一种识别检测三价铁离子和二价汞离子的苯甲酰胺衍生物荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于用于检测金属离子的荧光探针技术领域，具体地说，是关于一种识别检测Fe³⁺和Hg²⁺的苯甲酰胺衍生物荧光探针以及其制备方法和应用。

背景技术

自然界中广泛存在的金属离子对环境、医学、生物、化学科学都起着重要作用。其中重金属和过渡金属离子在生命活动中发挥着很重要的作用，与人类的健康息息相关，某些过渡金属离子在生命体内的含量过低会引起各种疾病，相反，浓度过大不仅对环境造成破坏，也极大地威胁人类的健康。

汞离子一直被视为最有毒的金属离子之一。由于其富集和剧毒的特点，汞会导致严重的健康问题，如产前脑损伤、认知和运动障碍、水俣疾病等。因此汞离子含量的检测极为重要。

Fe³⁺不仅是一种金属离子，而且它是人体中最重要的微量元素之一，是所有生命系统必不可少的。它存在于许多酶和蛋白质中，并作为细胞代谢反应的辅助因子。Fe³⁺执行血红素的携氧能力，缺铁能够引起人贫血，过量的铁含量能够损伤生物系统，这是因为它的氧化还原形式能够催化产生高度活性氧，而这种物质能够参与多种疾病，如帕金松综合征等。因此人体中的铁离子的含量测定是非常重要。

相比传统检测方法，荧光探针由于灵敏度高、选择性好、快速分析等特点被广泛地应用于环境和生物体内金属离子的检测。近几年采用荧光探针检测Fe³⁺和Hg²⁺已有大量文献报道，但大部分这类荧光探针存在灵敏度低，或者水溶性差，最主要是现有的金属离子荧光探针合成相对复杂。因此设计一类合成操作简单、高灵敏度和高选择性用于检测Fe³⁺和Hg²⁺的荧光探针具有重要意义。

发明内容

针对现有的荧光探针存在灵敏度低或者水溶性差的问题，本发明的目的在于提供一种识别检测三价铁离子和二价汞离子的苯甲酰胺衍生物荧光探针，该苯甲酰胺衍生物荧光探针对Fe(Ⅲ)和Hg(Ⅱ)有不同程度的响应，是在EDCI和HOBt作用下，苯甲酸衍生物与3,6-二硫杂-1,8-辛二胺反应而获得的。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个目的在于提供一种苯甲酰胺衍生物荧光探针，所述苯甲酰胺衍生物荧光探针的化学结构式为：

其中，R为-H、-OH、-NH₂、-OCH₃、-COOH、-Br、-F中的一种，

当R为-OH时，所述苯甲酰胺衍生物荧光探针为识别检测三价铁离子的苯甲酰胺衍生物荧光探针1b；

当R为-NH₂时，所述苯甲酰胺衍生物荧光探针为识别检测三价铁离子的苯甲酰胺衍生物荧光探针1c；

当R为-H时，所述苯甲酰胺衍生物荧光探针为苯甲酰胺衍生物荧光探针1a；

当R为-OCH₃时，所述苯甲酰胺衍生物荧光探针为苯甲酰胺衍生物荧光探针1d；

当R为-COOH时，所述苯甲酰胺衍生物荧光探针为苯甲酰胺衍生物荧光探针1e；

当R为-Br时，所述苯甲酰胺衍生物荧光探针为苯甲酰胺衍生物荧光探针1f；

当R为-F时，所述苯甲酰胺衍生物荧光探针为苯甲酰胺衍生物荧光探针1g。

本发明的第二个目的在于提供苯甲酰胺衍生物荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

A、将苯甲酸溶于二氯甲烷中；

B、在搅拌和冰水冷却下加入EDCI和HOBt，搅拌活化；

C、加入3,6-二硫杂-1,8-辛二胺；

D、室温搅拌过夜，反应结束后冷却，旋蒸，得到粗产品；

E、硅胶柱层析纯化，干燥获得所述的苯甲酰胺衍生物荧光探针。

进一步的，所述步骤B的搅拌活化时间为0.5-1h。

进一步的，所述苯甲酸为苯甲酸、水杨酸、邻氨基苯甲酸、邻甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸酐、邻溴苯甲酸、邻氟苯甲酸等中的一种。

进一步的，所述步骤C的3,6-二硫杂-1,8-辛二胺的制备方法包括：

C1、半胱胺盐酸盐与1,2-二溴乙烷在乙醇钠溶液中，反应1h；

C2、室温反应过夜，反应结束后过滤，旋蒸，真空干燥，获得所述的3,6-二硫杂-1,8-辛二胺。

本发明的第三个目的在于提供所述苯甲酰胺衍生物荧光探针1a-1g用于识别检测环境中过渡金属和重金属离子的应用。

本发明的第四个目的在于提供所述苯甲酰胺衍生物荧光探针1b用于识别检测环境中的Fe³⁺的应用。

本发明的第五个目的在于提供所述苯甲酰胺衍生物荧光探针1c用于识别检测环境中的Hg²⁺的应用。

本发明的有益效果是：本发明以苯甲酸衍生物为荧光团，3,6-二硫杂-1,8-辛二胺作为金属离子的主要识别部分，合成一类可以用于检测Fe³⁺和Hg²⁺的苯甲酰胺衍生物荧光探针，其方法简单，成本低廉；荧光探针1b和1c，分别对Fe³⁺和Hg²⁺有很好的选择性，且对Fe³⁺和Hg²⁺具有较高的测定灵敏度，能定性定量检测Fe³⁺和Hg²⁺；可用于水体中Fe(Ⅲ)和Hg(Ⅱ)的识别和检测，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为在DMSO/H₂O(5:95,v/v)溶液中，荧光探针1a－1g对不同金属(Na⁺,K⁺,Mn²⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Cr³⁺,Fe³⁺,Ni²⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Hg²⁺,Fe²⁺和Pb²⁺)的响应，其中，探针1a-1g的浓度为10μM，金属离子的浓度为100μM。

图2为荧光探针1a-1b的荧光光谱柱状图。

图3为其他金属离子对探针1b检测Fe³⁺的干扰；其中，探针1b的浓度为10μM，其他金属离子的浓度为100μM，Fe³⁺的浓度为100μM。

图4为其他金属离子对探针1c检测Hg²⁺的干扰；其中探针1c的浓度为10μM，其他金属离子的浓度为100μM，Hg²⁺的浓度为100μM。

图5为在DMSO/H₂O(5:95,v/v)溶液中，荧光探针1b的荧光光谱随Fe³⁺浓度的变化；插图为荧光强度对Fe³⁺浓度关系图。

图6为在DMSO/H₂O(5:95,v/v)溶液中，荧光探针1c的荧光光谱随Hg²⁺的浓度的变化图；插图为荧光强度对Hg²⁺浓度关系图。

图7为荧光探针1b与Fe³⁺的络合比。

图8为荧光探针1c与Hg²⁺的络合比。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。以下实施例中所使用到的各种试剂、反应条件、检测方法等，除非另有说明，否则视为本领域常规使用的试剂、反应条件和检测方法。

实施例9-12的检测方法参考文件：Bing Zhao等.Two‘turn-off’Schiff base fluorescence sensors based on phenanthro[9,10-d]imidazole-coumarin derivatives for Fe³⁺in>

Ebru Bozkurt等.A novel system for Fe³⁺ion>

实施例1 3,6-二硫杂-1,8-辛二胺的制备

将43mmol乙醇钠溶于40mL无水乙醇，冷却到10℃，氮气保护下将24mmol半胱胺盐酸盐加入上述溶液，反应1h后加入10mmol 1,2-二溴乙烷，室温反应过夜。反应结束后过滤，旋蒸，加入稀释的NaOH溶液，冰箱过夜。接着，CH₂Cl₂萃取，水洗三次，无水硫酸钠干燥，旋蒸，真空干燥得3,6-二硫杂-1,8-辛二胺，称重1.2623g，产率70.02％，产物结构式由¹H>13C>

¹H>3):2.89(t,J＝6.3Hz,2H),2.74(s,2H),2.66(t,J＝6.3Hz,2H)；¹³C>3OD):41.53,35.45,32.71；HRMS(ESI)m/z>6H₁₆N₂S₂,[M+H]⁺181.08,found>

实施例2苯甲酰胺衍生物荧光探针1a的合成与鉴定数据

将5.16mmol苯甲酸溶于50mL二氯甲烷，在搅拌和冰水冷却下加入EDCI(5mmol)和HOBt(5mmol)，搅拌活化0.5-1h。然后再加入2mmol 3,6-二硫杂-1,8-辛二胺(由实施例1获得)，室温搅拌过夜。旋蒸，CH₂Cl₂萃取，依次用饱和NaHCO₃，饱和NaCl，水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。旋蒸，粗产品经二氧化硅柱色谱提纯，真空干燥得荧光探针1a，称重0.4913g，产率63.3％，产物结构式由¹H>13C>

¹H>6):12.48(s,J＝6.24Hz,2H),2.73(s,4H),2.66(t,J＝6.24Hz,4H)；¹³C>3):167.54,134.08,131.38,128.37,126.79,39.19,31.33,31.14；HRMS(ESI)m/z>20H₂₄N₂O₂S₂,[M+H]⁺389.13,found>

其中，R为-H。

实施例3苯甲酰胺衍生物荧光探针1b的合成与鉴定数据

将2.8mmol水杨酸溶于50mL二氯甲烷，在搅拌和冰水冷却下加入EDCI(4mmol)和HOBt(4mmol)，搅拌活化0.5-1h。然后再加入1mmol 3,6-二硫杂-1,8-辛二胺(由实施例1获得)，室温搅拌过夜。旋蒸，CH₂Cl₂萃取，依次用饱和NaHCO₃，饱和NaCl，水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。旋蒸，粗产品经二氧化硅柱色谱提纯，真空干燥得荧光探针1b，产率46.9％，产物结构式由¹H>13C>

¹H>6):12.48(s,2H),8.95(t,J＝5.6Hz,2H),7.82(d,J＝7.9Hz,2H),7.39(t,J＝8.1Hz,2H),6.93–6.85(m,4H),3.48(q,J＝6.6Hz,4H),2.78(s,4H),2.74(t,J＝7.1Hz,4H)；¹³C>6):169.47,160.56,134.34,128.43,119.25,118.03,115.89,40.61,40.47,40.32,40.18,40.04,31.73,30.87；HRMS(ESI)m/z>20H₂₄N₂O₄S₂,[M+H]⁺421.12,found>

其中，R为-OH。

实施例4苯甲酰胺衍生物荧光探针1c的合成与鉴定数据

将2.8mmol邻氨基苯甲酸于50mL二氯甲烷，在搅拌和冰水冷却下加入EDCI(4mmol)和HOBt(4mmol)，搅拌活化0.5-1h。然后再加入1mmol 3,6-二硫杂-1,8-辛二胺(由实施例1获得)，室温搅拌过夜。旋蒸，CH₂Cl₂萃取，依次用饱和NaHCO₃，饱和NaCl，水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。旋蒸，粗产品经二氧化硅柱色谱提纯，真空干燥得荧光探针1c，产率51.2％，产物结构式由¹H>13C>

¹H>6):8.35(t,J＝5.8Hz,2H),7.45(d,J＝8.1Hz,2H),7.13(t,J＝7.6Hz,2H),6.68(d,J＝8.2Hz,2H),6.50(t,J＝7.5Hz,2H),6.41(s,5H),3.38(q,J＝6.6Hz,4H),2.77(s,4H),2.70(t,J＝7.2Hz,4H)；¹³C>6):168.94,168.83,149.62,149.59,131.71,131.66,128.00,127.95,116.34,114.52,114.42,39.93,38.95,38.82,38.38,37.20,31.04,30.42.HRMS(ESI)m/z>20H₂₆N₄O₂S₂,[M+H]⁺419.15,found>

其中，R为-NH₂。

实施例5苯甲酰胺衍生物荧光探针1d的合成与鉴定数据

将3mmol邻甲氧基苯甲酸于20mL二氯甲烷，在搅拌和冰水冷却下加入HBTU(4.5mmol)和DIPEA(1mL)，搅拌活化0.5-1h。然后再加入1mmol 3,6-二硫杂-1,8-辛二胺(由实施例1获得)，40℃搅拌过夜。用大量水稀释混合物，CH₂Cl₂萃取，依次用饱和NaHCO₃，饱和NaCl洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。旋蒸，粗产品经二氧化硅柱色谱提纯，真空干燥得产率49.5％，产物结构式由¹H>13C>

¹H>3):8.33(s,2H),8.19(d,J＝7.6Hz,2H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.07(dt,J＝11.0,5.6Hz,2H),6.97(dd,J＝8.2,3.7Hz,2H),3.98(d,J＝3.5Hz,6H),3.83–3.66(m,4H),2.99–2.77(m,8H).¹³C>3):165.37,157.53,132.87,132.16,121.23,111.31,55.99,39.05,38.33,38.00,31.82.HRMS(ESI)m/z>22H₂₈N₂O₄S₂,[M+H]⁺449.15,found>

其中，R为-OCH₃。

实施例6苯甲酰胺衍生物荧光探针1e的合成与鉴定数据

将3mmol邻苯二甲酸酐于30mL氯仿，然后再加入1.3mmol 3,6-二硫杂-1,8-辛二胺(由实施例1获得)，加热回流3h。冰浴降温，过滤并用氯仿：正己烷＝6:1洗涤，固体真空干燥得产率42.6％，产物结构式由¹H>13C>

¹H>6):8.45(t,J＝5.9Hz,2H),7.75(d,J＝7.6Hz,2H),7.55(t,J＝7.5Hz,2H),7.50(t,J＝7.6Hz,3H),7.40(d,J＝7.4Hz,2H),3.36(d,J＝7.0Hz,4H),2.78(s,4H),2.70(t,J＝7.4Hz,4H)；¹³C>6):169.22,168.57,138.97,131.81,131.40,129.84,129.82,128.18,40.59,31.73,30.68.HRMS(ESI)m/z>22H₂₄N₂O₆S₂,[M+H]⁺477.11,found>

其中，R为-COOH。

实施例7苯甲酰胺衍生物荧光探针1f的合成与鉴定数据

将3mmol邻溴苯甲酸于20mLDMF，在搅拌和冰水冷却下加入HBTU(4.5mmol)和DIPEA(1mL)，搅拌活化0.5-1h。然后再加入1mmol 3,6-二硫杂-1,8-辛二胺(由实施例1获得)，40℃搅拌过夜。用大量水稀释混合物，CH₂Cl₂萃取，依次用饱和NaHCO₃，饱和NaCl洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。旋蒸，粗产品经二氧化硅柱色谱提纯，真空干燥得产率59.1％，产物结构式由¹H>13C>

¹H>6):8.58(d,J＝5.9Hz,2H),7.65(dd,J＝8.0,3.9Hz,2H),7.39(ddd,J＝25.7,13.4,6.6Hz,4H),3.40(q,J＝6.4Hz,4H),2.80(d,J＝4.3Hz,4H),2.72(t,J＝6.8Hz,4H).¹³C>6)δ167.94,167.86,139.64,139.60,134.34,133.33,131.50,129.38,128.33,128.17,119.54,40.59,31.72,30.93.HRMS(ESI)m/z>20H₂₂Br₂N₂O₂S₂,[M]⁺546.95,found>

其中，R为-Br。

实施例8苯甲酰胺衍生物荧光探针1g的合成与鉴定数据

将3mmol邻氟苯甲酸于20mLDMF，在搅拌和冰水冷却下加入HBTU(4.5mmol)和DIPEA(1mL)，搅拌活化0.5-1h。然后再加入1mmol 3,6-二硫杂-1,8-辛二胺(由实施例1获得)，40℃搅拌过夜。用大量水稀释混合物，CH₂Cl₂萃取，依次用饱和NaHCO₃，饱和NaCl洗涤有机相，无水硫酸钠干燥。旋蒸，粗产品经二氧化硅柱色谱提纯，真空干燥得产率60.8％，产物结构式由¹H>13C>

¹H>6):8.44(s,2H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),7.53(q,J＝7.2Hz,2H),7.28(q,J＝8.2,7.2Hz,2H),3.43(q,J＝6.8Hz,4H),2.78(s,4H),2.72(t,J＝7.3Hz,4H).¹³C>3):163.28,163.26,161.24,159.55,133.16,133.10,131.68,124.58,124.56,120.81,120.72,115.92,115.75,76.88,76.66,39.16,38.62,37.42,31.59,31.33.HRMS(ESI)m/z>20H₂₂F₂N₂O₂S₂,[M+H]⁺425.11,found>

其中，R为-F。

实施例9荧光探针对金属离子的选择性检测

实施例2--实施例8所获得的苯甲酰胺衍生物荧光探针1a-1g对不同金属离子(Na⁺,K⁺,Mn²⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Cr³⁺,Fe³⁺,Ni²⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Ag⁺,Cd²⁺,Hg²⁺,Fe²⁺和Pb²⁺)的荧光滴定曲线，如图1所示。向10μM的荧光探针测试溶液中加入10当量的不同金属离子，测定其荧光光谱。从图1可以看出，加入10当量Fe³⁺后，荧光探针1a-1g的荧光都发生一定程度的猝灭。相比其他探针，Fe³⁺对探针1b荧光猝灭效果最好。相比Fe³⁺的识别，探针1c对Hg²⁺表现出较高灵敏度识别。从图2可以看出，七种荧光探针1a-1g对金属离子具有不同程度的选择性。

结论：七种荧光探针1a-1g都对Fe³⁺和Hg²⁺有一定的猝灭性作用，其中，对于荧光探针1b，当加入10当量Fe³⁺后，其荧光几乎猝灭，因此荧光探针1b可以作为的Fe³⁺高选择性探针。同理，荧光探针1c可以作为的Hg²⁺高选择性探针。

实施例10混合离子对荧光探针1b特异性识别Fe³⁺和荧光探针1c识别Hg²⁺的干扰检测

向10μM的荧光探针1b的测试溶液中滴加10当量的干扰离子，测试荧光光谱，随后加入10当量的Fe³⁺，检测在不同金属离子存在下探针1b识别Fe³⁺的抗干扰能力。如图3可以看出，荧光探针1b对Fe³⁺的识别并不受其他离子的干扰。

向10μM的荧光探针1c的测试溶液中滴加10当量的干扰离子，测试荧光光谱，随后加入10当量的Hg²⁺，检测在不同金属离子存在下探针1c识别Hg²⁺的抗干扰能力。如图4可以看出，荧光探针1c对Hg²⁺的识别并不受其他离子的干扰。

结论：荧光探针1b和荧光探针1c分别对Fe³⁺和Hg²⁺的识别过程具有良好的抗干扰能力。

实施例11荧光探针1b和荧光探针1c的灵敏度试验

(1)检测荧光探针1b与Fe³⁺浓度的关系

固定荧光探针1b浓度为10μM，Fe³⁺浓度依次增大。如图5可以看出，当Fe³⁺达到1当量时，1b的荧光强度不再增大，并逐渐趋于平衡。同时荧光探针1b在426nm处的荧光强度跟Fe³⁺浓度之间存在较好的线性关系，线性公式为y＝-0.01044+1.13487x，通过线性公式可得出荧光探针1b的检测限为0.216μM。同时通过Benesi–Hildebrand公式1/(F₀-F)＝1/{K_a*(F₀-F_max)*[Fe³⁺]}+1/(F₀-F_max)，可以计算出结合常数1.48×10⁴M^-1。

(2)检测荧光探针1c与Hg²⁺浓度的关系

固定荧光探针1c浓度为10μM，Hg²⁺浓度依次增大。如图6可以看出，当Hg²⁺达到2当量时，1c的荧光强度变化缓慢。同时荧光探针1c在419nm处的荧光强度跟Hg²⁺浓度之间存在较好的线性关系，其线性公式y＝0.00115+0.30578x，通过线性公开可以得出荧光探针1c的检测限为0.481μM。同时通过Benesi–Hildebrand公式1/(F₀-F)＝1/{K_a*(F₀-F_max)*[Hg²⁺]²}+1/(F₀-F_max)可以计算出结合常数1.90×10¹⁰M^-2。

结论：荧光探针1b和荧光探针1c分别对Fe³⁺和Hg²⁺具有较好的线性关系和较高的测定灵敏度，可以分别用于定量检测环境中Fe³⁺和Hg²⁺的含量。

实施例12探针1b与Fe³⁺的络合比和探针1c与Hg²⁺的络合比

通过荧光光谱做探针与金属离子相互作用的工作曲线，研究被选择的探针与金属离子的相互作用的结合比。固定探针1b和Fe³⁺的总浓度和为10μM，通过改变Fe³⁺的百分含量比进行测定。如图7可知，最大摩尔分数对应数值是0.5，即探针1b与Fe³⁺形成1:1的配合物。

固定探针1c和Hg²⁺的总浓度和为10μM，通过改变Hg²⁺的百分含量比进行测定。如图8可知，最大摩尔分数对应数值是0.6，即探针1c与Hg²⁺形成1:2的配合物。

综上所述，本实施例设计的荧光探针1b和荧光探针1c，是以这个选择性好、灵敏度高，并且对其他常见的金属离子具有较强的抗干扰能力，可以用来定性定量检测环境中的Fe³⁺和Hg²⁺。因此对环境中的Fe³⁺和Hg²⁺检测具有潜在的应用价值。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。