一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用

技术领域

本发明涉及一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用，其属于精细化工领域。

背景技术

人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）是人体内一种依靠17个二硫键将585个氨基酸键连而成的环状蛋白，分子量为66 kDa。HSA仅在肝脏中合成，正常人HSA的合成速率为12-25 g/d。HSA合成后很快分泌到血浆和组织液中，是血浆中含量最丰富的蛋白，它在健康人血浆中的含量为35-50 g/L，约占血浆总蛋白量的一半以上。人血浆中HSA含量受营养和健康状态的影响，是血常规检查重要指标之一。

HSA参与人体内多种生理、病理过程，包括：维持血浆胶体渗透压，作为内源性和外源性化合物（胆红素、脂肪酸、维生素、和药物分子等）的转运载体，此外，HSA还具有维持微血管的通透性、维持血浆酸碱平衡等作用。体液中的HSA含量与多种疾病的发生、发展有关，如血浆和尿液中HSA的含量可以作为诊断和预测包括肝硬化、慢性肝炎、风湿性关节炎、肾脏损伤、糖尿病、高血压等多种疾病的生物标志物。

目前，HSA定量方法包括：染料结合法、体积排阻色谱法、免疫化学法以及蛋白质质谱法。染料结合法和体积排阻色谱法虽然操作起来较为简便、成本较低，但是特异性较差，容易受生物样品中其他物质的干扰。而免疫化学和基于质谱的定量方法虽然特异性较好，但操作复杂耗时、成本较高，需要特定的试剂和仪器。当前临床使用的探针分子，包括溴甲酚绿、AB580等都是基于HSA与探针分子的结合特征设计的，而探针与HSA结合在一定程度上受到其他能与HSA结合的物质的干扰。

本发明提供了一类1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮类化合物的酯类衍生物及其作为HSA荧光探针底物的应用，其经HSA水解后可生成具有荧光发射性质的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性评价快速高效等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一类检测人血清白蛋白(HSA)的高特异性荧光探针及其应用，该底物原型和水解产物的荧光荧光属性具有明显差异。利用该探针反应可对多种生物体系中HSA的分布和功能进行定量评价。

本发明的目的在于提供一类检测人血清白蛋白(HSA)的高特异性荧光探针及其应用，该底物的酯键在人源血液、尿液或细胞中可被HSA特异性水解为相应水解产物，且产物具有荧光；该底物是以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮类化合物为原料，通过酯化反应获得相应羟基酯类衍生物，其结构通式如式（1）所示，其中，R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。

式（1）

如当R为（4-苯基）苯基时，该底物为1,3-二氯-7-（4-苯基苯甲酰氧基）-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮（DDAP）。

本发明还提供了HSA的特异性荧光探针底物的应用，该底物作为HSA的特异性底物，发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定酶或细胞制备液等生物样品及细胞中HSA的活性；具体测定方法为：

——体系中以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮类化合物7位羟基的酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10 ~ 10 K_m；单点测定时底物浓度优选K_m。

——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20>oC至60>oC之间，优选37>oC为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5>

——反应时间为5 ~ 120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应；

——测定单位时间内水解产物生成量作为HSA活性的评价指标。

本发明提供的人血清白蛋白特异性荧光探针底物的应用，所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1% ~ 20%之间。

本发明提供的人血清白蛋白特异性荧光探针底物的应用，探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长550 ~ 600 nm，在630 ~ 700 nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应HSA活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中HSA酶活的定量测定。

该特异性探针反应可用于重组白蛋白、人及动物组织制备液及各类组织细胞中HSA酶活的定量测定。

采用重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学等多方面的证据，证明1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮类化合物羟基的酯类衍生物可特异性的经HSA代谢，生成相应的水解产物。

作为高特异性的HSA的荧光探针底物，该化合物可以用来检测HSA的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的HSA重组酶的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的组织微粒体、S-9等制备物中HSA的活性标定。

选用本发明所述HSA的特异性探针底物检测HSA体外活性具有以下突出优势：

(1) 高特异性：1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮类化合物7-羟基的酯类衍生物可被HSA高特异性地代谢成一个代谢产物，即7位酯键断裂的水解产物。

(2) 廉价易得：1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮类化合物羟基的酯类衍生物及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行。

(3) 高灵敏度：具有1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性（630～700 nm），该底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可通过绘制标准曲线进行定量测定。

附图说明

图1单酶选择性。

图2 1,3-二氯-7-（4-苯基苯甲酰氧基）-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮与人血清白蛋白浓度线性关系。

图3 DDAP法与BCG法测试相关性。

图4 DDAP法和BCG法识别正常HSA和变性HAS。

图5 定量检测人肝癌分泌HSA能力。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，并不因此而限制本发明。

实施例1 1,3-二氯-7-乙酰氧基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮（DDAA）的合成

在25 mL两口瓶中加入0.25 mmol的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮、0.31 mmol的三乙胺和10 mL二氯甲烷，将0.3 mmol的乙酰氯溶解在5 mL二氯甲烷中，在氮气保护和冰浴的条件下，30 min内逐渐滴入反应瓶，在此温度下搅拌1 h，然后常温搅拌过夜。减压旋转蒸发除去溶剂，剩余固体采用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：石油醚 = 1：5（v：v），得到45.9 mg橘黄色固体（收率52.5%）。¹H>3)> J>J>J = 8.5, 2.3Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 1.88 (s, 6H).>13C>3)>+>

实施例2 1,3-二氯-7-（2-噻唑基甲酰氧基）-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮（DDAT）的合成

在25 mL两口瓶中加入0.25 mmol的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮、0.31 mmol的三乙胺和10 mL二氯甲烷，将0.3 mmol的2-噻吩甲酰氯溶解在5 mL二氯甲烷中，在氮气保护和冰浴的条件下，30 min内逐渐滴入反应瓶，在此温度下搅拌1 h，然后常温搅拌过夜。减压旋转蒸发除去溶剂，剩余固体采用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：石油醚 = 1：5（v：v），得到26.8 mg橘黄色固体（收率25.6%）。¹H>3)>J>J>J = 2.4 Hz, 1H), 7.24 – 7.19 (m, 1H), 1.91 (s, 6H).>13C>3)>+>

实施例3 1,3-二氯-7-（1-萘基甲酰氧基）-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮（DDAN）的合成

在25 mL两口瓶中加入0.25 mmol的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮、0.31 mmol的三乙胺和10 mL二氯甲烷，将0.3 mmol的1-萘甲酰氯溶解在5 mL二氯甲烷中，在氮气保护和冰浴的条件下，30 min内逐渐滴入反应瓶，在此温度下搅拌1 h，然后常温搅拌过夜。减压旋转蒸发除去溶剂，剩余固体采用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：石油醚= 1：5（v：v），得到33.0 mg橘黄色固体（收率28.6%）。¹H>3)>J>J> J>J>J>J>J = 8.5, 2.3 Hz, 1H), 1.94(s, 6H).>13C>3)>+>

实施例4 1,3-二氯-7-（4-苯基苯甲酰氧基）-9,9-二甲基-2(9H) -吖啶酮（DDAP）的合成

在25 mL两口瓶中加入0.25 mmol的DDAO、0.31 mmol的三乙胺和10 mL二氯甲烷，将0.3mmol的4-苯基苯甲酰氯溶解在5 mL二氯甲烷中，在氮气保护和冰浴的条件下，30 min内逐渐滴入反应瓶，在此温度下搅拌1 h，然后常温搅拌过夜。减压旋转蒸发除去溶剂，剩余固体采用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：石油醚 = 1：5（v：v），得到37.4 mg橘黄色固体（收率30.7%）。¹H>3)>J>J>J>J>J>J> 13CNMR>3)>+>

实施例5 重组表达的人单酶中的选择性

反应在PBS（pH = 7.4, 100 mM）中进行，在终体积为200 uL体系中分别加入下列水解酶或结合酶：碳酸酐酶、羧酸酯酶1、羧酸酯酶2、人血清白蛋白、乙酰胆碱酯酶、a-糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、丁酰胆碱酯酶以及稀释100倍的血浆，加入DDAA、DDAT、DDAN、DDAP（终浓度 20 uM）共孵育60 min，然后加入200 uL冰乙腈终止反应，混匀，20000g离心5 min，取150 uL上清液，利用酶标仪进行检测（见图1）。

实施例6 HSA线性反应的蛋白浓度曲线测定

反应在PBS（pH = 7.4, 100 mM）中进行，在终体积为200 uL体系中分别加入不同浓度HSA，加入DDAP（终浓度 10 uM）共孵育30 min，然后加入200 uL冰乙腈终止反应，混匀，20000g离心5 min，取150 uL上清液，利用酶标仪进行检测。（见图2）。线性曲线方程为Y =4.084 * X + 132.6（R²>

实施例7探针DDAP的动力学曲线测定

反应在PBS（pH = 7.4，100 mM）中进行，在终体积为200 uL体系中加入HSA，及DDAP（终浓度20 uM）共孵育60 min，然后加入200 uL冰乙腈终止反应，混匀，20000g离心5 min，取150 uL上清液，利用酶标仪进行检测。体系中HSA含量为200 mg/L或血浆稀释200倍，DDAP浓度范围为0-15 uM。

实施例8 DDAP法检测HSA与BCG检测HSA相关性测试

选取8例人血浆样本，考察DDAP方法与BCG方法的相关性。BCG在pH 4.2条件下，有非离子去垢剂存在时，可与HSA结合，形成蓝绿色复合物，在630 nm处有吸收峰，其吸光度与HSA含量在一定范围内成正比，用以检测HSA含量，与用DDAP测定结果对比（见图3）。

实施例9 探针DDAP区分正常HSA和变性HSA

分别将纯HSA溶解在PBS中，加热至100℃，并与正常HSA水解能力作对照（见图4）。

实施例10 定量测定人肝癌细胞分泌HSA能力

选取HepG2细胞作为研究对象，将细胞种植于六孔板中，采用含有10%小牛血清的极限必须培养基（Minimum essential medium, MEM）在37℃、5% CO₂培养箱中培养。每天更换培养基至细胞达到80%>

实施例11 DDAP检测尿样中HSA含量

反应在PBS（pH = 7.4, 100 mM）中进行，在终体积为200 uL体系中分别加入尿液，加入DDAP（终浓度 20 uM）共孵育60 min，然后加入200 uL冰乙腈终止反应，混匀，20000g离心5min，取150 uL上清液，利用酶标仪进行检测。根据标准曲线，测定该尿样中HSA含量为24mg/L。