一种检测动物内脏中头孢菌素类药物残留的方法及其样品前处理方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种检测动物内脏中头孢菌素类药物残留的方法，以及适用的样品前处理方法。

背景技术

头孢菌素类抗生素是一类具有β-内酰胺环的半合成抗生素，自20世纪60年代初发明以来，由于其具有抗菌谱广、抗菌力强、毒副作用小、过敏反应少等特点，是目前世界上应用最为广泛，且发展最为迅速的一类抗感染药物，现已有第1至第4代头孢菌素类药物共60多种，被广泛应用于国内外临床。同时一些头孢类抗生素也逐步用于兽药中，用其治疗呼吸疾病、细菌感染等，从而不可避免地引起动物组织或其产品中的残留，对人类健康造成危害。目前，该类药物在动物源食品中的残留问题已引起了各国高度重视，中国、日本、美国、欧盟等国都已规定了动物源性食品中头孢菌素类药物残留的最大残留限量，严格控制头孢菌素类抗生素在畜牧业中的应用。其中日本最为严格，对动物肌肉组织中7种头孢菌素类药物(头孢匹林、头孢噻呋、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢唑林、头孢喹诺、头孢呋辛)制定了最高残留限量，我国也规定了3种头孢类药物的最高残留限量。为满足进出口贸易中日趋严格的残留限量检测要求，具备一种高效、准确、灵敏度高的头孢类药物残留检测的方法尤为必要。

目前，国内外对动物源食品中头孢类抗生素的检测技术已有少量报道，但仍存在一些不足。一是涵盖头孢种类较少，在现有的国内外文献中β-内酰胺类抗生素的检测方法多针对青霉素类,头孢类定量分析方法很少,且不成体系，只能同时检测头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑林等少数几种头孢药物残留，不能满足对多种头孢类药物同时检测的实际需求。二是涉及的样品基质简单，多集中在动物肌肉组织或牛奶中头孢类残留的测定，对于基质复杂的动物内脏组织少有涉及。三是现有的头孢类药物检测方法中样品前处理步骤复杂，时间过长，尤其是在内脏组织中一些头孢类化合物易降解为代谢物，从而导致待测化合物回收率偏低。因此，亟需开发出一种快速检测头孢类药物的样品前处理方法，尤其是适用于液-质联用检测的高效灵敏的样品前处理的方法，以满足日趋严格的头孢类药物残留限量检测要求。

发明内容

本发明的目的在于现有技术中对动物源食品中头孢菌素类药物进行检测时采用的样品前处理方法耗时长、涵盖头孢种类较少、基质单一，进而提供一种适用于同时、快速检测动物内脏中20种头孢菌素类化合物的样品前处理方法，尤其是适用于液-质联用检测的样品前处理方法。

本发明的另一个目的在于提供一种能够快速检测出动物内脏中头孢菌素类药物的方法。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种检测动物内脏中20种头孢菌素类药物残留的样品前处理方法，其包括下述步骤：

(1)取待检测样品，加入提取溶剂对所述待测样品进行提取，所述提取溶剂为乙腈和水的混合溶液；

(2)离心，得上清液；

(3)取上清液加载到固相萃取小柱上净化，收集得第一流出液；所述固相萃取小柱为PRiME HLB固相萃取小柱；

(4)待第一流出液收集完毕，再取所述提取溶剂加载到所述固相萃取小柱上，收集得第二流出液，合并全部流出液；

(5)将所述全部流出液经浓缩、复溶和过滤步骤，得到待测样液。

进一步地，在步骤(1)和步骤(4)中，所述提取溶剂乙腈和水的混合溶液中，乙腈和水的体积比为4:1-6:1。。

在步骤(1)中，所述待测样品与提取溶剂的质量体积比为1g:4mL-1g:6mL。

为了提高对头孢菌素类药物的提取效率，优选的，在步骤(1)中，所述提取溶剂提取头孢菌素类药物的步骤是在超声条件下进行的，更优选的，超声的频率为40kHz，提取时间为15-20min。

进一步地，在步骤(2)中，离心时，离心机的转速不低于8000r/min，离心8-10min。

进一步地，步骤(3)中，所述待净化的上清液中所含样品的量与所述固相萃取中PRiME HLB填料的质量比为1.75:1-2.25:1。

进一步地，所述步骤(5)中，所述浓缩步骤采用以氮气吹干的方式进行，温度低于45℃。所述复溶步骤是采用水溶液。所述过滤采用孔径为0.22μm滤膜。

本发明所述方法可针对20种头孢菌素类药物，包括：头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨噻肟、头孢吡肟、头孢克肟、头孢克洛、头孢孟多锂、头孢拉定、头孢匹罗、头孢米诺、头孢哌酮、头孢尼西、头孢呋辛、头孢喹诺、头孢匹林、头孢噻呋、头孢洛宁、去乙酰基头孢匹林和脱呋喃甲酰基头孢噻呋。

进一步地，本发明还提供一种液-质联用检测动物内脏中20种头孢菌素类药物残留的方法，其包括下述步骤：

(a)按照上面所述的样品前处理方法对动物内脏样品进行前处理，得到所需的待测样品；

(b)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对动物内脏中含有的头孢菌素进行检测。

进一步地，步骤(b)中，所述高效液相色谱的检测条件为：

色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18 2.1×100mm，1.9μm；

柱温：30℃；

流动相A：甲醇，流动相B：5mmol/L醋酸铵水溶液(含0.01％甲酸)；

流速：0.20mL/min；

进样量：10μL；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述三重四级杆质谱的检测条件为：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

喷雾电压：4.5kV；

鞘气流速：40arb；

辅助气流速：10arb；

毛细管温度：327℃。

所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：

本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述的样品前处理方法，以乙腈-水(4:1-6:1，V:V)的混合溶液对样品中头孢菌素类化合物进行提取，若水的含量太少，影响头孢钠盐的提取效率，若水的含量太高，固相萃取小柱对目标物产生吸附，回收率降低。

(2)本发明所述的样品前处理方法，利用PRiME HLB固相萃取小柱对样品进行净化处理，能够去除样品中蛋白、盐、磷脂等基质干扰物，此外，该固相萃取小柱无需活化、平衡、淋洗、洗脱步骤，解决了现有技术中样品前处理步骤复杂，时间过长，待测化合物易降解的问题。

(3)本发明所述样品前处理方法，当固相萃取小柱填料的质量为200mg时，所述取部分待净化的上清液中所含样品的质量为0.35-0.45g，并优选0.4g，既避免了上样体积中所含样品量过大，固相萃取小柱过载，也保证了待测化合物的检测低限要求。

(4)本发明所述样品前处理方法，当固相萃取小柱填料的质量为200mg时，待所述第一流出液收集完毕后，再取0.8-1mL乙腈和水的混合溶液加载到所述固相萃取小柱上，将残留在固相萃取小柱中的净化后的液体置换出来，从而减少目标化合物的损失，提高实验的准确性。

(5)本发明所述浓缩步骤采用氮气吹干的方式，不仅可以同时对多个样品进行浓缩处理，效率较高，而且相较于旋转蒸发的方式，氮气吹干更适用于少量样品，并避免了样品在转移中的浪费而造成的实验误差。

(6)本发明所述样品前处理方法，采用孔径为0.22μm滤膜进行过滤，以防止样品中含有大粒径杂质分子而对色谱的损坏，同时也在一定程度上起到净化样品的作用。

(7)本发明采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测样品中含有的头孢菌素类药物，该检测方法具有干扰性小、检出限低、灵敏度高、重现性好的特点，适于对抗生素的痕量检测。

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

图1为本发明所述液-质联用检测20种头孢菌素类药物的工艺流程图。

图2为本发明猪肝阴性样品添加20种头孢菌素类药物的提取离子流图，其中，A到T分别代表20种头孢菌素的提取离子流图。

图3为实施例2中脱呋喃甲酰基头孢噻呋的提取离子流图。

图4为对比例1和实施例1中20种头孢菌素类药物的添加回收率对比。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

1.仪器与试剂：

UHPLC-Quantum Ultra型超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；

氮吹仪(美国Organomation公司)；

微孔滤膜(0.22μm，美国Pall公司)；

超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)；

涡旋混匀器(德国IKA公司)；

高速离心机(德国Sigma公司)；

Thermo Hypersil Gold C18 2.1×100mm，1.9μm色谱柱(美国Thermo Fisher公司)；

20种头孢菌素类药物的标准品均购自加拿大TRC公司，各自用乙腈：水(50：50)配制成1.0mg/mL的标准储备液，置-20℃冰箱中保存，保存期不超过一年，分别量取各标准储备液，用乙腈：水(50：50)配置成1.0μg/mL的混合标准溶液，-20℃冰箱中保存，保存期不超过三个月。

甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯)，均购自美国Fisher Chemical公司；乙酸铵(色谱纯，购自北京百灵威科技有限公司；PRiME HLB固相萃取小柱购自Waters公司(Oasis PRiME HLB，6cc 200mg)；实验用水均由Milli-Q超纯水系统制备。

2.质谱条件的优化

20种头孢菌素类药物标准溶液(质量浓度均为1.0μg/mL)在电喷雾正离子模式下进行母离子全扫描，确定准分子离子峰，除头孢呋辛和头孢尼西的[M+NH₄]⁺准分子离子峰的响应明显强于[M+H]⁺，其它化合物均得到相应的[M+H]⁺峰。以准分子离子峰为母离子进行二级质谱扫描，选择相对丰度较高的2个碎片离子作为定量和定性离子，分别优化各个离子对的管状透镜电压和碰撞能量，其最优条件见表1。

表1 20种头孢菌素类药物的MRM质谱参数

*：定量离子(quantitative ion)

3.基质标准曲线和线性范围

用空白猪肝、羊肾提取液配制一系列不同浓度的混合标准溶液，按上述分析条件进行测定,以峰面积对浓度进行线性回归计算，结果(见表2)表明：20种头孢菌素的线性关系良好，相关系数(r²)均大于0.99。

表2 20种头孢菌素类药物的线性方程、线性范围、相关系数

实施例1样品的测定

本实施例所述动物内脏样品为加入20种头孢菌素类药物标准品的牛肝脏阴性样品，加标量均为50μg/kg，所述液-质联用检测动物内脏中20种头孢菌素类化合物的方法，具体包括如下步骤：

a、样品的前处理，并具体包括如下步骤：

(1)称取2g牛肝脏阴性样品，将20种头孢菌素类药物的混合工作液加入到样品中，控制加标量为50μg/kg，涡旋混匀，放置30min左右，之后加入10mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液，涡旋30s，在40kHz的超声波下提取20min，取出后以8000r/min离心10min。

(2)取2mL上清液加载到PRiME HLB固相萃取小柱上(PRiME HLB固相萃取小柱的规格为200mg，6cc)，保持一秒一滴的流速，收集得第一流出液，待第一流出液收集完毕后，再取1mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液加载到该柱上，收集得第二流出液，合并全部流出液。

(3)将流出液氮吹浓缩至少于0.5mL(温度低于45℃)，用水定容至0.5mL，经0.22μm滤膜过滤，制得待测样品。

b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的头孢菌素进行检测：

(1)所述高效液相色谱条件为：

色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18 2.1×100mm，1.9μm；

柱温：30℃；

流动相A：甲醇，流动相B：5mmol/L醋酸铵水溶液(含0.01％甲酸)；

梯度洗脱程序：

流速为0.2mL/min；

进样体积：10.0μL。

(2)所述质谱条件为：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

检测模式：多反应监测模式(MRM)；

喷雾电压：4.5kV；

鞘气流速：40arb；

辅助气流速：10arb；

毛细管温度：327℃。

其中，监测离子对、管状透镜电压和碰撞能量等参数如表1所示。

检测结果见图2，表明了采用本发明方法进行样品的前处理，并采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪进行检测，实现了对20种头孢菌素类药物的同时检出。

实施例2样品测定

本实施例所述动物内脏样品为鸡肾脏阳性样品，所述液-质联用检测动物内脏中20种头孢菌素类方法的方法，具体包括如下步骤：

(1)称取2g鸡肾脏阳性样品，加入12mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液，涡旋30s，在40kHz的超声波下提取20min，取出后以8000r/min离心10min。

(2)取2.5mL上清液加载到Oasis PRiME HLB固相萃取小柱上(PRiME HLB固相萃取小柱的规格为200mg，6cc)，保持一秒一滴的流速，收集得第一流出液，待第一流出液收集完毕后，再取1mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液加载到该柱上，收集得第二流出液，合并全部流出液。

(3)将流出液氮吹浓缩至少于0.5mL(温度低于45℃)，用水定容至0.5mL，经0.22μm滤膜过滤，制得待测样品。

b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的头孢类药物进行检测：

(1)所述高效液相色谱条件为：

色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18 2.1×100mm，1.9μm；

柱温：30℃；

流动相A：甲醇，流动相B：5mmol/L醋酸铵水溶液(含0.01％甲酸)；

梯度洗脱程序：

流速为0.2mL/min；

进样体积：10.0μL。

(2)所述质谱条件为：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

检测模式：多反应监测模式(MRM)；

喷雾电压：4.5kV；

鞘气流速：40arb；

辅助气流速：10arb；

毛细管温度：327℃。

其中，监测离子对、管状透镜电压和碰撞能量等参数如表2所示。

检测结果见图3，表明在该鸡肾脏样品中含有脱呋喃甲酰基头孢噻呋，并采用外标法以峰面积定量，测得该及肾脏样品中脱呋喃甲酰基头孢噻呋的含量为535ug/kg

实施例3方法的验证

回收率和精密度

在空白猪肝、猪肾、鸡肝、鸡肾、牛肝和羊肾样品中分别添加低中高3个不同水平混合标准溶液进行回收率试验。每个添加水平平行实验6次，平均回收率及相对标准偏差(RSD)见表3。20种头孢菌素类药物回收率介于70％～120％之间，精密度(RSD)＜16.4％，符合残留检测要求，重现性较好。

表3 猪肝、猪肾、鸡肝、鸡肾、牛肝和羊肾中添加20种头孢菌素类药物的回收率及相对标准偏差

对比例1

本对比例所述样品为实施例1中牛肝脏阴性样品添加20种头孢菌素类药物标准品量为50μg/kg制得，采用与实施例1完全相同的超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的头孢菌素进行检测，区别仅在于样品的前处理方法不同。

本对比例采用的样品前处理方法，其具体步骤为：

(1)称取2g牛肝脏阴性样品，将20种头孢菌素的混合工作液加入到样品中，控制加标量为50μg/kg，涡旋混匀，放置30min左右，之后加入10mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液，涡旋30s，在40kHz的超声波下提取20min，取出后以8000r/min离心10min。

(2)取全部上清液在低于45℃条件下减压浓缩至少于2mL，待固相萃取小柱净化。

(3)将浓缩液加载到活化好的HLB固相萃取小柱上(HLB固相萃取小柱的规格为200mg，6cc；加载前依次用5mL甲醇、5mL水活化)，保持一秒一滴的流速，待样液完全流出后，用5mL水洗柱，弃去流出液。再用5mL甲醇洗脱，收集全部流出液。

(4)将流出液氮吹浓缩至近干(温度低于45℃)，用水定容至1.0mL，经0.22μm滤膜过滤，制得待测样品。

用此前处理方法测得的牛肝脏中头孢菌素的添加回收率与实施例1中相比，20种目标物的添加回收明显下降(见图4)，其中，头孢克洛的回收率仅为23.2％。因此，采用上述样品前处理方法，不仅步骤繁琐，还会导致部分化合物回收率偏低，测得结果不准确。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。