一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重RT‑PCR引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重RT-PCR引物、试剂盒和方法。

背景技术

猪蓝耳病又称为猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome, PRRS)，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus, PRRSV)。自1987年在美国发现该病以来，该病就迅速蔓延至全世界的养猪业中，给养猪业带来了巨大的经济损失。到目前为止，猪蓝耳病不仅给我国生猪业带来了灾难性的冲击，而且也爆发在我国周边的国家如越南、韩国等国，可见猪蓝耳病的流行范围越来越大。各种品种各种年龄阶段的猪均可感染蓝耳病，主要临床症状表现为母猪的繁殖障碍和一月龄以内仔猪的呼吸道症状。母猪的繁殖障碍主要是妊娠母猪早产、流产、产弱仔、死胎、木乃伊胎等，而其他猪尤其是仔猪的呼吸道症状主要是咳嗽、打喷嚏、呼吸困难等。OIE将其列为B类传染病，而我国将2006年以来爆发的高致病性蓝耳病列为“一类传染病”。PRRSV根据其抗原性和基因组成特征，国际上将其分为以LV为代表的欧洲型（Ⅰ型）和以ATCC-2332为代表的北美型（Ⅱ型）。

PRRSV属于套氏病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属的有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约15kb，含有包括ORF5a在内的10个开放阅读框，其中ORF5编码病毒的囊膜蛋白GP5（E蛋白），即便GP5蛋白是变异最大的蛋白，但它比较保守，是病毒复制必不可少的主要结构蛋白，免疫原性较好，能够比其他蛋白较早的诱导产生中和抗体，且中和抗体出现以后，抗血清主要识别GP5蛋白，GP5蛋白还具有诱导细胞凋亡的活性。北美型的ORF5基因全长为603bp，欧洲型的ORF5基因全长为606bp，通过对ORF5基因的扩增与分析，能够在一定程度上反映PRRSV的特征。加之，我国欧洲型蓝耳病的爆发呈现出愈来愈严重的趋势，给蓝耳病的防控带来更一步的困难，同时也提醒我们对蓝耳病的防控需要更新认识。当前，同一个养殖场同一头猪已然存在既感染欧洲型蓝耳病又感染北美型蓝耳病的情况，临床上基本不能区分，给预防与治疗带来巨大的挑战。因此，研发出同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列的方法和试剂盒，对掌握猪蓝耳病的分子流行病学、遗传进化、疫苗研发等方面具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对及反应体系优化，构建一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列的二重RT-PCR方法和试剂盒，实现北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列的快速扩增效果。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列的二重RT-PCR引物，其核苷酸序列如下所示：

NA-ORF5-F: 5^，-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGC-3^，（SEQ>

NA-ORF5-R:5^，->，（SEQ>

EU-ORF5-F: 5^，-ACCATYGCTTGTTTGTTCGCCAT-3^，（SEQ>

EU-ORF5-R: 5^，-CTTTCTCACAGCGTATGCTCG-3^，（SEQ>

一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列的二重RT-PCR试剂盒，该试剂盒包含上述引物。

一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列的二重RT-PCR方法，包括下列步骤：

1) 从样品中提取病毒核酸；

2) 以核酸为模板，用上述所述的引物对进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；

3) 将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，根据条带大小确定北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的ORF5全长基因序列。

优选的，步骤2）中RT-PCR扩增反应体系为：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×1 step Buffer 25 μL，引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F和EU-ORF5-R各1 μL，病毒核酸模板6 μL，余量水，总体积为50µL。

优选的，步骤2）中RT-PCR反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸60s，共计35个循环；72℃终延伸5min。

优选的，步骤3）中在凝胶成像系统下观察结果，如果仅含有900bp大小的片段，则判定在待检测样品中扩增出北美型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列；如果仅含有1036bp大小的片段，则判定在待检测样品中扩增出欧洲型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列；如果同时含有上述两种大小的片段，则判定在待检测样品中同时扩增出欧洲型和北美型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列。

一种快速区分北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重RT-PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：

NA-ORF5-F： 5^，-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGC-3^，（SEQ>

NA-ORF5-R： 5^，-GCTGAGTACACHCCCCAAAG-3^，（SEQ>

EU-ORF5-F： 5^，-ACCATYGCTTGTTTGTTCGCCAT-3^，（SEQ>

EU-ORF5-R： 5^，-CTTTCTCACAGCGTATGCTCG-3^，（SEQ>

一种快速区分北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重RT-PCR试剂盒，该试剂盒含有上述的引物。

一种快速区分北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重RT-PCR检测方法，包括下列步骤：

1)从待测样品中提取病毒核酸；

2)以核酸为模板，用上述引物对进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；

3)将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。

优选的，步骤2）中RT-PCR扩增反应体系为：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，2×1 step Buffer 25μL，引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F和EU-ORF5-R各1μL，病毒核酸模板6μL，余量水，总体积为50 µL。

优选的，步骤2）中RT-PCR反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸60s，共计35个循环；72℃终延伸5min。

优选的，步骤3）中在凝胶成像系统下观察结果，如果仅含有900bp的片段，则判定待检测样品中含有北美型猪蓝耳病病毒；如果仅含有1036bp的片段，则判定在待检测样品中含有欧洲型猪蓝耳病病毒；如果同时含有上述两种大小的片段，则判定在待检测样品中同时含有欧洲型和北美型猪蓝耳病病毒。

本发明的有益效果是：

本发明公开了一种可以用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒ORF5全长基因序列的二重RT-PCR方法和试剂盒，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点，对研究猪蓝耳病的分子流行病学、遗传进化、疫苗研发等方面具有重要的指导意义。此外，该方法中的变性和退火温度仅需要20s，且只需要一台PCR仪器即可同时进行扩增，也可作为北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的鉴别诊断方法，有助于猪蓝耳病病毒的快速分型。

本发明二重RT-PCR引物特异性强，敏感性高，而且覆盖面广。其中NA-ORF5-F和NA-ORF5-R引物对可以最大限度的覆盖更多的北美型猪蓝耳病病毒（包括北美型猪蓝耳病经典株、变异株及疫苗株）；EU-ORF5-F和EU-ORF5-R引物对可以最大限度的覆盖更多的欧洲型猪蓝耳病病毒（包括疫苗株及野毒株）。

本发明的引物还可以用于鉴别北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒，利用二重RT-PCR检测方法，只需要一台PCR仪器即可同时进行扩增，适用于养殖业快速鉴别北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒，同时也适用于科学研究不同分型的猪蓝耳病病毒以及后期的疫苗研发等研究。

附图说明

图1特异性试验结果；泳道M: DNA Marker 2000；泳道1：北美型+欧洲型PRRSV；泳道2：欧洲型PRRSV；泳道3：北美型PRRSV；泳道4：猪圆环病毒2型；泳道5：猪瘟病毒；泳道6：猪口蹄疫病毒；泳道7：猪伪狂犬病毒；泳道8：猪细小病毒；泳道9：猪库布病毒；泳道10：猪丁型冠状病毒；泳道11：阴性对照；

图2 二重RT-PCR敏感性结果；

图3 临床样品检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

材料和方法

北美型猪蓝耳病病毒活疫苗（TJM-F92株）购自新疆天康畜牧生物技术有限公司，欧洲型猪蓝耳病病毒由广东省农业科学院动物卫生研究所分离鉴定。猪圆环病毒2型病毒毒株、猪瘟病毒毒株、猪口蹄疫病毒毒株、猪伪狂犬病毒毒株、猪细小病毒毒株、猪库布病毒毒株、猪丁型冠状病毒毒株、欧洲型和北美型猪蓝耳病病毒阳性重组质粒由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存。

主要试剂

DNA/RNA提取试剂盒购自Axygen，PCR试剂购自北京天根公司和TaKaRa公司，DNAMarker 2000购自TaKaRa公司。

实施例1 引物设计

根据GenBank中北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的基因组序列，分别设计2对引物，其中NA-ORF5-F和NA-ORF5-R引物对可以最大限度的覆盖更多的北美型猪蓝耳病病毒（包括北美型猪蓝耳病经典株、变异株及疫苗株）；EU-ORF5-F和EU-ORF5-R引物对可以最大限度的覆盖更多的欧洲型猪蓝耳病病毒（包括疫苗株及野毒株）。其碱基序列如下所示。

NA-ORF5-F: 5^，-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGC-3^，（SEQ>

NA-ORF5-R:5^，->，（SEQ>

EU-ORF5-F: 5^，-ACCATYGCTTGTTTGTTCGCCAT-3^，（SEQ>

EU-ORF5-R: 5^，-CTTTCTCACAGCGTATGCTCG-3^，（SEQ>

实施例2 二重RT-PCR检测方法

1）RNA 的提取

按照Axygen公司的DNA/RNA提取试剂盒说明书进行病毒核酸的提取。

2）二重RT-PCR扩增反应

以临床分离并鉴定为北美型和欧洲型混合感染的阳性猪蓝耳病病毒核酸为二重RT-PCR的模板，建立二重RT-PCR方法。采用50μL RT-PCR反应体系：PrimeScript 1 stepEnzyme Mix 1 μL，2×1 step Buffer 25 μL，引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F和EU-ORF5-R各1 μL，病毒核酸模板6 μL，RNase Free ddH₂O>

RT-PCR反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸60s，共计35个循环；72℃终延伸5min。

结果观察：取50 μL RT- PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。

实施例3 特异性试验

按照实施例2的方法，利用二重RT-PCR方法对北美型和欧洲型混合感染的PRRSV及猪圆环病毒2型病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪库布病毒、猪丁型冠状病毒进行检测。

结果见图1。泳道M: DNA Marker 2000；泳道1：北美型+欧洲型PRRSV；泳道2：欧洲型PRRSV；泳道3：北美型PRRSV；泳道4：猪圆环病毒2型；泳道5：猪瘟病毒；泳道6：猪口蹄疫病毒；泳道7：猪伪狂犬病毒；泳道8：猪细小病毒；泳道9：猪库布病毒；泳道10：猪丁型冠状病毒；泳道11：阴性对照。

由图1可知：采用优化好的二重RT-PCR检测方法对北美型和欧洲型混合感染的PRRSV阳性核酸进行扩增，结果获得大小约为900bp及1036bp的片段，与测序结果900bp和1036bp的片段相吻合。而猪圆环病毒2型病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪库布病毒、猪丁型冠状病毒等核酸扩增后未呈现条带，表明该方法具有较好的特异性。

实施例4 敏感性试验

分别测定北美型和欧洲型PRRSV阳性重组质粒的模板浓度，然后进行倍比稀释，来测定该方法的敏感性。结果见图2，其中泳道M：DNA Marker 2000；泳道1-9：阳性质粒按照10⁰倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍倍比稀释结果；泳道10：阴性对照。

经检测，优化后的二重RT-PCR对北美型和欧洲型PRRSV的敏感性分别为23.71 pg/ml和9.17pg/ml。

实施例5 重复性扩增试验

对10份鉴定为北美型和欧洲型单一或混合感染的PRRSV阳性核酸样本进行扩增，结果显示均能准确的得出扩增结果，进一步经核酸测序，确定上述结果完全正确，准确率为100%。

实施例6 临床样品扩增试验

对用已经确定猪蓝耳病病毒类型的21份临床样本其中的11份进行ORF5全长基因扩增，结果如图3，其中泳道M: DNA Marker 2000， 泳道1、2、3、4为确认仅感染北美型PRRSV的样品，仅扩增出约为900bp的片段；泳道5、6、7、8为确认仅感染欧洲型PRRSV的样品，仅扩增出约为1036bp的片段；泳道9、10、11为确认既感染北美型又感染欧洲型PRRSV的样品，同时扩增出约为900bp和1036bp的片段；泳道12为阴性对照。与预期结果完全相符，因此，本发明设计得到的引物NA-ORF5-F、NA-ORF5-R、EU-ORF5-F、EU-ORF5-R可以很好的扩增临床样品中感染的猪蓝耳病病毒的ORF5全长基因序列，成功构建了能够快速扩增猪蓝耳病病毒北美型和欧洲型ORF5全长基因序列的双重RT-PCR方法。此外，通过扩增，也可以区分北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒，用于临床上病毒的鉴定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学，广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重RT-PCR引物、试剂盒

和方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttttagcct gtctttttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctgagtaca chccccaaag 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accatygctt gtttgttcgc cat 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttctcaca gcgtatgctc g 21