法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-07-12
授权
授权
2017-04-05
实质审查的生效 IPC(主分类):A61L27/50 申请日:20161130
实质审查的生效
2017-03-08
公开
公开
技术领域
本发明涉及无机材料表面改性技术，具体涉及一种在心血管植入材料表面构建Sema 4D/Heparin微环境的方法。
背景技术
心血管系统疾病是危害人类健康的重要疾病之一，人工植入血管支架或心脏瓣膜是治疗心血管疾病的有效方法；目前全世界每年大约超过200万冠心病病人需要进行经皮穿刺冠状动脉成形术，其中70％需要植入血管支架；我国2006年接受血管支架植入治疗的患者也逾10万次；我国心脏瓣膜病约占心脏病患者30％，每年也有十万以上危重病人必须施行人工心脏瓣膜置换术。
钛及其合金因具有较好的生物相容性被广泛应用在生物医药领域；血管支架植入体内直接与血液接触，需要具备较好的生物相容性；此外，支架植入后会引起组织各种免疫反应，正向免疫调控能促进支架快速内皮化，减少内膜增生或血管在此粥样硬化而引起再狭窄。
肝素(Heparin)在临床上常被用作抗凝剂，主要用于治疗血栓症、血栓静脉炎及血栓栓塞症；肝素结构中含有大量的硫酸根基团，是目前发现的负电性最强的生物分子；Sema4D是细胞膜表面锚定蛋白，广泛存在如血小板、T细胞等表面，其胞外蛋白水解产物Sema 4D具有促进内皮细胞迁移以及免疫调节的作用；Sema 4D的受体有plexin B1和CD72，前者主要存在于内皮细胞表面，而后者主要存在于免疫细胞中，Sema 4D功能主要通过作用相应受体而实现；Sema 4D的PI为8.5，在PH中性条件下呈现正电荷，与肝素通过静电作用结合；研究表明，肝素与各种生长因子的结合能够对生长因子起到保护作用，延缓生长因子的半衰期，并促进生长因子和其受体间的识别和结合；目前还没有发现将肝素和Sema 4D结合用于心血管材料的技术。
发明内容
本发明提供一种能够实现材料的诱导组织修复功能的在心血管植入材料表面构建Sema 4D/Heparin微环境的方法。
本发明采用的技术方案是：一种在心血管植入材料表面构建Sema 4D/Heparin微环境的方法，包括以下步骤：
A、材料样品表面用1-5mol/L的NaOH活化8-16h，清洗后浸入双蒸水80℃条件下12h，清洗后干燥；
B、步骤A中得到的样品置于2.5mg/ml的多聚赖氨酸PLL溶液中反应完全后清洗备用；
C、浓度为50-400ng/ml的Sema 4D和浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，反应完全后得到Heparin/Sema 4D复合物；
D、将步骤B中的样品浸入Heparin/Sema 4D复合物中，4℃条件下反应8-24h，清洗后即得到所需产物。
进一步的，所述材料样品包括钛及钛合金。
进一步的，所述步骤A中采用单蒸水对样品进行超声清洗。
进一步的，所述步骤B中采用磷酸盐缓冲液对样品进行清洗。
进一步的，所述步骤C中采用磷酸缓冲盐溶液对样品进行清洗。
进一步的，所述步骤B、C、D中样品制备完成后置于4℃条件下。
进一步的，所述步骤B中样品置于PLL溶液中，4℃条件下反应12h。
进一步的，所述步骤C中Sema 4D和Heparin，37℃条件下反应1-3h。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将Sema 4D和肝素结合共同固定在材料表面，能够延缓Sema 4D的半衰期，体内环境下能够对Sema 4D起到保护，避免被蛋白酶降解，同时促进Sema 4D与其相应受体间的识别与结合，保证Sema 4D功能的发挥；
(2)本发明构建Sema 4D/Heparin微环境能够较好的模拟机体血管创伤修复过程；
(3)本发明工艺简单易于操作，无需昂贵复杂的设备，并且样品表面生物分子均匀覆盖，适用于复杂的心血管植入器如血管支架、血栓滤器等具有抗凝/促进内皮迁移要求的表面。
附图说明
图1位为本发明流程示意图。
图2为T和Sema 4D/Heparin修饰后1小时后血小板粘附荧光和SEM图。
图3为Ti和Sema 4D/Heparin修饰后内皮细胞培养3天的荧光照片。
图4为Ti和Sema 4D/Heparin修饰后内皮细胞培养1天和3天细胞增殖的CCK结果。
图5为Ti和Sema 4D/Heparin修饰后12小时内皮细胞在材料表面迁移。
图6为Sema 4D/Heparin表面巨噬细胞培养后促炎症因子TNF-α的表达。
图7为Sema 4D/Heparin表面巨噬细胞培养后抗炎症因子IL-10的表达。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
如图1所示，一种在心血管植入材料表面构建Sema 4D/Heparin微环境的方法，包括以下步骤：
A、材料样品表面用1-5mol/L的NaOH活化8-16h，清洗后浸入双蒸水80℃条件下12h，清洗后干燥；
B、步骤A中得到的样品置于2.5mg/ml的多聚赖氨酸(PLL，MW 150-300KDa)溶液中反应完全后清洗备用；
C、浓度为50-400ng/ml的Sema 4D和浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，反应完全后得到Heparin/Sema 4D复合物；
D、将步骤B中的样品浸入Heparin/Sema 4D复合物中，4℃条件下反应8-24h，清洗后即得到所需产物。
进一步的，所述材料样品包括钛及钛合金。
进一步的，所述步骤A中采用单蒸水对样品进行超声清洗。
进一步的，所述步骤B中采用磷酸盐缓冲液对样品进行清洗。
进一步的，所述步骤C中采用磷酸缓冲盐溶液对样品进行清洗。
进一步的，所述步骤B、C、D中样品制备完成后置于4℃条件下。
进一步的，所述步骤B中样品置于PLL溶液中，4℃条件下反应12h。
进一步的，所述步骤C中Sema 4D和Heparin，37℃条件下反应1-3h。
本发明的反应过程与机理主要分为两部分。第一部分为Sema 4D/Heparin复合物的制备，Heparin和Sema 4D为两种PI不同的分子，在中性pH条件下，两者携带不同电荷，利用静电结合的方式形成特定的蛋白糖复合物；第二部分为Sema 4D/Heparin复合物在富氨基表面的组装，碱活化的材料表面具有极强的负电性，通过静电结合作用吸附大分子量的PLL，富氨基的PLL可通过其表面的氨基与肝素分子的硫酸根形成特定的离子结合作用，从而将Sema4D/Heparin复合物固定在材料表面；从而在材料表面构建出Sema 4D/Heparin微环境，以改善材料表面的生物相容性，诱导受损组织修复。
实施例一
一种在心血管植入材料表面构建Sema 4D/Heparin微环境的方法，包括以下步骤：
A、碱活化
纯钛抛光清洗后用1mol/L的NaOH活化12h，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应12h，单蒸水超声清洗后，干燥备用；
B、表面氨基化
步骤A中碱活化的样品用2.5mg/ml的多聚赖氨酸(PLL，MW 150-300KDa)4℃浸没处理12h，磷酸盐缓冲液清洗后待用；
C、Sema 4D/Heparin复合物的制备
将浓度为50ng/ml的Sema 4D与浓度为5mg/ml的Heparin等体积混合，37℃反应1h；
D、Sema 4D/Heparin固定
将步骤B中样品浸于步骤C中所制备的复合物中，4℃反应8h，PBS清洗后既得目标物。
实施例二
一种在心血管植入材料表面构建Sema 4D/Heparin微环境的方法，包括以下步骤：
A、碱活化
纯钛抛光清洗后用4mol/L的NaOH活化16h，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应12h，单蒸水超声清洗后，干燥备用；
B、表面氨基化
步骤A中碱活化的样品用2.5mg/ml的多聚赖氨酸(PLL，MW 150-300KDa)4℃浸没处理12h，磷酸盐缓冲液清洗后待用；
C、Sema 4D/Heparin复合物的制备
将浓度为200ng/ml的Sema 4D与浓度为8mg/ml的Heparin等体积混合，37℃反应3h；
D、Sema 4D/Heparin固定
将步骤B中样品浸于步骤C中所制备的复合物中，4℃反应12h，PBS清洗后既得目标物。
实施例三
一种在心血管植入材料表面构建Sema 4D/Heparin微环境的方法，包括以下步骤：
A、碱活化
纯钛抛光清洗后用2mol/L的NaOH活化10h，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应过12h，单蒸水超声清洗后，干燥备用；
B、表面氨基化
步骤A中碱活化的样品用2.5mg/ml的多聚赖氨酸(PLL，MW 150-300KDa)4℃浸没处理12h，磷酸盐缓冲液清洗后待用；
C、Sema 4D/Heparin复合物的制备
将浓度为400ng/ml的Sema 4D与浓度为10mg/ml的Heparin等体积混合，37℃反应2h；
D、Sema 4D/Heparin固定
将步骤B中样品浸于步骤C中所制备的复合物中，4℃反应24h，PBS清洗后既得目标物。
本发明创造性的将Sema 4D与肝素结合共同固定在材料表面，肝素的结合能够延缓Sema 4D的半衰期，体内环境下能够对Sema 4D起到保护，避免被蛋白酶降解，同时促进Sema 4D与其相应受体间的识别与结合，保证Sema 4D功能的发挥；构建的Sema 4D/Heparin微环境能够较好的模拟机体血管创伤修复过程；首先，Heparin作为抗凝剂能够抑制体内血栓形成，抑制血小板和纤维蛋白在材料表面的粘附；其次，Sema 4D为血小板和T细胞固有表达的蛋白，在T细胞和血小板激活状态下，胞外结构水解而产生Sema 4D，Sema 4D能够促进T细胞和抗原递呈细胞的相互作用，激活T细胞启动(T cell priming)，促进B细胞增殖和抗体产生，产生正向免疫调控作用，同时通过受体Plexin-B1促进内皮细胞粘附和增殖，对损伤血管部位进行修复；最初血小板激活过程可被肝素抑制，正向免疫调控能够加速血管组织修复；图2-图6以钛材料为例，其中Sema 4D/Hep表示Sema 4D/Heparin修饰的Ti材料；由图2可以看出，经Sema 4D/Heparin修饰的Ti材料血小板粘附数量明显减少；由图3可以看出Sema 4D/Heparin修饰的Ti材料表面内皮细胞培养三天后内皮细胞数量明显增加；由图4可以看出不同时间的细胞培养后，CCK直接定量检测细胞多少，Sema 4D/Heparin修饰的Ti材料细胞增值高于纯Ti材料；由图5可以看出Sema 4D/Heparin修饰的Ti材料表面内皮细胞迁移距离要明显高于纯Ti材料；由图6可以看出Sema 4D/Heparin修饰的Ti材料表面促炎症因子TNF-α的量要明显小于纯Ti材料；由图7可以看出Sema 4D/Heparin修饰的Ti材料表面抗炎症因子IL-10的量要明显大于纯Ti材料；由试验结果可以看出，Sema 4D/Heparin修饰的Ti材料表面具有抗凝、促内皮化的功能。
机译： Semaglutida在心血管疾病中。
机译： 肝素在心血管植入物的无机基质上的植入和固定步骤
机译： 聚核苷酸和聚核苷酸分离的植物细胞，转基因植物，DNA构建体，木材，木浆，由木材转化的植物的生产方法，木浆，修饰植物表型的方法，相关性基因在两个不同样品中的表达。在一个或多个基因在植物中的基因表达水平上具有植物的表型，并且基因表达与形成反应木材的倾向相关。一种或多种基因的表达，微结膜，检测样品中一种或多种基因的方法。样品和试剂盒中一种或多种基因编码的一种或多种核酸序列。
