细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于核酸标记领域，特别涉及一种细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针及其制备方法与应用。

背景技术

在生命科学研究领域，具有荧光响应的核酸标记技术在研究核酸分子结构以及其在细胞内的合成过程具有非常重要的价值和意义。尤其是利用生物正交反应触发的荧光响应标记方法经成为一种生物分子标记的重要工具，这种标记方法可以在温和的条件下选择性标记和追踪生物分子，并进行灵敏的可视化荧光成像。最初的标记方法有荧光响应的合成后标记，模板介导的连接和DNA或RNA的代谢标记，这些方法是基于一价铜离子催化的叠氮和炔烃的环化加成反应[Gierlich,J.；Burley,G.A.；Gramlich,P.M.；Hammond,D.M.；Carell,T.Org.Lett.2006,8,3639–3642]。为了打破铜离子催化的高毒性[Kennedy,D.C.；McKay,C.S.；Legault,M.C.B.；Danielson,D.C.；Blake,J.A.；Pegoraro,A.F.；Stolow,A.；Mester,Z.；Pezacki,J.P.J.Am.Chem.Soc.2011,133,17993-18001]荧光响应标记核酸进一步发展为基于非铜催化的生物正交反应，非铜催化的生物正交反应包括张力促进的1，3-两极环化加成反应，狄尔斯-阿尔德反应和亲核加成反应[Domnick,C.；Eggert,F.；Kath-Schorr,S.Chem.Commun.2015,51,8253–8256]。但是即便如此，由于非铜催化的反应基团的尺寸的限制，到目前为止还没有报道过在细胞内有荧光响应的DNA快速标记和成像的方法。在细胞环境内荧光响应标记核酸对于探究核酸的复制及转运过程是非常重要的。

光诱导的叠氮-炔烃环化加成反应即光点击反应是一种非金属催化的具有荧光响应的生物正交反应。光点击反应已经作为一种有效的蛋白定点修饰方法，近年来这种反应引起了很多人的关注。光点击反应已经成功地被证明可以用可见光405nm[An,P.；Yu,Z.；Lin,Q.Chem.Commun.2013,49,9920-9922.]和近红外光700nm激发[Yu,Z.；Ohulchanskyy,T.Y.；An,P.；Prasad,P.N.；Lin,Q.J.Am.Chem.Soc.2013,135,16766–16769]。通过改变四唑化合物的结构来减少紫外光的限制。鉴于这一优势，近期光点击化学反应已经开始被应用于在体外对核酸的修饰[(a)Holstein,J.M.；Stummer,D.；Rentmeister,A.Chem.Sci.2015,6,1362–1369.(b)Arndt,S.；Wagenknecht,H.-A.Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,14580–14582]。但是，有的文献报道的四唑化合物通过光点击反应标记核酸后的产物荧光较弱或者无光，有的文献则用四唑化合物可以荧光响应标记RNA[Li,J.；Huang,L.；Xiao,X.；Chen,Y.；Wang,X.；Zhou,Z.；Zhang,Y.J.Am.Chem.Soc.2016,138,15943-15949]。在光点击反应标记核酸的过程中，这种不明确的荧光响应行为成为其首要问题。因此，解决光点击反应标记核酸中的荧光响应问题及探究可以用于活体内代谢标记核酸的具有荧光响应能力的探针具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针。该探针具有光点击反应的特征性优点如：反应速度快，反应基团分子为小且易修饰具有烯烃基团的化合物，并且该探针具有细胞核靶向性，适合应用于活细胞内核酸的快速代谢标记。

本发明的另一目的在于提供了所述细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针，为香豆素四唑化合物W1和W2中的至少一种；所述的W1和W2的结构式如式I和式II所示：

其中，R为C₁-C₂烷基、烷基衍生物取代基，含酯基衍生物取代基或芳香烃衍生物取代基。

所述的C₁-C₂烷基、烷基衍生物取代基优选为甲基、乙基或三氟甲基；

所述的含酯基衍生物取代基优选为乙酸乙酯取代基

所述的芳香烃衍生物取代基优选为苯甲基对三氟甲基苯甲基对甲氧基苯甲基或2,5-二甲氧基苯甲基

所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)将香豆素衍生物加入乙醇水溶液中，接着加入浓盐酸，然后在5℃条件下加入NaNO₂(亚硝酸钠)水溶液，再在-15℃的条件下滴加到4-甲基((2-(苯磺酰)亚肼基)甲基)苯甲酸盐的吡啶中，恢复室温进行反应，萃取、减压蒸馏、得到香豆素四唑化合物(W1)；

(2)将步骤(1)中得到的香豆素四唑化合物(W1)和氢氧化锂在四氢呋喃、甲醇和水的混溶液中加热搅拌反应，反应终止后再调节溶液的pH值至出现紫色沉淀，得到中间体A；

(3)将步骤(2)中得到的中间体A、NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中搅拌反应(用于活化香豆素四唑化合物)，反应终止后再加入饱和食盐水析出沉淀，得到四唑化合物B；

(4)将步骤(3)中得到的四唑化合物B加入到含有三乙胺的DCM(二氯甲烷)和DMSO(二甲基亚砜)溶液中，然后加入牛磺酸水溶液搅拌反应，减压蒸馏，加甲醇稀释沉淀过滤后，调pH值至中性，再加入乙醚、过滤、取沉淀，得到W2，即为细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针。

步骤(1)中所述的香豆素衍生物和4-甲基((2-(苯磺酰)亚肼基)甲基)苯甲酸盐优选为按摩尔比10:9配比计算。

步骤(1)中所述的乙醇水溶液为乙醇和水按体积比1:1配比得到。

步骤(1)中所述的反应的条件为搅拌过夜进行反应。

步骤(1)中所述的乙醇水溶液的用量为按乙醇水溶液和浓盐酸的体积比6:1配比计算。

步骤(1)中所述的浓盐酸的浓度优选为体积百分比37％。

步骤(1)中所述的萃取为采用DCM(二氯甲烷)进行萃取。

所述的具有荧光响应的DNA光点击探针的制备方法，还包括将步骤(1)中得到的香豆素四唑化合物经硅胶柱进一步纯化。

步骤(2)中所述的香豆素四唑化合物和氢氧化锂优选为按摩尔比1:20配比计算。

步骤(2)中所述的四氢呋喃的用量为按四氢呋喃、甲醇和水体积比2:1:1配比计算。

步骤(3)中所述的中间体A、NHS和EDC优选为按摩尔比1:2:2配比计算。

步骤(3)中所述的反应的时间优选为12h。

步骤(4)所述的四唑化合物B、三乙胺和牛磺酸优选为按摩尔比1：2：2配比计算。

步骤(4)中所述的DCM的用量为按DCM和DMSO体积比4～6:1配比计算；优选为按体积比5：1配比计算。

步骤(4)中所述的调pH值优选为用氢氧化钠的甲醇溶液进行调pH值。

所述的氢氧化钠的浓度优选为0.5mol/L。

步骤(4)中所述的反应优选为在氮气保护下进行反应。

所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针在核酸标记领域中的应用。

所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针在核酸标记领域中的应用，通过如下方法实现：

(I)将细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针与具有氨基的核酸序列在硼酸钠缓冲液中避光孵育进行缩合反应，用预冷的无水乙醇将核酸沉降出来，得到香豆素四唑修饰的核酸；

(II)将步骤(I)得到的香豆素四唑修饰的核酸分别与异丙基丙烯酰胺和N-(2-羟乙基)马来酰亚胺在磷酸盐缓冲液中、紫外光照射下发生光点击反应，得到具有荧光响应的核酸。

步骤(I)中所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针和核酸序列优选为按摩尔比(8～12)：1配比计算；更优选为按10:1配比计算。

步骤(I)中所述的核酸序列优选为5’端氨基标记。

步骤(I)中所述的硼酸钠缓冲液的pH优选为8.0。

步骤(I)中所述的缩合反应的时间优选为14小时。

步骤(II)中所述的紫外光的波长优选为350nm。

步骤(II)中所述的紫外光的照射时间优选为10分钟。

步骤(II)中所述的磷酸盐缓冲液的pH值为5.5～7.5，优选为7.5。

所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针在核酸标记领域中的应用，还可以通过如下方法实现：

①将细胞传代到培养皿中培养贴壁后，加入5-乙烯基-2’-脱氧尿苷(VdU)进行培养；

②换成新的DMEM培养液孵育后，再加入细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针继续培养；

③加入新的DMEM培养液孵育后，再用紫外光照射进行反应。

步骤①中所述的细胞优选为肿瘤细胞。

步骤①中所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针优选为CTz-SO₃。

步骤①中所述的加入VdU为加入终浓度为30～50μM的VdU；优选为加入终浓度为30μM的VdU。

步骤①中所述的培养的时间为12～20小时；优选为16小时。

步骤②中所述的加入细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针为加入终浓度为10～20μM的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针，优选为加入终浓度为10μM的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针。

步骤②中所述的孵育的时间为3～6小时；优选为4小时。

步骤②中所述的继续培养的时间为3～6小时；优选为4小时。

步骤③中所述的孵育的时间优选为2小时。

步骤③中所述的紫外光波长优选为350nm。

步骤③中所述的紫外光的照射时间为8～14分钟；优选为10分钟。

本发明中细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针标记核酸的发光原理是：标记核酸后产物发光部分由两部分组成，荧光探针香豆素衍生物部分和吡唑啉部分，吡唑啉部分发光可以被核酸引起的光诱导的电子转移效应淬灭，但是香豆素部分的荧光不受影响，因此，香豆素四唑在紫外光的照射下可以荧光响应的标记核酸。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本文中光点击探针具有细胞核靶向性适用于活体内的核酸代谢标记。

(2)反应基团分子小，不干扰细胞内核酸正常的代谢过程。

(3)反应速度快，可以快速标记细胞内的核酸。

(4)反应中用350nm的紫外光照射减少对细胞及核酸的损伤。

(5)反应过程中有荧光响应，反应完后不需要清洗步骤即可，核酸标记成像不需要将细胞固定或核酸变性。

(6)反应原料容易获得，反应产物合成简单，操作简单，易于普及。

(7)本发明中具有荧光响应的DNA光点击探针，香豆素的E_HOMO值在-0.324hartree以下时香豆素的荧光可以被四氮唑淬灭，随着香豆素的E_HOMO值逐渐降低，标记核酸产物的荧光量子产率会逐渐升高，同时香豆素四唑化合物的荧光量子产率也会有所增加。

附图说明

图1是本发明中细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针的合成路线图与实施1中产物1～7的结构图，其中，图a为合成路线图；图b为产物1～7的结构图。

图2是实施例2中计算的香豆素衍生物的最高占据分子轨道能量值(E_HOMO)和荧光量子产率关系图(图中UV表示350nm紫外光)。

图3是实施例3中香豆素四唑修饰的核酸和不同带烯烃的化合物光点击反应后的荧光图；其中，图a为香豆素四唑修饰的核酸分别与异丙基丙烯酰胺和N-(2-羟乙基)马来酰亚胺反应产物的荧光光谱图；图b为在不同pH值的缓冲液中香豆素四唑修饰的核酸与N，N-二甲基乙基丙烯酰胺反应产物的荧光光谱图。

图4是实施例4中细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针CTz-SO₃和VdU光点击反应后的荧光图和吸收图；其中，图a为CTz-SO₃和VdU反应前后的荧光光谱图；图b为CTz-SO₃和VdU反应前后的吸收谱图。

图5是实施例4中光点击速率数据分析图。

图6是实施例5中细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针CTz-SO₃标记细胞核酸图(图中UV表示350nm紫外光)；其中图a为CTz-SO₃标记细胞DNA的原理示意图；图b为CTz-SO₃标记细胞DNA的共聚焦显微成像图。

图7是实施例6中验证活细胞内胞内荧光响应标记DNA的光点击探针CTz-SO₃具有细胞核靶向性的共聚焦显微成像图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

1、实施例中所涉及的化学试剂均由阿拉丁购买；所涉及的DNA产品和DMEM细胞培养液均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；细胞来源于ATCC细胞库；3K超滤管购自颇尔公司；荧光光谱仪(LS 55)，紫外吸收光谱仪(Lambada35；PerkinElmer，BeaconsWeld，Bucks，UK)；激光共聚焦扫描显微镜(LSM510/Con-foCor2，Carl-Zeiss，jena，Germany)。

2、实施例中4-甲基((2-(苯磺酰)亚肼基)甲基)苯甲酸盐的合成参考：Li,Z.,Qian,L.,Li,L.,Bernhammer,J.C.,Huynh,H.V.,Lee,J.S.,&Yao,S.Q.(2016).AngewandteChemie International Edition,55(6),2002-2006。

实施例1 一系列种基于光点击反应且具有荧光响应的DNA探针的制备

(1)将香豆素衍生物1′(1mmol)加入6mL的乙醇/水(EtOH/H2O，体积比1:1)中然后加入1mL浓度为37％(v/v)的浓盐酸搅拌，并在5℃的条件下慢慢加入到1.5mL NaNO₂(1mmol)的水溶液中并搅拌；然后在-15℃的条件下将这些混合物逐滴的滴加到4-甲基((2-(苯磺酰)亚肼基)甲基)苯甲酸盐((E)-methyl>

(2)参考上述制备方法，分别用香豆素衍生物2′～7′替换上述香豆素衍生物1′，得到香豆素四唑化合物2～7(如图1所示)；

上述香豆素衍生物1′～7′的结构式如下所示：

产率及表征数据：

1:Yield:52％.¹H>3):δ＝8.35(m,2H),8.23(m,4H),7.81(m,1H),6.39(d,J＝1.0Hz,1H),3.96(s,3H),2.50(d,J＝1.5Hz,3H)；

2:Yield:50％.¹H>3):δ＝8.37(d,J＝4.0Hz,2H),8.30(d,J＝8.0Hz,2H),8.24(d,J＝8.0Hz,2H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),6.92(s,1H),3.98(s,3H)；MS(ESI)calcd>19H₁₁F₃N₄O₄,416.32[M⁺],found>

3:Yield:48％.¹H>6):δ＝8.34(d,J＝8.0Hz,2H),8.22(d,J＝8.0Hz,2H),8.17(s,1H),8.01(d,J＝4.0Hz,1H),7.94(d,J＝4.0Hz,1H),6.64(s,1H),4.16(m,J＝4.0Hz,2H),4.06(s,2H),3.92(s,3H),1.22(t,J＝6.0Hz,3H)；MS(ESI)calcd>22H₁₈N₄O₆,434.40[M⁺],found>

4:Yield:45％.¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.36(d,J＝8.0Hz,2H),8.22(d,J＝4.0Hz,3H),8.16(d,J＝4.0Hz,1H),7.87(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H),7.27(d,J＝8.0Hz,2H),6.24(s,1H),4.18(s,2H),3.97(s,3H)；MS(ESI)calcd>25H₁₈N₄O₄,438.44[M⁺],found>

5:Yield:41％.¹H>3):δ＝8.36(d,J＝8.0Hz,2H),8.24(d,J＝4.0Hz,1H),8.22(d,J＝4.0Hz,2H),8.19(d,J＝8.0Hz,1H),7.83(d,J＝8.0Hz,1H),7.62(d,J＝8.0Hz,1H),7.55(t,J＝8.0Hz,2H),7.46(d,J＝4.0Hz,1H),6.18(s,1H),4.24(s,2H),3.97(s,3H)；MS(ESI)calcd>26H₁₇F₃N₄O₄,506.44[M^-],found>

6:Yield:42.％¹H>3):δ＝8.36(d,J＝8.0Hz,2H),8.23(d,J＝8.0Hz,3H),8.16(d,J＝4.0Hz,2H),7.87(d,J＝4.0Hz,2H),7.18(d,J＝4.0Hz,2H),6.92(d,J＝8.0Hz,2H),4.12(s,2H),3.98(s,3H),3.82(s,3H)；MS(ESI)calcd>26H₂₀N₄O₅,468.47[M⁺],found>

7:Yield:40％.¹H>3):δ＝8.36(d,J＝8.0Hz,2H),8.22(d,J＝4.0Hz,2H),8.20(d,J＝4.0Hz,2H),7.95(d,J＝8.0Hz,1H),6.89(d,J＝8.0Hz,1H),6.84(d,J＝8.0Hz,1H),6.72(d,J＝4.0Hz,1H),6.14(s,1H),4.12(s,2H),3.97(s,3H)，3.81(s,3H)，3.75(s,3H)；MS(ESI)calcd>27H₂₂N₄O₆,498.50[M^-],found>

(2)CTz-SO₃的制备

将上述得到的香豆素四唑化合物1(362mg，1.0mmol)与氢氧化锂(840mg，20.0mmol)在四氢呋喃、甲醇和水的混合液(体积比2:1:1)中加热搅拌反应，反应终止后调节溶液的pH值至出现紫色沉淀；得到中间体8；称取中间体8(240mg，0.69mmol)放入25ml单颈烧瓶中，加入4ml的DMF(二甲基甲酰胺)使搅拌其溶解，得到中间体8溶液；称取NHS(208mg，1.38mmol)和EDC(264mg，1.38mmol)放入25ml单颈烧瓶中，加入3ml DMF搅拌使其溶解，得到NHS(N-羟基丁二酰亚胺)/EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液；将中间体8溶液缓慢地滴入到NHS/EDC溶液中，搅拌过夜(12h)，TLC(薄层色谱)跟踪检测反应；反应完全后，向反应液中加入饱和食盐水，沉淀析出；过滤收集沉淀，用水冲洗沉淀；将沉淀烘干，得到四唑化合物9。

将四唑化合物9(200mg，0.45mmol)和三乙胺(125μL，0.9mmol)加入到含有三乙胺的DCM(二氯甲烷)/DMSO(二甲基亚砜)体积比为5:1的溶液中，然后再加牛磺酸(112.5mg，0.9mmol)的水溶液2ml，氮气保护进行反应。反应完全后减压蒸馏，加甲醇稀释沉淀过滤后，滤液用0.5M氢氧化钠的甲醇溶液调至中性，然后加乙醚，过滤沉淀得到183mg CTz-SO₃(结构式如式III所示)，产率78％，即为具有细胞核靶向性荧光响应的DNA探针。

其中，R为甲基。

数据表征：¹H>6):δ＝8.70(t,J＝4.0Hz,1H),8.28(d,J＝8.0Hz,2H),8.17(t,J＝4.0Hz,2H),8.09(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,2H),6.56(s,1H),3.55(t,J＝4.0Hz,2H),2.71(t,J＝4.0Hz,2H),2.48(s,3H)；MS(ESI)calcd>20H₁₆N₅O₆S,454.08[M^-],found>

(3)CTz-El的制备

将三乙胺(138μL，1.0mmol)加入10ml的二氯甲烷中，然后加入上述制得的四唑化合物9(45mg，0.1mmol)，然后加入乙胺(65μL，1.0mmol)，混合物在氮气保护下搅拌1小时，反应完后减压蒸馏，然后经过硅胶柱提纯得最终产物CTz-El，其结构式如式IV所示：

其中，R为甲基。

数据表征：¹H>3):δ＝8.33(d,J＝4.0Hz,2H),8.19(d,J＝4.0Hz,2H),7.93(t,J＝4.0Hz,2H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.40(s,1H),6.23(s,1H),3.53(m,2H),2.52(s,3H),1.29(t,J＝4.0Hz,3H)；MS(ESI)calcd>20H₁₇N₅O₃,375.13,[M⁺H⁺],found376.15.

实施例2：香豆素四唑1-7和标记DNA产物的光动力学特性

将实施例1中得到的香豆素四唑化合物1-7分别与修饰烯烃的DNA结构如式III反应，香豆素四唑化合物1-7的浓度是100μM，修饰烯烃的DNA的浓度是10μM，在350nm紫外灯下照射10分钟，反应完后用超滤管提纯产物。测7种反应产物的荧光并计算反应产物的荧光量子产率，结果见表1。图2是实施例1中计算的香豆素衍生物的E_HOMO(最高占据分子轨道能量值，根据wB97XD/6-311+G(d,p)方法计算，)和荧光量子产率关系图。从表1和图2中反应前除香豆素四唑2外其它香豆素四唑几乎没有荧光，光点击反应后可以产生明显荧光响应。从表2中可以看出在计算的香豆素的E_HOMO值在-0.324hartree以下时香豆素的荧光可以被四氮唑淬灭，随着香豆素的E_HOMO值逐渐降低，标记核酸产物的荧光量子产率会逐渐升高从0.129升至0.389，同时香豆素四唑化合物的荧光量子产率也会有所增加。

表1 四唑化合物1-7和标记DNA产物的光学特性

实施例3：香豆素四唑标记核酸后发光原理的探究

取香豆素四唑1作为实施案例中的样品，将其活化后的四唑化合物9(方法同实施例1)，取一管5’端氨基标记的核酸序列离心(12000rpm，20min)；将离心管盖打开，快速加入55μL 0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.0)迅速盖上管盖；在漩涡仪上充分振荡10min；加入30μL50mM的四唑化合物9(提前用二甲基亚砜配置成50mM的溶液)；将离心管缠上锡箔纸，放在离心管加上振荡孵育14小时；往离心管中加入1ml预冷订的无水乙醇，上下振荡1min；然后放入超低温冰箱静置2小时；4℃、12000rpm离心20min；吸去上层澄清溶液，加入1ml预冷1mL预冷订的无水乙醇，上下振荡1min；然后放入超低温冰箱静置2小时；4℃、12000rpm离心20min；吸去上层澄清溶液，静置30min，加55μl无菌水，充分振荡5min；12000rpm离心10min；吸去上层澄清溶液放入离心管中-20℃保存，得到香豆素四唑修饰的核酸，结构式如式VI所示；然后将香豆素四唑修饰的核酸分别与异丙基丙烯酰胺和N-(2-羟乙基)马来酰亚胺在pH7.5的磷酸盐缓冲液中在350nm紫外光下照射10分钟，反应后用超滤管提纯，然后用荧光光谱仪测荧光，实验结果图3a所示，从图中可以看出，香豆素四唑修饰的核酸与异丙基丙烯酰胺反应后产生荧光在490nm，N-(2-羟乙基)马来酰亚胺反应产物荧光在450nm，这些发现表明反应产物的淬灭效应可能是由于烯烃化合物的光诱导的电子转移。为了验证这个观点将香豆素四唑修饰的核酸与N，N-二甲基乙基丙烯酰胺在350nm的紫外光下分别在pH5.5～7.5的磷酸盐缓冲液中反应，反应后用超滤管提纯，然后用荧光光谱仪测测荧光。实验结果如图3b所示，从图中可已看出随着pH从5.5增加到7.5，在490nm处的荧光逐渐减弱并在450nm处出现一个新的发射峰。这些实验结果近一步证明带有香豆素的四唑化合物的环化加成反应产物的发射峰在450nm和490nm分别来自于香豆素和吡唑啉部分。更重要的是基于这些发现我们可以预测以及监测一些烯烃化合物和带香豆素四唑化合物反应产物的发射峰。

实施例4：光点击反应速率的测定

5μM的VdU(5-乙烯基-2’-脱氧尿苷)分别和25μM、50μM的四唑化合物CTz-SO₃(实施例1制得)在350nm紫外灯下分别照射1分钟、5分钟、10分钟、20分钟后，用高效液相色谱(HPLC)检测反应产物，并计算反应产率，再通过公式计算反应速度，其中，

公式是；ln(VdU/(VdU-[Product]_t))＝k_observed*t；k_observed＝k_{cycloaddition}*[CTz-SO₃]

式中：Product表示产物浓度；k_observed表示实验中观察到的反应速率；k_{cycloaddition}表示实际点击反应速率；t表示时间；VdU表示VdU的浓度；CTz-SO₃表示CTz-SO₃的浓度。

实验结果如图4所示，图4是具有细胞核靶向的四唑香豆素和VdU光点击反应后的荧光和吸收图；从图4a中可以看出光照后450nm处荧光明显增强，图4b中光照后330nm处吸收降低395nm处吸收增强，表明产物生成。

光点击反应符合准一阶反应，在VdU相同浓度，四唑化合物不同浓度的条件下用350nm紫外灯照射不同的时间，然后用高效液相色谱(HPLC)分析生成产物的浓度及产率，实验结果如表2所示，表2表示反应产物和时间的关系，从表2中可以看出随着光照时间的增加生成的产物不断增加，并且香豆素四唑浓度大的组产物生成的速度比浓度小的组要快。数据分析如图5所示，图5是表中的数据分析后线性拟合的结果，通过公式计算光点击反应速率为k_(5.0equiv.)＝14.8M^-1s^-1；k_(10equiv.)＝19.8M^-1s^-1，相比反电子需求的Diels-Alde的VdU和四唑化合物连接反应的速率(0.02M^-1s^-1)明显增加。

拟合的线性部分的结果：k_{observed，5.0eq}＝3.71205E-4；k_{observed,10eq}＝9.89344E-4.

根据公式计算的反应速度是:k_(5.0equiv.)＝14.8M^-1s^-1；k_(10equiv.)＝19.8M^-1s^-1.

实验结果表明本文中光点击速率最快可达到20M^-1s^-1，表明可以通过光点击反应可以快速的代谢标记细胞内的DNA，这种光诱导的生物正交反应区别于其他正交反应的优势是可以快速追踪细胞内DNA或RNA的合成和转录过程。

表2 光点击反应速率条件

实施例5 细胞内代谢标记DNA

(一)活细胞内的核酸代谢标记

将A549细胞传代到培养皿中培养贴壁后，实验组加入30μM的VdU，对照组加入同样体积的PBS(pH7.4)培养16小时，然后换成新的DMEM培养液孵育4小时后都加入10μM的香豆素四唑CTz-SO₃(实施例1制得)孵育4小时，然后加入新的DMEM细胞培养液孵育2小时后，分别用350nm紫外光(UV)照射10分钟后，激光共聚焦显微镜成像。

(二)固定细胞内的核酸代谢标记

将A549细胞传代到培养皿中培养贴壁后，实验组加入30μM的VdU，对照组加入同样体积的PBS(pH7.4)培养16小时，然后换成新的DMEM培养液孵育4小时，弃掉培养液，用3.7％(v/v)多聚甲醛溶液固定细胞10分钟后用0.2％(v/v)Triton X-100通透细胞，然后分别加入10μM的香豆素四唑CTz-SO₃避光孵育2小时，用350nm紫外灯照射10分钟，用激光共聚焦显微镜成像。

实验结果如实验图6所示，从图中可以看出活细胞中加VdU孵育的实验组产生明显的荧光信号，没有加VdU孵育的对照组中的荧光非常微弱。固定细胞中加VdU孵育的实验组产生明显的荧光信号，活细胞标记和固定细胞标记结果无明显差别，并且重要的是在活细胞标记DNA实验过程是在免洗的条件下，不需要使DNA变性。该实验结果表明我们成功的在活细胞中基于光点击反应荧光响应的标记细胞DNA。

实施例6 探针具有细胞核靶向性

香豆素四唑CTz-SO₃具有细胞核靶向性的验证：

将A549细胞传代到培养皿中培养贴壁后，实验组加入100μM的香豆素四唑CTz-SO₃，对照组加入100μM的香豆素四唑CTz-El(实施例1制得)，孵育过夜，再加入新的培养液孵育2h后，分别用350nm紫外光照射10分钟后，激光共聚焦显微镜成像。实验结果如图7所示，从图中可以看出实验组荧光部位主要集中在细胞核，而加入CTz-El的对照组的荧光部位主要集中在细胞质，该实验结果表明带阴离子的香豆素四唑CTz-SO₃具有良好的细胞核靶向性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。