一种广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条

技术领域：

本发明属于烟草病毒检测领域，具体涉及一种广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条。

背景技术：

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是侵染烟草的主要病毒之一。它引发的病毒病每年导致烟草产业巨大的经济损失。快速、准确地定性检测CMV是生产上防控病害减少损失的重要手段之一。

在科学研究中，植物病毒的检测方法主要有生物学检测法(症状类型辨别、鉴别寄主等)、电镜技术、血清学检测法(酶联免疫吸附反应(Enzyme linked immunosorbentassay，ELIS A)等)和分子生物学检测法(包括PCR技术、核酸探针技术等)等。分离病毒照电镜虽然是诊断病毒的有效手段，其特异性强，但非常费时费力，需要专业的技术人员，不适合推广使用；血清学检测方法比较费时、费力，免疫荧光、ELLSA等方法虽然具有微量、特异、快速、准确的优点，但需要比较完备的试验仪器和经验丰富的技术人员来操作和判断结果，检测一批样品整个流程需要4～8小时，对于基层工作场所很难做到；PCR及核酸探针的诊断更需要有特殊的仪器和药品，技术含量很高，一般只适于实验室诊断或研究应用，很难在基层推广。

1971年胶体金作为标记物开始用于免疫组织化学。Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法观察沙门氏菌。许多学者进一步证实胶体金能稳定迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变。它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核 酸等生物大分子的精确定位，也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位。

胶体金溶液是指分散相粒子直径在l～150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。免疫胶体金层析技术(Gold immunochromatography assay,GICA)作为一种新的免疫学检测方法，是20世纪80年代在免疫胶体金标记技术基础上建立起来的一种新型独特的诊断技术。这项技术将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单(多)克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合在一起，具有简单、快速、准确、无污染、操作简单和无需特殊设备等优点，在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。

20世纪90年代初到中期,胶体金标记免疫层析诊断技术开始进入商业化应用。利用这种技术开发的胶体金快速检测试纸条具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，可在现场(临床)对目标病原进行初筛，节省大量的人力、物力。在医学领域，这种技术除用于激素、传染病病原的抗原和抗体、细菌、寄生虫的检测外，还发展到了对毒品等小分子物质的检测。检测的标本类型也涵盖了血清、血浆、全血、尿、粪便及唾液等，显示出了广阔的前景和巨大的应用价值。

胶体金试纸条在国内主要应用于医学领域和畜牧兽医领域。在农牧领域，较少有成熟的产品，更多的出现在相关的科研项目中。孙艳等(2011)应用胶体金技术进行了黄瓜细菌性角斑病(Pseudomona.s.syringae pv.Lachrymans)的快速检测研究。国内涉及到烟草病毒病检测的商用胶体金试纸条非常少。国外的商品化试纸条非常昂贵，价格在50～60元人民币/张，不适于生产上大批烟苗的检测使用。

因此，迫切需要建立一种简单、快速、灵敏、廉价并且适合于基层应用的病毒诊断方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速、准确、灵敏、定性检测广东烟区黄瓜花叶病毒的广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条。

本发明的广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条，试纸条由样品垫、结合垫(胶体金垫)、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸收垫和背衬组成，所述样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，结合垫和硝酸纤维素膜的端部重叠，所述吸收垫结合在硝酸纤维素膜的另一端，其特征在于，在所述的结合垫上包被有胶体金标记的CMV特异抗体，所述的硝酸纤维膜上设置有检测线和控制线，且检测线位于结合垫和控制线之间的位置，检测线上包被CP-C-GD蛋白作为CMV病毒的抗原，控制线上包被有胶体金标记的抗CMV特异抗体的二抗；

所述的CMV特异抗体是以CP-C-GD蛋白作为抗原免疫小鼠，进行融合试验，得到阳性杂交瘤细胞株，将阳性杂交瘤细胞株进行培养，纯化得到抗CP-C-GD蛋白的单克隆抗体，即为CMV特异抗体，所述的CP-C-GD蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的CMV特异抗体是由保藏号为：CGMCC No.12679的BAL B/c小鼠杂交瘤细胞株BAL B/c-15-27分泌产生。

本发明的第二个目的是提供一种能产生CMV特异抗体的BAL B/c小鼠杂交瘤细胞株B AL B/c-15-27，其保藏编号为：CGMCC No.12679。

本发明利用竞争抑制法，成功构建了广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条。其基本原理如下：

胶体金标记的CMV特异抗体吸附在结合垫(即胶体金垫)上，CMV病毒的特异抗原(CP-C-GD蛋白)以条带状固定在硝酸纤维膜的检测线(T线)处上，胶体金标记的二抗固定在硝酸纤维膜的控制线(C线)处。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记特异试剂后相互反应，再移动至固定的抗原区域时，待检物与金标记抗体的结合物又与之发生特异性结合。

当待测样本含有CMV病毒时，它与溶解在样本垫上的胶体金标记的特异抗体相互反应；再移动至固定的抗原区域时，已经没有足够的金标抗体与固定的抗原反应，T线处没有红棕色线条出现，实验结果为阳性。游离的金标抗体或者金标抗体复合物流经C处时，与该处的二抗结合出现红棕色质控带。

当待测样本没有CMV病毒时，它与溶解在结合垫上的胶体金标记抗体不发生反应；再移动至固定的抗原区域时，有足够的金标抗体与固定的抗原反应，而被截留聚集在T线上，可通过肉眼观察到红棕色条带，实验结果为阴性。

本发明具有以下有益效果：

本发明的广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条，特异性强，其采用的关键抗体是专门针对广东烟区CMV的流行株系构建得到，专门针对广东烟区的CMV。由于使用的特异抗体是BAL B/c小鼠杂交瘤细胞株BAL B/c-15-27分泌的单克隆抗体，其灵敏度非常高，可以达到1g/100ml。

本发明的广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条体积小、携带方便，不需要仪器设备，操作简单。可现场检测，在3-10min出结果；结果可由肉眼根据T线颜色的深浅进行判断。这种方法非常适合对大批量样品进行现场初筛，在实际生产中很有应用价值。

本发明的BAL B/c小鼠杂交瘤细胞株BAL B/c-15-27，于2016年06月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.12679。

附图说明：

图1是广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条的结构示意图；

其中1、样品垫；2、结合垫；3、硝酸纤维素膜；4、吸收垫；5、检测线T线；6、控制线C；7、支撑薄片。

图2是试纸条测试结果，左侧为阴性样品，右侧为阳性样品。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：CP-C-GD蛋白的制备(即特异抗原)

1、CP-C-GD蛋白的编码基因(可以人工合成)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在其两端加酶切位点EcoR I和Xho I，序列如下所示：

5’-GAATTCATGGATAAAAGTGAATCAACGTCAGCAGGTCGTAACCGCCGCCGCCGTCCGCGTCGTGGTAGCCGTAGTGCCCCGTCATCAGCCGATGCCAACTTTCGTGTTCTGAGTCAGCAACTGTCCCGCCTGAACAAAACCCTGGCAGCAGGTCGTCCGACCATTAATCATCCGACGTTTGTGGGCTCAGAACGTTGCCGCCCGGGTTATACCTTCACGTCGATTACCCTGAAACCGCCGAAAATCGATCGTGGCTCATATTACGGTAAACGCCTGCTGCTGCCGGATAGCGTTACGGAATTTGACAAAAAACTGGTCTCTCGTATTCAGATCCGCGTGAATCCGCTGCCGAAATTCGATTCCACCGTGTGGGTTACGGTCCGCAAAGTTCCGGCGAGCTCTGATCTGTCAGTCGCAGCTATTTCGGCAATGTTCGCTGACGGCGCGAGTCCGGTGCTGGTTTATCAGTACGC>CTCGAG-3’。

将含有酶切位点EcoR I和Xho I的CP-C-GD蛋白的编码基因片段用EcoR I和Xho I双酶切，得到CP-C-GD酶切片段；

将pUC57载体pET30a-GST用EcoR I和Xho I进行双酶切，得到载体酶切片段，酶切体系为：43μl载体(pET30a-GST)质粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl 10×Buffer，37℃过夜反应，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体酶切片段。

2、连接转化

(1)连接：

1μl载体(pET 30a-GST)，3μl片段，1μl连接酶(BPI)，5μl 2×Rapid Buffer，混匀，室温反应30min。

(2)转化：

1)取出－80℃保存的100μl感受态细胞(BL21)，放在冰上缓慢解冻。

2)将感受态细胞加入1μl重组质粒的管中，混匀，冰上放置30min。

3)42℃热激90s。

4)冰浴2min后，加入800μl无抗性的LB培养基。

5)37℃培养45min。

6)5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100-150μl，重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板。

7)晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。

3、测序验证

测序验证正确，测序峰图见附件。

4、小量表达检测

(1)从转化的平板挑单克隆到1.5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养。

(2)培养至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)诱导，37℃，200rpm培养2h。

(3)取1ml诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50-100μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的2×loadingbuffer，100℃煮5min，电泳检测，结果如图1所示。结果：1号克隆有正确表达条带。

5、大量表达

(1)挑选验证正确的菌株，接5-10μl活化的菌液到5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养。

(2)将培养的菌液转接到500mL LB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)诱导4h。

(3)大量收菌：用400ml大离心筒，6000rpm，离心5min。弃上清。

(4)超声破菌：沉淀用25ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声。

(5)电泳确定表达形式：取100μl超声(500W,90次，每次3s，间隔6s)后的菌悬液，12000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，加入50μl 2×loading buffer，100℃煮5min，电泳，电泳图如图2所示。结果：蛋白有表达，主要表达在沉淀中。

6、蛋白质纯化(洗包涵体)

(1)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min。

(2)12000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存。

(3)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min。

(4)12000rpm，离心10min，弃上清。

(5)重复(3)、(4)一次。

(6)先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白。

(7)12000rpm，离心10min，收集上清，取50μl电泳。结果：纯化得到目的蛋白(C P-C-GD蛋白)。

实施例2：BAL B/c小鼠杂交瘤细胞株BAL B/c-15-27的制备

1、免疫

2015-07-22用“CMV”，按60ug蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，编号为：1、2，3，4。

2015-08-05皮下第一次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。

2015-08-19皮下第二次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。

2015-09-02皮下第三次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。

2015-09-10眼眶取血，测血清效价。

2015-09-28用免疫原50ug，腹腔冲击#4小鼠。

2、免疫效价检测：

步骤：用“CMV”，2ug/ml，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。

结果：选取冲击#4小鼠做细胞融合实验。

加效价：

2.2细胞融合实验

2015-10-01取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。

2.2.1实验器材

灭菌的手术器械：三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯、一个平皿。湿盒，2个500ml烧杯，2个50ml离心管，3个15ml离心管。

2.2.2实验试剂

IMDM培养基、IMDM完全培养基(含15％血清)、2.2％甲基纤维素：厂家：SIGMA；货号：M0262-100G、新生牛血清：10ml、PEG1500：厂家：Roche；货号：78364、HAT：厂家：Sigma；货号：H0262-10VL、HT：厂家：Sigma；货号：H0137-10VL

2.2.3融合实验步骤

1)将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。

2)小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。

3)在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。

4)用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中备用。

5)将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。

6)将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM。离心1000rad/min，5min。

7)倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。

2.3挑克隆

2015-10-13挑10板http://192.168.5.97:801/index.jsp？module＝business&way＝normal×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100ul/孔)。

2.4单克隆细胞1筛

2015-10-16用“CMV”包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到48http://192.168.5.97:801/login.loginbusiness.do株阳性杂交瘤细胞株。

2.4.1实验试剂

包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6、PBS缓冲液pH7.4、封闭液：2％牛奶inPBS、洗液：PBS－T(0.05％吐温，PBS)、显色液:1％A液+10％B液(A液：1％TMB in DMSO；B液：0.1％H₂O₂in柠檬酸缓冲液)、终止液：2M硫酸、二抗：山羊抗小鼠IgG/HRP。

2.4.2实验步骤

1)用包被液稀释“CMV”，终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤3次。

2)2％牛奶封闭液封闭，200ul/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3次。

3)加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 1000倍稀释)，均为100ul/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。

4)加入PBS稀释20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。

5)显色，显色液100ul/孔，显色时间为5min左右。

6)每孔加入50ul终止液终止。

7)双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据

2.4.3实验数据

2.5单克隆细胞2筛

2015-10-19http://192.168.5.97:801/index.jsp？module＝business&way＝normal，将48http://192.168.5.97:801/index.jsp？module＝admin&way＝normal株阳性的细胞株，用“CMV”及标签蛋白再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到24http://192.168.5.97:801/login.loginbusiness.do株阳性杂交瘤细胞株。

实验数据

2.6单克隆细胞亚类鉴定

2015-10-20将筛选出来的24http://192.168.5.97:801/index.jsp？module＝business&way＝normal株阳性细胞株进行亚类鉴定，http://192.168.5.97:801/login.loginadmin.do最后得到13株Ig>

2.6.1实验试剂

包被抗体：(Southern Biotech)

封闭液：2％BSA+3％蔗糖in PBS；

显色液:0.2ml A液+10ul 30％H₂O₂in>

(A液：15mg/ml ABTS in H₂O；B液：柠檬酸缓冲液,pH4.0)

各型亚类二抗:(Southern Biotech)

2.6.2实验步骤

1)用100mM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5ug/ml,每孔加0.1ml,4℃，过夜。

2)PBS-T洗2次,每孔加入200ul封闭液，37℃孵育2h。

3)PBS-T洗3次；每孔加入100ul杂交瘤上清，37℃孵育1h。

4)PBS-T洗3次；用封闭液1：10000(κ,λ)或1：20000(其它的)稀释的HRP标记的抗体0.1ml每孔，分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。

5)PBS-T洗3次；每孔加50ul底物溶液，10-20min内于双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据。

6)实验数据

3.单克隆细胞株相关信息

筛选编号为27的细胞株进行保藏，其命名为BAL B/c小鼠杂交瘤细胞株BAL B/c-15-27，于2016年06月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.12679。

实施例3：CMV特异抗体的制备

1、培养BAL B/c小鼠杂交瘤细胞株BAL B/c-15-27；

2、Protein A过柱纯化得到CMV特异抗体。

实施例4：广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条的制备和使用

1、实验材料：

胶体金颗粒：用枸橼酸钠还原法制备(30nm)；

胶体金标记的CMV特异抗体

标记方法：将胶体金溶胶调至pH 8.5，在11支试管中各加入1mL胶体金，分别加人20、18、16、14、12、10、8、6、4、2和0ug/mL的CMV特异性抗体，反应10min后，各管加人10％NaCL溶液100uL，静置2h，观察各管颜色变化，然后12,000rpm离心10min， 去掉上清，加人含1％OVA的PBS溶解沉淀，观察溶胶凝聚状况。

以沉淀完全溶解呈均匀透明的酒红色溶液管的最低抗体浓度加20％为最佳标记抗体浓度。结果抗体的最佳标记量是8ug/mL。

二抗：Goat-anti-Rabbit IgG(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，其货号为：IH-0011)；

JY-D101 DB-6底板(购自上海金标生物科技有限公司公司，其货号为：plasticbacking card)

JY-X115 H5072吸水纸(购自上海金标生物科技有限公司公司，其货号为：Absorbent Paper)

JY-BX101金标垫(购自上海金标生物科技有限公司公司，其货号为：聚酯纤维膜)

JY-JZ112 fusion 3样品垫(购自上海金标生物科技有限公司公司，其货号为：玻璃纤维膜)

JY-C111 A-11塑料卡(购自上海金标生物科技有限公司公司，其货号为：plasticcassette)

2、实验仪器：

JY-EQ03连续式划膜仪JY-EQ02喷金机

JY-EQ01斩切式切刀-I JY-EQ05压壳机。

3、检测试纸条的组装：

检测试纸条的组装环境是在室温25℃、相对湿度低于40％条件下进行组装。

如图1所示，本实施例的广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条由样品垫1(JY-JZ112 fusion 3样品垫)、结合垫2(JY-BX101金标垫)、硝酸纤维素膜3、吸收垫4(JY-X115 H5072吸水纸)依次粘附在不吸水的支撑薄片7(JY-D101 DB-6底板)上，在所述的结合垫上吸附有胶体金标记的CMV特异抗体，并且还有CP-C-GD蛋白作为CMV病毒的特异抗原以条带状固定在硝酸纤维膜的检测线T线5处，胶体金标记的抗CMV特异抗体的二抗(Goat-anti-Rabbit IgG)固定在硝酸纤维膜的控制线C 6处。

取感染了CMV的烟草及健康烟草的叶片作为实验材料，各0.2g，加PBS缓冲液(pH8.0，0.01M)，进行研磨，不要用自来水稀释叶子。各取50uL研磨液加到制备好的试纸条样品垫上，五分钟判读结果。感染了CMV的烟草样本的试纸条T处没有红棕色条带，实验结果为阳性(图2)。健康烟草样本的试纸条T处有条带，实验结果为阴性，检测效果良好(图2)。

实施例5：灵敏度测试

将0.1g烟草病样用0.01mol/L的PBS稀释6个系列浓度，与样品处理液等体积混合后，终浓度为10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4mg/mL，以PBS与样品处理液等体积混合为阴性对照，测定试纸条灵敏度。

结果显示，本发明的广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条的灵敏度为10^-2mg/mL。