一种核酸扩增技术及其在蚊媒病毒检测中的应用

技术领域

本发明涉及一种核酸扩增技术及其在蚊媒病毒检测中的应用。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是目前核酸检测最常用的一种检测技术，其检测结果准确、特异性高、重复性好。多重PCR是在PCR的基础上发展的一种可同时检测多个靶标基因的技术，一般多重PCR反应体系中至少有两对或两对以上的引物，可在一次反应中同时扩增出多个核酸片段，主要用于同时多个病原微生物的同时检测或鉴定。但由于多重PCR中有多条PCR引物，引物之间容易产生相互干扰，重数越多，内含的引物越多，互相之间产生干扰的几率越大，设计开发过程就越困难这成为多重PCR体系设计开发过程中的主要问题。

为了避免同一反应内进行多重引物设计引起的巨大的设计开发困难，利用微流控芯片的物理分腔技术将同一PCR管内的多重反应简化为多个微型腔体内的单重反应，这大大简化了多指标的引物扩增体系开发流程。微流控芯片技术，是一种通过物理分腔，实现高通量检测的技术，可在一次检测中同时完成多个指标的检测，很好的解决了多重PCR引物设计中的难题，微流控芯片无需设计多重引物，且其有更大的定制自由度、通量可根据需要进行调节。然而，虽然采用物理分腔的方式大大简化了多通量体系开发，但同时也产生了一个较为严重的副作用。即多腔引起了加入样本模板的分流，导致其检测灵敏度变差，例如，24孔微流控芯片，有限的样本模板分别进入了24个反应受体，其检测限下降了24倍，这对其在临床上的应用是一大考验。

蚊媒病毒在全世界分布广泛，是一种重要的传染病病原，一般通过蚊虫叮咬传播，传播速度快。近年来，世界各地不断有相关蚊媒病毒疫情爆发，主要包括寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒等。这些病毒感染，均会引起发热、关节痛等相似症状，很难从临床表现上判断是那种病毒感染。因此，蚊媒相关病毒的核酸检测至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸扩增技术及其在蚊媒病毒检测中的应用。

本发明首先提供了一种引物探针组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物探针组Ⅰ、引物探针组Ⅱ、引物探针组Ⅲ、引物探针组Ⅳ、引物探针组Ⅴ和引物探针组Ⅵ组成；

(a2)由所述引物探针组Ⅰ、所述引物探针组Ⅱ、所述引物探针组Ⅲ、所述引物探针组Ⅳ、所述引物探针组Ⅴ和所述引物探针组Ⅵ中的任意两个、任意三个、任意四个或任意五个组成；

(a3)所述引物探针组Ⅰ、所述引物探针组Ⅱ、所述引物探针组Ⅲ、所述引物探针组Ⅳ、所述引物探针组Ⅴ或所述引物探针组Ⅵ；

所述引物探针组Ⅰ由引物ZIKV-F、引物ZIKV-R和探针ZIKV-P组成；

所述引物ZIKV-F为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物ZIKV-R为如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述探针ZIKV-P的核苷酸序列为如下(b5)或(b6)；

(b5)如序列表的序列13所示的单链DNA分子；

(b6)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；

所述引物探针组Ⅱ由引物CHIKV-F、引物CHIKV-R和探针CHIKV-P组成；

所述引物CHIKV-F为如下(c1)或(c2)；

(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物CHIKV-R为如下(c3)或(c4)；

(c3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(c4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述探针CHIKV-P的核苷酸序列为如下(c5)或(c6)；

(c5)如序列表的序列14所示的单链DNA分子；

(c6)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；

所述引物探针组Ⅲ由引物DENV1-F、引物DENV1-R和探针DENV1-P组成；

所述引物DENV1-F为如下(d1)或(d2)；

(d1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(d2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物DENV1-R为如下(d3)或(d4)；

(d3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(d4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；

所述探针DENV1-P的核苷酸序列为如下(d5)或(d6)；

(d5)如序列表的序列15所示的单链DNA分子；

(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；

所述引物探针组Ⅳ由引物DENV2-F、引物DENV2-R和探针DENV2-P组成；

所述引物DENV2-F为如下(e1)或(e2)；

(e1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；

(e2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物DENV2-R为如下(e3)或(e4)；

(e3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；

(e4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；

所述探针DENV2-P的核苷酸序列为如下(e5)或(e6)；

(e5)如序列表的序列16所示的单链DNA分子；

(e6)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；

所述引物探针组Ⅴ由引物DENV3-F、引物DENV3-R和探针DENV3-P组成；

所述引物DENV3-F为如下(f1)或(f2)；

(f1)序列表的序列9所示的单链DNA分子；

(f2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；

所述引物DENV3-R为如下(f3)或(f4)；

(f3)序列表的序列10所示的单链DNA分子；

(f4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；

所述探针DENV3-P的核苷酸序列为如下(f5)或(f6)；

(f5)如序列表的序列17所示的单链DNA分子；

(f6)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；

所述引物探针组Ⅵ由引物DENV4-F、引物DENV4-R和探针DENV4-P组成；

所述引物DENV4-F为如下(g1)或(g2)；

(g1)序列表的序列11所示的单链DNA分子；

(g2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；

所述引物DENV4-R为如下(g3)或(g4)；

(g3)序列表的序列12所示的单链DNA分子；

(g4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；

所述探针DENV4-P的核苷酸序列为如下(g5)或(g6)；

(g5)如序列表的序列18所示的单链DNA分子；

(g6)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子。

以上任一所述探针中，5’末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

本发明还保护一种特异芯片，是将所述的引物探针组Ⅰ、引物探针组Ⅱ、引物探针组Ⅲ、引物探针组Ⅳ、引物探针组Ⅴ和引物探针组Ⅵ分别包埋于微流控芯片的不同反应腔中得到的；

所述特异芯片的功能为如下(h1)或(h2)：

(h1)用于鉴定寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒Ⅰ型、登革热病毒Ⅱ型、登革热病毒Ⅲ型或登革热病毒Ⅳ型；

(h2)用于检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或基孔肯雅病毒和/或登革热病毒Ⅰ型和/或登革热病毒Ⅱ型和/或登革热病毒Ⅲ型和/或登革热病毒Ⅳ型。

所述引物和探针具体借助封装试剂包埋于反应管。所述封装试剂由3-10质量份琼脂糖、1-5质量份皂苷和2-6质量份羟丙基纤维素组成。所述封装试剂具体由5质量份琼脂糖、3质量份皂苷和4质量份羟丙基纤维素钠组成。

包埋有引物和探针的微流控芯片的制备方法：①将封装试剂、引物、探针和无菌水混合，得到包埋液(包埋液中，封装试剂的浓度为0.1g/100ml，引物的浓度为0.4μM、探针的浓度为0.2μM)；②取微流控芯片，每个反应腔中加入1μl包埋液；③取步骤②得到的微流控芯片，置于洁净超净台内晾干，然后压片封装并冲压抽真空。

本发明还保护包括所述引物探针组合的试剂盒甲。

本发明还保护包括所述微流体芯片的试剂盒乙。

所述试剂盒乙还包括引物对组合；所述引物对组合由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ和引物对Ⅵ组成；所述引物对Ⅰ由引物ZIKV-F和引物ZIKV-R组成；所述引物对Ⅱ由引物CHIKV-F和引物CHIKV-R组成；所述引物对Ⅲ由引物DENV1-F和引物DENV1-R组成；所述引物对Ⅳ由引物DENV2-F和引物DENV2-R组成；所述引物对Ⅴ由引物DENV3-F和引物DENV3-R组成；所述引物对Ⅵ由引物DENV4-F和引物DENV4-R组成。

所述引物对组合具体以引物混合液的形式存在。引物混合物液由ZIKV-F、ZIKV-R、CHIKV-F、CHIKV-R、DENV1-F、DENV1-R、DENV2-F、DENV2-R、DENV3-F、DENV3-R、DENV4-F、DENV4-R和无菌水组成；引物混合物液中，ZIKV-F的浓度为0.2μM、ZIKV-R的浓度为0.2μM、CHIKV-F的浓度为0.15μM、CHIKV-R的浓度为0.15μM、DENV1-F的浓度为0.2μM、DENV1-R的浓度为0.2μM、DENV2-F的浓度为0.15μM、DENV2-R的浓度为0.15μM、DENV3-F的浓度为0.3μM、DENV3-R的浓度为0.3μM、DENV4-F的浓度为0.25μM、DENV4-R的浓度为0.25μM。

所述试剂盒乙还包括还包括反应混合液BQ和酶混合液EQ。

反应混合液BQ：溶剂为pH8.0、200mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度如下：DTT50mM、MgCl₂>

酶混合液EQ：溶剂为水；溶质及其浓度如下：AMV逆转录酶1U/μl、T7RNA聚合酶5U/μl、核糖核酸酶H 0.5U/μl、焦磷酸酶0.5U/μl、RNA酶抑制剂5U/μl、BSA 0.5μg/μl。

所述试剂盒还包括RT-RPA反应缓冲液、RT-RPA酶混合干粉和280mM醋酸镁水溶液。

所述试剂盒还包括RT-RPA反应缓冲液、装有RT-RPA酶混合干粉的反应管和280mM醋酸镁水溶液。

本发明还保护所述试剂盒甲的应用，为如下(h1)或(h2)：

(h1)用于鉴定寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒Ⅰ型、登革热病毒Ⅱ型、登革热病毒Ⅲ型或登革热病毒Ⅳ型；

(h2)用于检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或基孔肯雅病毒和/或登革热病毒Ⅰ型和/或登革热病毒Ⅱ型和/或登革热病毒Ⅲ型和/或登革热病毒Ⅳ型。

本发明还保护所述试剂盒乙的应用，为如下(h1)或(h2)：

(h1)用于鉴定寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒Ⅰ型、登革热病毒Ⅱ型、登革热病毒Ⅲ型或登革热病毒Ⅳ型；

(h2)用于检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或基孔肯雅病毒和/或登革热病毒Ⅰ型和/或登革热病毒Ⅱ型和/或登革热病毒Ⅲ型和/或登革热病毒Ⅳ型。

应用试剂盒乙鉴定待测病毒是否为寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒Ⅰ型、登革热病毒Ⅱ型、登革热病毒Ⅲ型或登革热病毒Ⅳ型的方法如下：

(1)取一个装有RT-RPA酶混合干粉的反应管，依次加入29.5μl RT-RPA反应缓冲液、5μl引物混合液、10μl待测溶液和3μl水并混合均匀，然后加入2.5μl 280mM醋酸镁水溶液以启动反应；反应条件：37℃10min；

(2)取完成步骤(1)的反应管，进行如下酶灭活处理:80℃2min；12℃，3min；

(3)取12μl反应混合液BQ、3μl酶混合液EQ和10μl步骤(2)的产物，混合均匀，注射入包埋有引物和探针的微流控芯片中，贴封口膜后迅速离心30s；

(4)完成步骤(3)后，将所述包埋有引物和探针的微流控芯片置于晶芯RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪中，41℃反应60min并同时完成实时荧光扫描。

根据各反应腔中样本的扩增曲线按照如下方法确定待测病毒为哪种病毒：如果包埋有引物探针组Ⅰ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为寨卡病毒；如果包埋有引物探针组Ⅱ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为基孔肯雅病毒；如果包埋有引物探针组Ⅲ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为登革热病毒Ⅰ型；如果包埋有引物探针组Ⅳ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为登革热病毒Ⅱ型；如果包埋有引物探针组Ⅴ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为登革热病毒Ⅲ型；如果包埋有引物探针组Ⅵ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为登革热病毒Ⅳ型。

应用试剂盒乙检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或基孔肯雅病毒和/或登革热病毒Ⅰ型和/或登革热病毒Ⅱ型和/或登革热病毒Ⅲ型和/或登革热病毒Ⅳ型的方法如下：

(1)取一个装有RT-RPA酶混合干粉的反应管，依次加入29.5μl RT-RPA反应缓冲液、5μl引物混合液、10μl待测溶液和3μl水并混合均匀，然后加入2.5μl 280mM醋酸镁水溶液以启动反应；反应条件：37℃10min；

(2)取完成步骤(1)的反应管，进行如下酶灭活处理:80℃2min；12℃，3min；

(3)取12μl反应混合液BQ、3μl酶混合液EQ和10μl步骤(2)的产物，混合均匀，注射入包埋有引物和探针的微流控芯片中，贴封口膜后迅速离心30s；

(4)完成步骤(3)后，将所述包埋有引物和探针的微流控芯片置于晶芯RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪中，41℃反应60min并同时完成实时荧光扫描。

根据各反应腔中样本的扩增曲线按照如下方法确定待测样本含有哪一种或哪几种病毒：如果包埋有引物探针组Ⅰ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有寨卡病毒；如果包埋有引物探针组Ⅱ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有基孔肯雅病毒；如果包埋有引物探针组Ⅲ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有登革热病毒Ⅰ型；如果包埋有引物探针组Ⅳ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有登革热病毒Ⅱ型；如果包埋有引物探针组Ⅴ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有登革热病毒Ⅲ型；如果包埋有引物探针组Ⅵ的反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有登革热病毒Ⅳ型。

以上任一所述登革热病毒Ⅰ型具体可为DEN-1夏威夷株。以上任一所述登革热病毒Ⅱ型具体可为DEN-2NGC株。以上任一所述登革热病毒Ⅲ型具体可为DEN-3H87株。以上任一所述登革热病毒Ⅳ型具体可为DEN-4H241株。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有n种靶标RNA序列的方法，依次包括如下步骤(反应原理示意图见图1)：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)进行逆转录重组酶聚合酶扩增；

(3)进行重组酶聚合酶扩增；n为自然数。

n为2以上的自然数。

所述重组酶聚合酶扩增在微流体芯片中进行，微流体芯片的每个反应腔用于检测一种靶标RNA序列。

本发明还保护一种用于检测待测样本中是否含有n种靶标RNA序列的试剂盒，包括进行逆转录重组酶聚合酶扩增的试剂和进行重组酶聚合酶扩增的试剂。

所述试剂盒还包括特异芯片；所述特异芯片是分别将用于检测每种靶标RNA的相应DNA的引物探针组包埋于微流体芯片的不同反应腔得到的；所述引物探针组由一对引物和一条探针组成。

逆转录重组酶聚合酶扩增的反应条件可为：37℃-42℃，5-30min。

逆转录重组酶聚合酶扩增的反应条件具体可为：37℃，10min。

逆转录重组酶聚合酶扩增可为采用针对不同靶标序列的多个引物对的多重扩增，也可为采用针对某一靶标序列的一个引物对的单重扩增。所述多重扩增具体可为采用针对6种靶标序列的6个引物对的六重扩增。

逆转录重组酶聚合酶扩增完成后，重组酶聚合酶扩增进行前，还包括如下灭活步骤：80℃，2min；12℃，3min。

重组酶聚合酶扩增的反应条件可为：41℃，30-60min。

逆转录重组酶聚合酶扩增中采用的引物与重组酶聚合酶扩增采用的引物，可以为相同的引物也可以为不同的引物。

逆转录重组酶聚合酶扩增的靶标序列中应含有重组酶聚合酶扩增的靶标序列。

为了实现的检测靶标序列，本发明将微流控芯片、重组酶聚合酶扩增和核酸序列依赖性扩增结合起来，提供了一种检测靶标核酸的方法，先通过逆转录重组酶聚合酶扩增(采用针对多重靶标片段的多重引物在同一体系中进行多重扩增)实现对RNA核酸模板的富集，然后在微流控芯片中进行核酸序列依赖性扩增(各个反应腔中分别针对各个靶标片段进行单重扩增)，可以有效的解决微流控芯片检测限降低的问题，同时具有耗时短、高通量和高检测限的优点(1个小时以内完成检测，例如30分钟之内；可同时实现对多个靶标序列的检测，例如同时实现对6种病毒的检测；检测限可达个位数拷贝，相对于现有技术提高了100倍)。

重组酶聚合酶扩增是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术，重组酶聚合酶扩增只需要一对简单的引物就能实现等温扩增，但是重组酶扩增的产物的量大多不高，很难被检测到。

核酸序列依赖性扩增是由一对引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩增的过程，最大的特点是在一个恒定的温度下反应，且反应速度极快，通常20分钟内就能完成一个扩增反应。该技术常用于RNA病毒的核酸检测，其检测特异性好、灵敏度高，将其用于微流控芯片检测技术，可实现RNA病毒的高通量、快速检测，但由于上述微流控芯片的限制，使其对微量核酸的检测受到了极大的限制。

进一步，本发明提供了一种用于检测蚊媒病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒，可以一次性同时完成对六种蚊媒病毒的检测，具有灵敏度高、特异性好、快速便捷等优点，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为反应原理示意图。

图2为实施例3中寨卡病毒标准品的结果。

图3为实施例3中基孔肯雅病毒标准品的结果。

图4为实施例3中登革热病毒Ⅰ型标准品的结果。

图5为实施例3中登革热病毒Ⅱ型标准品的结果。

图6为实施例3中登革热病毒Ⅲ型标准品的结果。

图7为实施例3中登革热病毒Ⅳ型标准品的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的水均为无RNase的水。BSA即牛血清白蛋白。

AMV逆转录酶：Promega公司，货号M5108。T7RNA聚合酶：Promega公司，货号P4074。核糖核酸酶H：NEB公司，货号M0297S。焦磷酸酶：Sigma公司，货号I5907。RNA酶抑制剂：Promega公司，货号N2611。

TABARTS01kit为商购试剂盒，见网址http://www.twistdx.co.uk/products/general_rd_kits/twistamp_basic_rt/。

琼脂糖：Baygene公司，货号162090。

人参皂苷：Sigma公司，货号：65839。

人参皂苷的化学结构式见式(Ⅰ)。

羟丙基纤维素(average M_w～100000)：Sigma公司，货号191884。

羟丙基纤维素的化学结构式见式(Ⅱ)。

实施例1、设计并制备各个引物和探针

用于检测寨卡病毒(Zika Virus)的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

ZIKV-F(序列表的序列1)：TGCATWGGAGTCAGCAA；

ZIKV-R(序列表的序列2)：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGATCTTACCTCVGCCA。

用于检测基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

CHIKV-F(序列表的序列3)：CCGACTCAACCATCCTGGAT；

CHIKV-R(序列表的序列4)：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGCARACGCAGTGGTACTTCCT。

用于检测登革热病毒Ⅰ型的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

DENV1-F(序列表的序列5)：CAAAAGGAAGTCGTGCAATA；

DENV1-R(序列表的序列6)：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACC。

用于检测登革热病毒Ⅱ型的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

DENV2-F(序列表的序列7)：CAGGTTATGGCACTGTCACGAT；

DENV2-R(序列表的序列8)：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCATCTGCAGCAACACCATCTC。

用于检测登革热病毒Ⅲ型的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

DENV3-F(序列表的序列9)：GGACTGGACACACGCACCCA；

DENV3-R(序列表的序列10)：

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCT。

用于检测登革热病毒Ⅳ型的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

DENV4-F(序列表的序列11)：TTGTCCTAATGATGCTGGTCG；

DENV4-R(序列表的序列12)：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATCCACCTGAGACTCCTTCCA。

用于检测寨卡病毒的探针为ZIKV-P，ZIKV-P的核苷酸序列如序列表的序列13所示，5’末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

ZIKV-P：5’-FAM-CGGACGTCAGGTGGGACYTGGGTTGATGTTGTCTTGGGCCTG-BHQ1-3'。

用于检测基孔肯雅病毒的探针为CHIKV-P，CHIKV-P的核苷酸序列如序列表的序列14所示，5’末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

CHIKV-P：5’-FAM-CGGACTCCGACATCATCCTCCTTGCTGGCGCCTG-BHQ1-3'。

用于检测登革热病毒Ⅰ型的探针为DENV1-P，DENV1-P的核苷酸序列如序列表的序列15所示，5’末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

DENV1-P：5’-FAM-CGGACTATGGTACATGTGGTTGGGAGCACGCGCCTG-BHQ1-3'。

用于检测登革热病毒Ⅱ型的探针为DENV2-P，DENV2-P的核苷酸序列如序列表的序列16所示，5’末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

DENV2-P：5’-FAM-CGGACCTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAAGCCTG-BHQ1-3'。

用于检测登革热病毒Ⅲ型的探针为DENV3-P，DENV3-P的核苷酸序列如序列表的序列17所示，5’末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

DENV3-P：5’-FAM-CGGACACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTGGCCTG-BHQ1-3'。

用于检测登革热病毒Ⅳ型的探针为DENV4-P，DENV4-P的核苷酸序列如序列表的序列18所示，5’末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

DENV4-P：5’-FAM-CGGACTTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCGGCCTG-BHQ1-3'。

用于检测内参基因(RNaseP基因)的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

RNaseP-F(序列19)：AGATTTGGACCTGCGAGCG；

RNaseP-R(序列20)：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAGCGGCTGTCTCCACAAGT。

用于检测内参基因(RNaseP基因)的探针：

RNaseP-P(序列21)：5’-FAM-CGGACTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGCCTG-BHQ1-3'。

以上各个引物和探针的核苷酸序列中，W代表A或T，V代表A或G或C，R代表G或A，Y代表C或T。

实施例2、蚊媒病毒检测试剂盒的制备

一、试剂盒的组成

试剂盒由如下组件组成(各组件独立包装)：

(1)引物混合物液由ZIKV-F、ZIKV-R、CHIKV-F、CHIKV-R、DENV1-F、DENV1-R、DENV2-F、DENV2-R、DENV3-F、DENV3-R、DENV4-F、DENV4-R和无菌水组成；引物混合物液中，ZIKV-F的浓度为0.2μM、ZIKV-R的浓度为0.2μM、CHIKV-F的浓度为0.15μM、CHIKV-R的浓度为0.15μM、DENV1-F的浓度为0.2μM、DENV1-R的浓度为0.2μM、DENV2-F的浓度为0.15μM、DENV2-R的浓度为0.15μM、DENV3-F的浓度为0.3μM、DENV3-R的浓度为0.3μM、DENV4-F的浓度为0.25μM、DENV4-R的浓度为0.25μM。

(2)RT-RPA反应缓冲液：TwistDx公司，TABARTS01kit的组件。

(3)装有RT-RPA酶混合干粉的反应管(用于50μl体系)：TwistDx公司，TABARTS01kit的组件。

(4)280mM醋酸镁水溶液。

(5)反应混合液BQ：溶剂为pH8.0、200mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度如下：DTT 50mM、MgCl₂>

(6)酶混合液EQ：溶剂为水；溶质及其浓度如下：AMV逆转录酶1U/μl、T7RNA聚合酶5U/μl、核糖核酸酶H 0.5U/μl、焦磷酸酶0.5U/μl、RNA酶抑制剂5U/μl、BSA 0.5μg/μl。

(7)包埋有引物和探针的微流控芯片。

采用1×24孔的微流控芯片(每个孔即一个反应腔，每个反应腔的容积为1.4μl，)，在1#反应腔包埋有0.4×10^-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmolCHIKV-P，在3#反应腔包埋有0.4×10^-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmolDENV4-R和0.2×10^-6μmol>-6μmol>-6μmol>-6μmol>

包埋有引物和探针的微流控芯片的制备方法：①将封装试剂、引物、探针和无菌水混合，得到包埋液(包埋液中，封装试剂的浓度为0.1g/100ml，引物的浓度为0.4μM、探针的浓度为0.2μM)；封装试剂由5质量份琼脂糖、3质量份皂苷和4质量份羟丙基纤维素钠组成；②取微流控芯片，每个反应腔中加入1μl包埋液；③取步骤②得到的微流控芯片，置于洁净超净台内晾干，然后压片封装并冲压抽真空。

引物混合物液、RT-RPA反应缓冲液、装有RT-RPA酶混合干粉的反应管和280mM醋酸镁水溶液用于逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)。

反应混合液BQ、酶混合液EQ和包埋有引物和探针的微流控芯片用于核酸序列依赖性扩增(NASBA)。

二、试剂盒的使用方法

待测溶液：取待测病毒或待测生物样本(例如血清)，提取核酸，得到的核酸溶液或其稀释液即为待测溶液。待测病毒为DNA病毒时，提取核酸指的是提取基因组DNA。待测病毒为RNA病毒时，提取核酸指的是提取总RNA。待测生物样本，提取核酸指的是提取总RNA。

1、逆转录重组酶聚合酶扩增(预扩增)

取一个装有RT-RPA酶混合干粉的反应管，依次加入29.5μl RT-RPA反应缓冲液、5μl引物混合液、10μl待测溶液和3μl水并混合均匀，然后加入2.5μl 280mM醋酸镁水溶液以启动反应。

反应条件：37℃10min；80℃，2min；12℃，3min。

80℃，2min处理的目的是为了灭活反应体系中的酶，以免对后续步骤有影响。

完成反应后，整个体系命名为预扩增产物。

2、核酸序列依赖性扩增

(1)取12μl反应混合液BQ、3μl酶混合液EQ和10μl预扩增产物，混合均匀，注射入包埋有引物和探针的微流控芯片中，贴封口膜后迅速离心30s。

(2)完成步骤(1)后，将所述包埋有引物和探针的微流控芯片置于晶芯RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪中，41℃反应60min并同时完成实时荧光扫描。

3、结果判断

反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线按照如下方法确定待测样本含有哪一种或哪几种病毒：如果1#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有寨卡病毒；如果2#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有基孔肯雅病毒；如果3#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有登革热病毒Ⅰ型；如果4#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有登革热病毒Ⅱ型；如果5#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有登革热病毒Ⅲ型；如果6#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测样本含有登革热病毒Ⅳ型。待测样本为生物样本，例如人或动物的血液或组织；RNaseP基因为管家基因，几乎在人或动物的所有组织中都高水平表达，因此7#反应腔中样本的扩增曲线应为S型阳性扩增曲线。8#反应腔中样本的扩增曲线应为阴性扩增曲线。

反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线按照如下方法确定待测病毒为哪种病毒：如果1#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为寨卡病毒；如果2#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为基孔肯雅病毒；如果3#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为登革热病毒Ⅰ型；如果4#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为登革热病毒Ⅱ型；如果5#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为登革热病毒Ⅲ型；如果6#反应腔中样本的扩增曲线为S型阳性扩增曲线，待测病毒为登革热病毒Ⅳ型。8#反应腔中样本的扩增曲线应为阴性扩增曲线。

实施例3、两种核酸扩增方法的对比

一、制备标准品

制备序列表的序列22所示的RNA1(单链RNA分子，寨卡病毒标准品)。将RNA1溶于无菌水，然后用无菌水进行梯度稀释，得到浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10copies/μl或1copies/μl的RNA1稀释液。

制备序列表的序列23所示的RNA2(单链RNA分子，基孔肯雅病毒标准品)。将RNA2溶于无菌水，然后用无菌水进行梯度稀释，得到浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10copies/μl或1copies/μl的RNA2稀释液。

制备序列表的序列24所示的RNA3(单链RNA分子，登革热病毒Ⅰ型标准品)。将RNA3溶于无菌水，然后用无菌水进行梯度稀释，得到浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10copies/μl或1copies/μl的RNA3稀释液。

制备序列表的序列25所示的RNA4(单链RNA分子，登革热病毒Ⅱ型标准品)。将RNA4溶于无菌水，然后用无菌水进行梯度稀释，得到浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10copies/μl或1copies/μl的RNA4稀释液。

制备序列表的序列26所示的RNA5(单链RNA分子，登革热病毒Ⅲ型标准品)。将RNA5溶于无菌水，然后用无菌水进行梯度稀释，得到浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10copies/μl或1copies/μl的RNA5稀释液。

制备序列表的序列27所示的RNA6(单链RNA分子，登革热病毒Ⅳ型标准品)。将RNA6溶于无菌水，然后用无菌水进行梯度稀释，得到浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10copies/μl或1copies/μl的RNA6稀释液。

二、两种扩增方法的对比

1、本发明的方法(RPA-NASBA法)

取步骤一制备的各个稀释液作为待测溶液，采用实施例2的步骤一制备的试剂盒按照实施例2的步骤二的方法描述进行检测。

2、现有方法(NASBA法)

取步骤一制备的各个稀释液，代替10μl预扩增产物，按照实施例2的步骤二的2的方法进行检测。

寨卡病毒标准品的结果见图2。图2中，R代表RPA-NASBA法，N代表NASBA法，1至5依次代表核酸浓度由高至低的稀释液。

基孔肯雅病毒标准品的结果见图3。图3中，R代表RPA-NASBA法，N代表NASBA法，1至5依次代表核酸浓度由高至低的稀释液。

登革热病毒Ⅰ型标准品的结果见图4。图4中，R代表RPA-NASBA法，N代表NASBA法，1至5依次代表核酸浓度由高至低的稀释液。

登革热病毒Ⅱ型标准品的结果见图5。图5中，R代表RPA-NASBA法，N代表NASBA法，1至5依次代表核酸浓度由高至低的稀释液。

登革热病毒Ⅲ型标准品的结果见图6。图6中，R代表RPA-NASBA法，N代表NASBA法，1至5依次代表核酸浓度由高至低的稀释液。

登革热病毒Ⅳ型标准品的结果见图7。图7中，R代表RPA-NASBA法，N代表NASBA法，1至5依次代表核酸浓度由高至低的稀释液。

结果表明，采用本发明的核酸扩增方法能极大的提高微流控芯片的检测限，对于这六种蚊媒病毒检出限均至少提高了两个浓度梯度。说明本发明极大了改善了微流控芯片的最低检出限，且缩短了检测时间。

实施例4、准确性和特异性

待测病毒分别如下：

寨卡病毒：张硕、李德新；寨卡病毒与寨卡病毒病；病毒学报，2016年1月，第32卷第1期，121-123。

基孔肯雅病毒：汪玉娇，张云波，段新亚，汪亚玲，赵桂萍；基孔肯雅病毒感染的诊断技术研究进展；《临床检验杂志》,2012(7):522-524。

登革热病毒Ⅰ型(DEN-1夏威夷株)：舒莉萍，左丽，李永念，郝牧，陈阿英；通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型；《贵阳医学院学报》,2004,29(4):283-286。

登革热病毒Ⅱ型(DEN-2NGC株)：舒莉萍，左丽，李永念，郝牧，陈阿英；通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型；《贵阳医学院学报》,2004,29(4):283-286。

登革热病毒Ⅲ型(DEN-3H87株)：舒莉萍，左丽，李永念，郝牧，陈阿英；通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型；《贵阳医学院学报》,2004,29(4):283-286。

登革热病毒Ⅳ型(DEN-4H241株)：舒莉萍，左丽，李永念，郝牧，陈阿英；通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型；《贵阳医学院学报》,2004,29(4):283-286。

乙型肝炎病毒：张娟，陈建宗，张金平，贾新，蒋蔚峰；黄芪甲甙体外抗乙型肝炎病毒的作用；第四军医大学,2008,28(24):2291-2293。

EB病毒(人类疱疹病毒4型)：吴凡，翟维维，葛柳莹，祁燕伟，高辉；245例人类免疫缺陷病毒感染者唾液中人类疱疹病毒1-4型的检测情况分析；《华西口腔医学杂志》,2012,30(5):514-517。

麻疹病毒L4株：赵大鹏，姚为民，吴晓娟，戚凤春，汪春义；麻疹病毒L4株基因组全序列的测定；全国生物制品学术会议,2007。

禽流感H5型病毒具体为H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Guangdong/S1322/2010(DK/GD/S1322/2010)：卢昆鹏，崔鹏飞，张芳，王晶，肖红波；H5亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定；《中国兽医科学》,2015(5):453-457。

禽流感H7型病毒具体为H7N2亚型禽流感病毒(Avian in fluenzavirus,AIV)A/Chicken/Hebei/1/2002：王传彬，田克恭，王宏伟，孙明，遇秀玲；我国H_7N_2亚型禽流感病毒CK/HB/1/02株分离鉴定；《中国病毒学》,2005,20(6):632-636。

人巨细胞病毒：王敏，毛建平；人巨细胞病毒检测技术；《中国生物工程杂志》,2007,27(2):103-107。

提取各个待测病毒的核酸(待测病毒为DNA病毒时，提取基因组DNA；待测病毒为RNA病毒时，提取总RNA)，作为待测溶液，然后采用实施例2的步骤一制备的试剂盒按照实施例2的步骤二的方法描述进行检测。

提取寨卡病毒的总RNA、基孔肯雅病毒的总RNA、登革热病毒Ⅰ型的总RNA、登革热病毒Ⅱ型的总RNA、登革热病毒Ⅲ型的总RNA、登革热病毒Ⅳ型的总RNA，然后混合，得到混合样本(其中各种病毒核酸的浓度均为100copies/μl)，将混合样本作为待测溶液，然后采用实施例2的步骤一制备的试剂盒按照实施例2的步骤二的方法描述进行检测。

每个待测重复检测3次，结果一致。

检测结果如表1所示。由结果可以看出，本发明的核酸检测方法，其准确度高，对非靶标基因无非特异扩增，其准确度能达到100％。

表1准确性和特异性检测结果

序列表

<120> 一种核酸扩增技术及其在蚊媒病毒检测中的应用

<130> GNCYX161842

<160> 27

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)

<223> w = a or t

<400> 1

tgcatwggag tcagcaa17

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)

<223> v = a or g or c

<400> 2

aattctaata cgactcacta tagggagata ggatcttacc tcvgcca 47

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgactcaac catcctggat 20

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)

<223> r = g or a

<400> 4

aattctaata cgactcacta tagggagagg caracgcagt ggtacttcct50

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaaaggaag tcgtgcaata 20

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aattctaata cgactcacta tagggagact gagtgaattc tctctactga acc53

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caggttatgg cactgtcacg at22

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aattctaata cgactcacta tagggagacc atctgcagca acaccatctc50

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggactggaca cacgcaccca 20

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aattctaata cgactcacta tagggagaca tgtctctacc ttctcgactt gtct 54

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgtcctaat gatgctggtc g 21

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aattctaata cgactcacta tagggagatc cacctgagac tccttcca48

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)

<223> y = c or t

<400> 13

cggacgtcag gtgggacytg ggttgatgtt gtcttgggcc tg42

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cggactccga catcatcctc cttgctggcg cctg 34

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cggactatgg tacatgtggt tgggagcacg cgcctg 36

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cggacctctc cgagaacagg cctcgacttc aagcctg37

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cggacacctg gatgtcggct gaaggagctt ggcctg 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cggacttcct actcctacgc atcgcattcc ggcctg 36

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agatttggac ctgcgagcg19

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aattctaata cgactcacta tagggagaga gcggctgtct ccacaagt48

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cggacttctg acctgaaggc tctgcgcggc ctg33

<210> 22

<211> 1506

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 22

aucaggugca uuggagucag caauagagac uucguggagg gcaugucagg ugggaccugg 60

guugauguug ucuuggaaca uggaggcugc guuaccguga uggcacagga caagccaaca 120

gucgacauag aguuggucac gacgacgguu aguaacaugg ccgagguaag auccuauugc 180

uacgaggcau cgauaucgga cauggcuucg gacagucguu gcccaacaca aggugaagcc 240

uaccuugaca agcaaucaga cacucaauau gucugcaaaa gaacauuagu ggacagaggu 300

uggggaaacg guuguggacu uuuuggcaaa gggagcuugg ugacaugugc caaguuuacg 360

uguucuaaga agaugaccgg gaagagcauu caaccggaaa aucuggagua ucggauaaug 420

cuaucagugc auggcuccca gcauagcggg augauuggau augaaacuga cgaagauaga 480

gcgaaagucg agguuacgcc uaauucacca agagcggaag caaccuuggg aggcuuugga 540

agcuuaggac uugacuguga accaaggaca ggccuugacu uuucagaucu guauuaccug 600

accaugaaca auaagcauug guuggugcac aaagaguggu uucaugacau cccauugccu 660

uggcaugcug gggcagacac cggaacucca cacuggaaca acaaagaggc auugguagaa 720

uucaaggaug cccacgccaa gaggcaaacc gucgucguuc uggggagcca ggaaggagcc 780

guucacacgg cucucgcugg agcucuagag gcugagaugg auggugcaaa gggaaggcug 840

uucucuggcc auuugaaaug ccgccuaaaa auggacaagc uuagauugaa gggcguguca 900

uauuccuugu gcacugcggc auucacauuc accaaggucc cagcugaaac acugcaugga 960

acagucacag uggaggugca guaugcaggg acagauggac ccugcaagau cccaguccag 1020

auggcggugg acaugcagac ccugacccca guuggaaggc ugauaaccgc caaccccgug 1080

auuacugaaa gcacugagaa cucaaagaug auguuggagc uugacccacc auuuggggau 1140

ucuuacauug ucauaggagu uggggacaag aaaaucaccc accacuggca uaggaguggu 1200

agcaccaucg gaaaggcauu ugaggccacu gugagaggcg ccaagagaau ggcaguccug 1260

ggggauacag ccugggacuu cggaucaguc gggggugugu ucaacucacu ggguaagggc 1320

auucaccaga uuuuuggagc agccuucaaa ucacuguuug gaggaauguc cugguucuca 1380

cagauccuca uaggcacgcu gcuagugugg uuagguuuga acacaaagaa uggaucuauc 1440

ucccucacau gcuuggcccu ggggggagug augaucuucc ucuccacggc uguuucugcu 1500

gacgug1506

<210> 23

<211> 1681

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 23

auggcugcgu gagacacacg uagccuacca guuucuuacu gcucuacucu gcaaagcaag 60

agauuaagaa cccaucaugg auccugugua cguggacaua gacgcugaca gcgccuuuuu 120

gaaggcccug caacgugcgu accccauguu ugagguggaa ccuaggcagg ucacaccgaa 180

ugaccaugcu aaugcuagag cguucucgca ucuagcuaua aaacuaauag agcaggaaau 240

ugaucccgac ucaaccaucc uggauauugg uagugcgcca gcaaggagga ugaugucgga 300

caggaaguac cacugcguuu gcccgaugcg cagugcagaa gaucccgaga gacucgccaa 360

uuaugcgaga aagcuagcau cugccgcagg aaaaguccug gacagaaaca ucucuggaaa 420

gaucggggac uuacaagcag uaauggccgu gccagacacg gagacgccaa cauucugcuu 480

acacacagau guaucaugua gacagagagc agacgucgcg auauaccaag acgucuaugc 540

uguacacgca cccacgucgc uauaccacca ggcgauuaaa gggguccgau uggcguacug 600

gguaggguuu gacacaaccc cguucaugua caaugccaug gcgggugccu accccucaua 660

cucgacaaau ugggcagaug agcagguacu gaaggcuaag aacauaggau uauguucaac 720

agaccugacg gaagguagac gaggcaaauu gucuauuaug agaggaaaaa agcuagaacc 780

gugcgaccgu gugcuguucu caguaggguc aacgcucuac ccggaaagcc guaagcuacu 840

uaagagcugg caccuaccau cgguguucca uuuaaagggc aagcucagcu ucacaugccg 900

cugugauaca gugguuucgu gcgaaggcua cgucguuaag agaauaacga ugagcccagg 960

ccuuuacgga aaaaccacag gguaugcggu aacccaccac gcagacggau uccugaugug 1020

caagaccacc gacacgguug acggcgaaag agugucauuc ucggugugca cguacgugcc 1080

ggcgaccauu ugugaucaaa ugaccggcau ccuugcuaca gaagucacgc cggaggaugc 1140

acagaagcug uugguggggc ugaaccagag aauagugguu aacggcagaa cgcaacggaa 1200

uacgaacacc augaaaaacu auaugauucc cguggucgcc caagccuuca guaagugggc 1260

aaaggagugc cggaaagaca uggaagauga aaaacuccug ggggucagag aaagaacacu 1320

gaccugcugc ugucuauggg cauuuaagaa gcagaaaaca cacacggucu acaagaggcc 1380

ugauacccag ucaauucaga agguucaggc cgaguuugac agcuuugugg uaccgagccu 1440

guggucgucc ggguugucaa ucccguugag gacuagaauc aaaugguugu uaagcaaggu 1500

gccaaaaacc gaccugaccc cauacagcgg ggacgcccaa gaagcccggg acgcagaaaa 1560

agaagcagag gaagaacgag aagcagaacu gacucuugaa gcccuaccac cccuucaggc 1620

agcacaggaa gauguucagg ucgaaaucga cguggaacag cuugaggaca gagcgggugc 1680

a 1681

<210> 24

<211> 1101

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 24

auggagguga cagccaggug guuauggggu uuucucucua gaaacaaaaa acccagaauc 60

ugcacaagag aggaguucac aagaaaaguc aggucaaacg cagcuauugg agcaguguuc 120

guugaugaaa aucaauggaa cucagcaaaa gaggcagugg aagaugaacg guucugggac 180

cuugugcaca gagagaggga gcuucauaaa caaggaaaau gugccacgug ugucuacaac 240

augaugggaa agagagagaa aaaauuagga gaguucggaa aggcaaaagg aagucgcgca 300

auaugguaca ugugguuggg agcgcgcuuu uuagaguuug aagcccuugg uuucaugaau 360

gaagaucacu gguucagcag agagaauuca cucaguggag uggaaggaga aggacuccac 420

aaacuuggau acauacucag agacauauca aagauuccag ggggaaauau guaugcagau 480

gacacagccg gaugggacac aagaauaaca gaggaugauc uucagaauga ggccaaaauc 540

acugacauca uggaaccuga acaugcccua uuggccacgu caaucuuuaa gcuaaccuac 600

caaaacaagg uaguaagggu gcagagacca gcgaaaaaug gaaccgugau ggaugucaua 660

uccagacgug accagagagg aaguggacag guuggaaccu auggcuuaaa caccuucacc 720

aacauggagg cccaacuaau aagacaaaug gagucugagg gaaucuuuuc acccagcgaa 780

uuggaaaccc caaaucuagc cgaaagaguc cucgacuggu ugaaaaaaca uggcaccgag 840

aggcugaaaa gaauggcaau caguggagau gacugugugg ugaaaccaau cgaugacaga 900

uuugcaacag ccuuaacagc uuugaaugac augggaaagg uaagaaaaga cauaccgcaa 960

ugggaaccuu caaaaggaug gaaugauugg caacaagugc cuuucuguuc acaccauuuc 1020

caccagcuga uuaugaagga ugggagggag auaguggugc caugccgcaa ccaagaugaa 1080

cuuguaggua gggccagagu a 1101

<210> 25

<211> 1085

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 25

gucaucagaa ggggccugga aacaugucca gagaauugaa acuuggaucu ugagacaucc 60

aggcuucacc augauggcag caauccuggc auacaccaua ggaacgacac auuuccaaag 120

agcccugauu uucaucuuac ugacagcugu cacuccuuca augacaaugc guugcauagg 180

aaugucaaau agagacuuug uggaaggggu uucaggagga agcuggguug acauagucuu 240

agaacaugga agcuguguga cgacgauggc aaaaaacaaa ccaacauugg auuuugaacu 300

gauaaaaaca gaagccaaac agccugccac ccuaaggaag uacuguauag aggcaaagcu 360

aaccaacaca acaacagaau cucgcugccc aacacaaggg gaacccagcc uaaaugaaga 420

gcaggacaaa agguucgucu gcaaacacuc caugguagac agaggauggg gaaauggaug 480

uggacuauuu ggaaagggag gcauugugac cugugcuaug uucagaugca aaaagaacau 540

ggaaggaaaa guugugcaac cagaaaacuu ggaauacacc auugugauaa caccucacuc 600

aggggaagag caugcagucg gaaaugacac aggaaaacau ggcaaggaaa ucaaaauaac 660

accacagagu uccaucacag aagcagaauu gacagguuau ggcacuguca caauggagug 720

cucuccaaga acgggccucg acuucaauga gaugguguug cugcagaugg aaaauaaagc 780

uuggcuggug cacaggcaau gguuccuaga ccugccguua ccaugguugc ccggagcgga 840

cacacaaggg ucaaauugga uacagaaaga gacauugguc acuuucaaaa auccccaugc 900

gaagaaacag gauguuguug uuuuaggauc ccaagaaggg gccaugcaca cagcacuuac 960

aggggccaca gaaauccaaa ugucaucagg aaacuuacuc uucacaggac aucucaagug 1020

caggcugaga auggacaagc uacagcucaa aggaauguca uacucuaugu gcacaggaaa 1080

guuua 1085

<210> 26

<211> 1208

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 26

aguuguuagu cuacguggac cgacaagaac aguuucgacu cggaagcuug cuuaacguag 60

ugcugacagu uuuuuauuag agagcagauc ucugaugaac aaccaacgga agaagacggg 120

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ggcgaagaga uucucaaaag gacugcugaa cggccaggga ccaaugaaau ugguuauggc 240

guucauagcu uuccucagau uucuagccau uccaccaaca gcaggagucu uggcuagaug 300

gggaaccuuc aagaagucgg gggccauuaa gguccugaaa ggcuucaaga aggagaucuc 360

aaacaugcug agcauaauca accaacggaa aaagacaucg cucugucuca ugaugauauu 420

gccagcagca cuugcuuucc acuugacuuc acgagaugga gagccgcgca ugauuguggg 480

gaagaaugaa agagguaaau cccuacuuuu uaagacagcc ucuggaauca acaugugcac 540

acucauagcc auggauuugg gagagaugug ugaugacacg gucacuuaca aaugccccca 600

cauuaccgaa guggaaccug aagacauuga cugcuggugc aaccuuacau caacaugggu 660

gacuuaugga acgugcaauc aagcuggaga gcauagacgc gacaagagau caguggcguu 720

agcuccccau gucggcaugg gacuggacac acgcacccaa accuggaugu cggcugaagg 780

agcuuggaga caagucgaga agguagagac augggcccuu aggcacccag gguucaccau 840

acuagcccua uuucucgccc auuacauagg cacuucccug acccagaagg ugguuauuuu 900

cauauuauua augcugguca ccccauccau gacaaugaga ugugugggag uaggaaacag 960

agauuuugug gaagggcuau caggagcuac guggguugac guggugcucg agcacggggg 1020

gugugugacu accauggcua agaacaagcc cacgcuggau auagagcuuc agaagaccga 1080

ggccacccaa cuggcgaccc uaaggaagcu augcauugag gggaaaauua ccaacauaac 1140

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cuacgugu1208

<210> 27

<211> 992

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 27

auggauguca ucggaagggg cuuggaagca ugcucagaga guagagagcu ggauacucag 60

aaacccagga uucgcgcucu uggcaggauu uauggcuuau augauugggc aaacaggaau 120

ccagcgaacu gucuucuuug uccuaaugau gcuggucgcc ccauccuacg gaaugcgaug 180

cguaggagua ggaaacagag acuuugugga aggagucuca gguggagcau gggucgaccu 240

ggugcuagaa cauggaggau gcgucacaac cauggcccag ggaaaaccaa ccuuggauuu 300

ugaacugacu aagacaacag ccaaggaagu ggcucuguua agaaccuauu gcauugaagc 360

cucaauauca aacauaacua cggcaacaag auguccaacg caaggagagc cuuaucugaa 420

agaggaacag gaccaacagu acauuugccg gagagaugug guagacagag gguggggcaa 480

uggcuguggc uuguuuggaa aaggaggagu ugugacaugu gcgaaguuuu cauguucggg 540

gaagauaaca ggcaauuugg uccaaauuga gaaccuugaa uacacagugg uuguaacagu 600

ccacaaugga gacacccaug caguaggaaa ugacacaucc aaucauggag uuacagccau 660

gauaacuccc aggucaccau cgguggaagu caaauugccg gacuauggag aacuaacacu 720

cgauugugaa cccaggucug gaauugacuu uaaugagaug auucugauga aaaugaaaaa 780

gaaaacaugg cucgugcaua agcaaugguu uuuggaucug ccucuuccau ggacagcagg 840

agcagacaca ucagagguuc acuggaauua caaagagaga auggugacau uuaagguucc 900

ucaugccaag agacaggaug ugacagugcu gggaucucag gaaggagcca ugcauucugc 960

ccucgcugga gccacagaag uggacuccgg ug 992