和致残率的关键。

PCT(降钙素原，procalcitonin)是一种蛋白质，可反映全身炎症反应的活跃程度，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，它在血浆中的水平升高；当机体各项生理活动正常时，PCT的水平一般低于0.5ng/ml。CRP(C-reactive protein)是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的一种急性相蛋白，在感染性、心血管、泌尿系及恶性肿瘤等疾病发生时均可迅速升高，正常机体参考值一般小于10μg/ml。众多研究表明，在细菌性和病毒性脑膜炎患者中，PCT和CRP的水平均显著高于健康儿童，这说明PCT和CRP可以作为儿童病毒性和细菌性脑膜炎临床诊断的指标。联合检测患者血浆PCT和CRP，可提高鉴别病毒和细菌感染的中枢神经系统疾病的能力，及时指导临床用药、换药、减量以及停药，减少抗生素的用量。

脑膜炎的诊断主要依赖于典型的临床表现和脑脊液病原体检查来诊断，但小儿对病情表达不清，查体不合作、不典型，起病者早期或经不正规治疗者的诊断存在一定困难，尤其小婴儿，其临床表现多数不典型，更易漏诊、误诊，若对这类患儿能早期诊断及鉴别病因，对治疗、预后、转归、减少后遗症将有极大的临床意义。病原体检查在基层医院因为条件有限而未能开展，又因耗时长和阳性率不高，在临床实际应用中意义不大；另外近年来抗生素的滥用使脑脊液细菌涂片培养灵敏度降低，以上多种因素造成小儿中枢神经系统感染早期诊断上的困难。

临床上PCT和CRP检测方法较多，以胶免疫层析法、化学发光法和免疫比浊法比较常用，比如广州万孚生物技术有限公司生产的PCT定量检测试剂盒，采用免疫层析法对血清或血浆中的PCT进行定量检测；南京诺尔曼生物技术有限公司采用荧光素增强免疫化学发光法定量检测血清或血浆中的PCT水平；深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司的CRP测定试剂盒，采用乳胶免疫比浊法，对全血样品中的CRP进行定量检测。对于PCT和CRP的同时检测，市场上只有广州万孚生物技术有限公司和武汉明德生物科技有限责任公司的定量检测试剂盒，均采用免疫层析法。虽然PCT和CRP的检测方法较多，但是灵敏度差，难以满足临床上脑膜炎早期诊断的需要。

时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA)是一种体外超微量分析定量技术，它采用镧系元素及其螯合物为示踪物，用时间分辨荧光免疫分析仪测定反应产物中的荧光强度，根据荧光强度的高低，判断反应体系中分析物的浓度。TRFIA克服了酶标记物不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，同时具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作简便、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰等优点，成为近年来免疫技术中兴起的超微量检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的PCT与CRP双标记时间分辨荧光免疫分析方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种重组多肽抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，编码该重组多肽抗原的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的PCT与CRP双标记时间分辨荧光免疫分析方法，包括下列步骤：

1)用所述重组多肽抗原作为免疫原，通过免疫处理分别筛选得到PCT抗体和CRP抗体；

2)固相包被抗体的制备：分别将PCT和CRP抗体用包被缓冲液稀释至1～5μg/ml，包被酶联板，并用封闭液封闭；

3)镧系元素离子标记抗体的制备：分别采用不同的镧系元素离子标记PCT或CRP抗体，分离纯化；

4)测定方法：在步骤2)制备的含有包被抗体的酶联板上，每孔依次同时加入PCT和CRP的标准品或者待测样品，补加分析缓冲液，室温震荡反应，洗涤液洗涤后，加入以分析缓冲液稀释的步骤3)制备的不同的镧系元素离子标记的PCT或CRP抗体，室温震荡反应后，洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。

优选的，步骤1)中包被缓冲液为50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液；封闭液为1％的BSA溶液。

优选的，步骤1)中将PCT和CRP抗体用50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释至3μg/ml和4μg/ml，按照100μl/孔加入到酶联板。

优选的，步骤3)中所述的分析缓冲液为50mmol/L pH 7.8Tris-HCl，每升含0.09％NaCl，0.02％BSA，0.05％Tween-20，0.05％NaN₃。

优选的，步骤3)中所述的洗涤液为含0.9％NaCl的50mmol/L的Tris-HCl浓缩液，按照1：25倍稀释使用。

优选的，步骤3)中所述的标准品系列浓度为PCT：0，0.01，0.1，1，10，100ng/ml；CRP：0，0.02，0.2，2，20，200μg/ml。

一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的PCT与CRP双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，由以下成分组成：包被有抗体的固相酶联板、洗涤液、分析缓冲液、增强液、Eu³⁺和Sm³⁺标记PCT和CRP抗体以及PCT和CRP蛋白参考标准品，上述组分如上述任一项所述。

本发明的有益效果是：

本发明的PCT-CRP重组多肽抗原分子量更小，同时具有PCT和CRP的抗原特性，其抗原表位比PCT和CRP全序列的重组抗原更加明显和突出，免疫小鼠后，小鼠更容易产生针对这些抗原表位的抗体，且抗体的特异性更好。这就为后续高亲和力、高特异性单克隆抗体的筛选奠定了基础。此外，采用本发明PCT-CRP重组多肽只需免疫一种抗原，就可以筛选出两种单抗，这就节省了成本和时间。

本发明方法是一种敏感性高、快速、简便、易于临床推广的、以同时检测儿童细菌性和病毒性脑膜炎患者血清中降钙素原(PCT)与C-反应蛋白(CRP)的TRFIA-ELISA定量检测试剂盒及其制备方法。

使用本发明试剂盒的整个检测时间不到2小时，可以对疑似脑膜炎患者进行早期快速筛查。为患病儿童得到针对性治疗提供了可靠依据，减轻了患儿的痛苦，缩短了疾病确诊的时间，为针对性治疗争取到了宝贵的时间，从而节约了由此产生的医疗费用和大量的人力、物力开支，也减少了家长的忧虑和恐慌。

附图说明

图1为双标记PCT/CRP-TRFIA标准曲线。

具体实施方式

本发明的主要研究思路如下：

一、PCT-CRP重组抗原的制备

选择PCT和CRP特异性序列，组合后得到PCT-CRP重组抗原，其核苷酸序列如下：

GCCCTGGAAAGCAGCCCGGCCGATCCGGCCACCCTGAGCGAAGATGAAGGCGGCGGCGGCGCCATTGGCGTGGGCGCCCCGGGCAAAAAACGCGATATGAGCAGCGATGGCGGCGGCGGCAAAGCCCCGCTGACCAAACCGCTGAAAGCCTTTACCGTGTGCCTGCATGGCGGCGGCGGCAACTTTGAAGGCAGCCAGAGCCTGGTGGGCGATATTGGCAACGTGAAC如核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过大量的前期研究和预实验，通过对PCT和CRP抗原相关的特异性片段筛选和优化组合，得到上述PCT-CRP重组抗原。

利用基因工程技术，制备表达上述PCT-CRP重组多肽，其氨基酸序列为：ALESSPADPATLSEDEGGGGAIGVGAPGKKRDMSSDGGGGKAPLTKPLKAFTVCLHGGGGNFEGSQSLVGDIGNVN，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。所述PCT-CRP重组多肽同时具有PCT和CRP的抗原特性，为后续顺利筛选出高亲和力和特异性抗体奠定了基础。

所述PCT-CRP重组多肽分子量更小，同时具有PCT和CRP的抗原特性，其抗原表位比PCT和CRP全序列的重组抗原更加明显和突出，免疫小鼠后，小鼠更容易产生针对这些抗原表位的抗体，且抗体的特异性更好。这就为后续高亲和力、高特异性单克隆抗体的筛选奠定了基础。此外，采用本发明PCT-CRP重组多肽只需免疫一种抗原，就可以筛选出两种单抗，这就节省了成本和时间。

二、抗PCT和CRP单克隆抗体的制备

用上述重组多肽作为免疫原，进行BALB/C小鼠免疫。通过细胞融合技术进行单克隆抗体制备，分别用天然的PCT和CRP蛋白进行特异性抗体的筛选，得到抗PCT抗体和抗CRP抗体。

三、抗PCT或CRP配对抗体的筛选及检测条件的优化

从上述制备的抗PCT或CRP单克隆抗体中，以双抗体夹心ELISA法为原理，以PCT或CRP天然蛋白为靶蛋白，通过交叉配对实验，获得能特异结合PCT或CRP靶蛋白的配对抗体数对。通过抗体配对实验(粗配对和精确配对实验)，筛选能在双抗夹心ELISA中应用的配对抗体。优化双抗夹心ELISA检测条件：确定包被抗体和检测抗体浓度，确定洗涤液、洗涤强度和反应条件等，从而获得与PCT和CRP蛋白高亲和力、高特异性配对抗体。

四、双标记TRFIA-ELISA方法的建立及评估

分别采用稀土离子Eu³⁺和Sm³⁺标记抗PCT和CRP的检测抗体，纯化标记后的抗体，优化最佳的包被抗体的包被比，建立双标记时间分辨荧光免疫法反应模式，通过PCT和CRP蛋白的参考标准品绘制标准曲线、进行精密度、灵敏度、特异性、稳定性分析等。对试剂盒进行各项性能评价并进行阴阳性样本的考核试验。大规模生产检测试剂盒。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

镧系元素离子试剂盒购自WALLAC公司。

增强液购自Perkin Elmer公司。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的PCT与CRP双标记时间分辨荧光免疫检测试剂盒

1.固相包被抗体的制备：用50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将PCT和CRP的抗体分别稀释成3μg/ml和4μg/ml，按照100μl/孔加入到96孔板中，4℃过夜，倾去包被液，按照200μl/孔加入封闭液，封闭过夜，倾去封闭液，洗涤后拍干，真空-20℃冷冻保存。

2.Eu³⁺和Sm³⁺标记抗体的制备：将0.5mg标记抗体加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中，8000r/min离心6min。再用标记缓冲液(50mmol/L，NaCO₃，pH>

3.Eu³⁺和Sm³⁺标记抗体的纯化：标记完成后用Sephadex>3+和Sm³⁺标记试剂盒说明书所提供的公式测定标记率和蛋白回收率。

4.参考标准品的配置：用含0.2％BSA，0.1％NaN₃，50mmol/L的Tris-HCl(pH>

5.分析缓冲液：50mmol/LpH 7.8Tris-HCl，每升含0.09％NaCl，0.02％BSA，0.05％Tween-20，0.05％NaN₃。

实施例2一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的PCT与CRP双标记时间分辨荧光免疫分析方法

本发明采用实施例1中所述的试剂盒定量检测PCT和CRP水平，检测的操作步骤为：向包被酶联板上加入25μl PCT/CRP参考标准品或待测血清，再加入200μl分析缓冲液，震荡温育1h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50～100倍稀释的Eu³⁺-PCT单克隆抗体与Sm³⁺-CRP单克隆抗体的混合物200μl/孔，震荡温育1h，洗涤液洗涤6次，最后加入增强液200μl/孔震荡5min后在时间分辨荧光检测仪上进行检测。

实施例3双标记PCT/CRP-TRFIA标准曲线

双标记PCT/CRP-TRFIA标准曲线见附图1。PCT(图1A)和CRP(图1B)标准曲线的相关系数分别为R²＝0.9992和R²＝0.999表明线性相关性良好。以零参考标准品作为标本重复测量20次，计算其荧光均值x及标准差s，x+2s所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出PCT的灵敏度为0.02ng/ml，CRP的检测灵敏度为0.03μg/ml。

实施例4特异性实验

选取几个类似的血清蛋白或者可能同时出现的蛋白，当作样品，用本发明试剂盒进行测定，结果见表1。

表1特异性实验

由表1可知：本发明试剂盒测定高浓度IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ蛋白时，测定浓度均远低于理论浓度，说明该方法的特异性较好。

实施例5精密度实验

采用本试剂盒对精确定量的高中低三个标准品浓度进行测定，各设置10个复孔。结果见表2。

表2精密度实验

由表2可知：本试剂盒的批内变异系数和批间变异系数均≤10％，符合试剂盒规定要求。

实施例6精确度实验

按照常规方法进行回收实验。结果见表3。

表3回收实验

由表3可知：PCT高中低三个浓度的回收率在100.46-101.90％之间，平均回收率为101.22％；CRP高中低三个浓度的回收率在99.46-100.28％之间，平均回收率为99.74％。

实施例7健全性实验

把高浓度的PCT和CRP阳性样品按照1：2～64倍比稀释后用本试剂盒测定，换算后的PCT和CRP浓度非常接近。用上述倍比稀释的阳性样品代替PCT和CRP蛋白参考标准品绘制标准曲线，其斜率与标准品的标准曲线斜率基本一致，表明PCT/CRP-TRFIA具有良好的健全性。

实施例8临床应用实验

取南方医科大学附属南方医院256例脑膜炎儿童阳性血清，其中172例确诊为细菌性脑膜炎，84例确诊为病毒性脑膜炎，和134例健康儿童阴性血清。

具体检测步骤：将PCT和CRP的包被抗体同时包被在酶联板上，向包被酶联板中加入25μl PCT/CRP参考标准品或待测血清，再加入200μl分析缓冲液，震荡温育1h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50～100倍稀释的Eu³⁺-PCT单克隆抗体与Sm³⁺-CRP单克隆抗体的混合物200μl/孔，震荡温育1h，洗涤液洗涤6次，最后加入增强液200μl/孔，震荡5min后在时间分辨荧光检测仪上进行检测。

结果示细菌性脑膜炎患者血清PCT水平为34.5±19.4ng/ml，CRP水平为64.5±26.5μg/ml；病毒性脑膜炎患者血清PCT水平为14.5±5.3ng/ml，CRP水平为24.7±10.2μg/ml；健康儿童血清PCT水平为0.4±0.14ng/ml，CRP水平为8.6±1.2μg/ml。上述检测结果均符合细菌性和病毒性脑膜炎患者与健康儿童血清中PCT/CRP的参考值，说明本试剂盒检测灵敏度和准确性较高，可以用于临床上细菌性和病毒性脑膜炎的早期诊断。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>王燕，张立成

<120>一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的PCT与CRP双标记时间分辨荧光免疫分

析方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>76

<212>PRT

<213>人工多肽

<400>1

Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser Glu Asp Glu

1 5 1015

Gly Gly Gly Gly Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp

202530

Met Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Lys Ala Pro Leu Thr Lys Pro Leu

354045

Lys Ala Phe Thr Val Cys Leu His Gly Gly Gly Gly Asn Phe Glu Gly

505560

Ser Gln Ser Leu Val Gly Asp Ile Gly Asn Val Asn

657075

<210>2

<211>228

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gccctggaaa gcagcccggc cgatccggcc accctgagcg aagatgaagg cggcggcggc60

gccattggcg tgggcgcccc gggcaaaaaa cgcgatatga gcagcgatgg cggcggcggc 120

aaagccccgc tgaccaaacc gctgaaagcc tttaccgtgt gcctgcatgg cggcggcggc 180

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