生物标志物在鉴定检疫性实蝇有效冷处理中的应用及鉴定方法

技术领域

本发明涉及检验检疫领域，更特别地，生物标志物在鉴定检疫性实蝇有效冷处理中的应用及鉴定方法。

背景技术

随着全球经济一体化进程的深入，国际贸易日趋频繁和多样化，导致外来有害生物入侵频率加大，对生态环境和农业生产构成巨大的潜在威胁。中国是水果进出口大国，如何有效防范有害生物的跨境传播，确保我国农业、林业及生态安全，提高我国出口水果产品质量，已经成为我国出入境检疫部门关注的重点之一。

水果能够传带多种危险性外来有害生物，特别是地中海实蝇、番石榴实蝇、木瓜实蝇等水果产业的毁灭性检疫有害生物，寄主范围极广，几乎包含所有经济类水果，繁殖力和适应性强，其卵、幼虫、蛹都可随寄主类果实、包装物及运输工具进行远距离传播。一旦传入就有暴发成灾的可能，其结果不仅酿成重大经济损失，而且对新侵入地区的果蔬种植业构成严重威胁。为了防止外来生物入侵并满足口岸快速通关的需要，一般的做法只能在入境口岸实施溴甲烷熏蒸处理。但溴甲烷作为臭氧层消耗物质，虽然检疫用途的溴甲烷消费属于《蒙特利尔议定书》的豁免范围，但是近年来，国际社会要求包括检疫中使用的溴甲烷都应加速淘汰的呼声越来越高，欧盟已于2010年全面禁止了所有用途的溴甲烷使用。目前较为广泛的检疫处理方法为冷处理。

然而，有些携带有害生物的水果不经冷处理，就试图进入我国市场。还有些进行过冷处理后，幼虫不会立刻死亡，甚至有些幼虫会通过滞育度过胁迫阶段。目前对于昆虫是否进行检疫处理鉴定的技术还处于空白阶段，主要还局限在实验室饲养观察的方法，须经实验室培养后才能判读是否进行过冷处理，或者判断处理是否有效，但这么做耗时较长(一般需一周以上)，影响入境货物的通关速度。所以，快速判别幼虫是否进行冷处理，较好地防范了外来有害生物的入侵，对保障我国生物安全有重要的理论意义和实用价值。因此，需要一种快速可靠的方法来鉴定待检疫的货物是否进行过有效的冷处理。

发明内容

本发明基于代谢组学技术，依靠现代化学计量学和计算机模型系统，处理分析不同处理的昆虫体内的代谢物质，提取出有用的特征，从而达到灵敏、准确、高效识别昆虫幼虫处理有效性的目的，为检验检疫决策做出有力的技术支持。

基于此，本发明提供了生物标志物在鉴定检疫性实蝇有效冷处理中的应用。

优选地，所述生物标志物为α-羟基戊二酸或焦棓酸。

本发明还提供了一种鉴定检疫性实蝇有效冷处理的方法，其包括以下步骤：

S1：从待检疫的检疫性实蝇样品提取总代谢物，检测所述总代谢物中生物标志物的含量；

S2：将所述待检疫的检疫性实蝇样品的总代谢物中的生物标志物的含量与对照数据进行统计学比较，如果比较结果为差异显著，并且所述生物标志物含量满足阈值时，则判定所述待检疫的检疫性实蝇进行了有效冷处理。

进一步地，所述生物标志物的含量通过GC/MS检测得到。

进一步地，S1包括以下步骤：

S1.1：提取总代谢物，得到总代谢物提取液；

S1.2：向所述总代谢物提取液中添加内标；

S1.3：吹干，加入甲基化试剂进行甲基化；

S1.4：加入烷基化试剂进行烷基化；

S1.5：进行GC/MS检测

S1.6：通过数据分析得到所述生物标志的含量。

优选地，所述内标为半乳糖醇。

进一步地，所述对照数据为未经冷处理的检疫性实蝇的总代谢物中的生物标志物含量。

进一步地，S3中所述统计学比较为t检验，当t检验结果为P值小于0.05(即，差异显著)，并且待待检疫的检疫性实蝇的总代谢物中的生物标志物含量与未经冷处理的检疫性实蝇的总代谢物中的生物标志物含量的比值的Log₂对数大于1或小于-1(即，含量达到阈值)时，判定所述待检疫的检疫性实蝇进行了有效冷处理。

优选地，在进行t检验后，还进行受试者工作特征曲线(receiver operatorcharacteristic curve,ROC曲线)绘制，当ROC曲线的曲线下面积大于0.9时，表示所述判定的准确性高。

优选地，所述生物标志物为α-羟基戊二酸或焦棓酸。

本发明通过代谢组学分析技术筛选出用于检疫处理(特别是检疫冷处理有效性的判别中)的生物标志物，通过本发明对检疫性实蝇幼虫进行快速、高通量筛查，灵敏度和准确度高，缩短了检疫处理观察期判别的时间，大大降低了检疫处理实验验证的成本，为保障我国水果进出口贸易顺利进行，提升我国生物安全，具有重要的经济和社会效益。

附图说明

图1为对照组和冷处理组的总离子流(TIC)色谱图；

图2为对照组与冷处理组PLS-DA得分图；

图3为冷处理组与对照组OPLS-DA得分图。

具体实施方式

1.检疫性实蝇幼虫冷处理

将实蝇幼虫裸虫放入含有保湿滤纸的培养皿中，置于0℃的控温箱中，保持6h。对照组幼虫为裸虫，置于25℃的恒温培养箱中，通过温度记录仪监测对照组和处理组的环境温度。然后用液氮将经冷处理的实蝇幼虫和对照组幼虫用液氮速冻，并储存于-80℃。

2.样本的代谢组前处理

取-80℃储存的实蝇幼虫(3龄，10头，总重约160mg)，加入200μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，置入组织破碎仪(TissueLyser II)破碎(30Hz，2min)；取出，加入800μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，涡漩震荡30s，4℃放置20min，冷冻离心(4℃，16000g，15min)，取800μL上清液转入一新的EP管中；向残渣加入1mL色谱级甲醇，涡漩震荡30s，4℃放置20min，冷冻离心(4℃，16000g，15min)，取上清液1mL，与第1次的上清液混合；

取100μL提取液加入玻璃衍生小瓶，加入20μl内标水溶液(dulicitol,100ng/μL)，混合，氮气吹干，加入40μL的20mg/mL盐酸甲氧胺吡啶溶液，37℃震荡反应90min；加入40μL的BSTFA(含1％TMCS)的衍生试剂，70℃反应60min；取出衍生后的样本，室温放置30min，进行GC/MS代谢组学分析。

3.检疫性实蝇幼虫代谢组GC/MS分析

采用Agilent 7890A GC/5975C MS系统，毛细管色谱柱为Agilent J&WScientific公司的HP-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)。

仪器参数设定为：进样口温度280℃，EI离子源温度230℃，四极杆温度150℃，高纯氦气(纯度大于99.999％)作为载气，不分流进样，进样量1.0μL。升温程序为：初始温度60℃，维持2min，10℃/min的速度升至140℃，然后以4℃/min的速度升至240℃，最后以15℃/min的速度升至300℃，并维持8min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50-600(m/z)。采用随机顺序进行连续样本分析，避免因仪器信号波动而造成的影响，得到的质谱图如图1所示。

4.数据处理

应用R软件进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰的剔除和定量离子选择等，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量(rt_mz，即保留时间_质荷比)、观察量(样本)和积分面积。然后将所有数据归一化到内标峰(即峰面积除以内标峰面积)。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件(版本11.0)分别进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)。

5.偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)

采用PLS-DA这种监督的多维统计分析方法对对照和冷处理两组样本进行模型分析。共获得2个主成分，累积R²Y＝0.991，Q²＝0.906，得分图如图2所示(横坐标为第1主成分得分，用t[1]表示，R²Y＝0.935；纵坐标为第2主成分得分，用t[2]表示，R²Y＝0.0561))。模型解释率(R²Y)和模型预测率均接近于1(最高值为1)，说明PLS-DA模型可以非常好地解释两组样本之间的差异，而且当前模型的预测率也非常高，是对未知样本进行预测的理想数学模型。图2表明对照组和冷处理组之间在得分图上具有显著的代谢谱分离，两组样本分别处于第1主成分(即t[1])的正负两侧，因此两组样本之间具有显著的代谢差异。

6.正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)

采用正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)过滤与模型分类不相关信号即正交信号，建立可靠的OPLS-DA模型。模型质量参数为：1个主成分(R²Y＝0.935)和1个正交成分(R²Y＝0.0561)，累积R²Y＝0.991，Q²＝0.867，说明模型质量非常好。OPLS-DA得分图如图3所示。过滤掉与分类不相关的噪音信号后，两组样本在PC1(即t[1]P)上具有很好的代谢谱分离，即两组样本分别处于主成分(PC1，即t[1]P)的正负两侧。对照组内的变异性显著大于冷处理组，表现为对照组内具有各样本之间具有更大的离散性。

7.差异性代谢物及其结构鉴定

由于过滤掉了不相关的正交信号，因而获得的差异性代谢物更加可靠。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t检验(t-test)的p值(阈值0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索NIST商业数据库(比较质谱和色谱保留时间RT或保留指数RI)，以及采用标准物质数据比对确定。

因此，该发明方法可以将冷处理组与对照组之间的差异性分开，灵敏度和特异性高，代谢物达到41个，其中23个代谢物下降，18个代谢物上升(表2)，确认了冷处理组和对照组的代谢差异，可用于检疫性实蝇幼虫冷处理有效性检测。在以后的检测中，只需要针对表2中的这41个代谢物进行以上代谢组学检测以及PLS-DA和OPLS-DA分析即可。

表2.冷处理组与对照组之间的差异性代谢物

*冷处理组与对照组均值之比的对数值(以2为底)，正号表示冷处理组相对于对照组上升，负号表示下降。

在以上方案的基础上，发明人从这41种差异性代谢物之中进一步筛选出能够代表有效冷处理的生物标志物，以在保证检测准确性的基础上，更进一步地简化检测程序。

8.代谢组学GC-MS分析后物质峰值鉴别冷处理的ROC曲线分析及生物标志物质鉴定

根据代谢组学检测结果，冷处理的诊断采用t-test检测，筛选对照与冷处理组间有显著差异(P＜0.05)，以Log₂为底，折叠倍数(Fold>

如表3所示，冷处理组中，代谢物质α-羟基戊二酸(alpha-hydroxyglutaric acid)和焦棓酸(pyrogallol)经过ROC分析后AUC分别为1.00和0.97，且t-test检验P值＜0.5，Log₂的折叠倍数分别为-1.15和1.13。该两种物质冷处理的生物标志物。因此，判别是否进行冷处理，且冷处理是否有效，需要对比待检测组与对照组α-羟基戊二酸和焦棓酸是否有显著差异，且该两种物质的峰面积或物质浓度的Log₂的折叠倍数是否＞1。

表3 ROC曲线分析鉴别的冷处理生物标志物质

因此，以后可仅检测羟基戊二酸和焦棓酸的含量，并通过t检验、ROC曲线峰面积，以及Log₂折叠倍数来判断。当t检验结果P＜0.05，为差异显著，ROC曲线的AUC>0.7，Log₂折叠倍数大于1或小于-1时，判定样品经历了有效冷处理。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。