测量ERBB信号传导通路活性以诊断和治疗癌症患者的方法

相关申请

本申请要求2014年12月12日提交的美国临时专利申请号62/091,180的优先权，其内容通过引用并入在此。

发明背景

自从发现化学物质和外源蛋白质可以是针对特定细胞靶标的有效人类治疗剂以来，病变个体的治疗已取得重大进展。然而，许多常见疾病如癌症的治疗仍有很大的改善空间。人类基因组计划的主要驱动力之一是发现疾病的遗传学原因，以推动治疗干预的发展和处方。如果要相信报道，所有人类基因都通过人类基因组计划进行鉴定。这些基因中的许多与人类种群的疾病有统计学上的联系。然而，对疾病的遗传学联系或遗传生物标志物的检测的了解并不总是有效地预测疾病过程或治疗结果。因此，在确定适当的治疗过程上，这些基因的遗传联系且甚至其蛋白质表达水平的量化非常有限。

已经收集了拍字节量的遗传信息。大量的统计和分析建模计算能力已被应用于收集的遗传数据，以分析许多不同类型的疾病。从这个过程至少出现了两个重要的事实。首先，像乳腺癌这样的“疾病”是异质性的，部分原因是一个个体中的乳腺癌在基因组成、蛋白质表达水平和对治疗干预的应答上可以完全不同于另一个个体中的相同癌症。第二，当前遗传生物标志物的检测在大多数情况下具有较差的预测价值。

在考虑的具有特定限制数目的人类细胞模型的过程中发现和发展了同时期的靶向药物。这些细胞系中的许多被设计为提供潜在药物大型文库的优化筛选环境，以选择具有针对特定细胞靶标的所期望活性的那些。根据指示每个患者的疾病与其他患有相同疾病的患者不同的临床信息，关于潜在药物的疗效，采用这一过程可能引入歧途。迄今为止的药物发现和开发过程在临床试验之前鉴定有应答的人类上并不是非常有效，并且在整个临床开发过程中继续遭受高失效率。通过着重减少对患者伤害的监管性临床开发过程批准的许多药物在现行疾病患者群体中遭受差的有效率。

不是所有呈现给临床医师的疾病病况都是由相同的原因引起的。在一个简单的实例中，骨关节的炎症可以起因于几个来源，一些是内部的，一些是外部的，一些是“遗传连锁的”，以及一些原因还不明的。当可以正确鉴定外部病原体时，医学科学在针对感染性疾病对患者进行分类上是相当有效的。医师手头的可用于预测如下的工具较少，即当前可获得的治疗方案中哪种将导致来自内部原因的炎症减少。医师缺乏对如下各项的了解：特定患者的细胞如何发挥作用或(更适当地)不正常发挥作用，以及它们如何对可用于治疗临床表现为“炎症”的疾病的许多疗法之一作出应答。它们可能知道异常基因存在，但不知道如何影响特定患者的疾病进程。它们可能了解药物具体应该如何表现，但不知道为什么特定的患者可能对该药物活性无应答或有抗性。

患者需要更好地鉴定其特定的疾病原因并为有效的治疗过程做出更明智的决策。人类基因组测序和其他基因量化工具已经告知医生，每位患者的疾病对于那位患者来说有些独特。此信息已经产生了关于个体化用药的全部业务，其中每个患者都可以潜在地接受为其疾病定制的定制治疗方案。正在针对特定的基因相关疾病指征开发药物。此理想途径尚未得到验证，主要是由于当前预后工具集的显著缺点。这些基因可能存在，但它们在特定个体背景中的功能是不相关的。

对于实现如下的一个应答已经是伴随诊断的发展，即每个患者不同，并且治疗屡次未能产生积极应答。这种类型的诊断检验使用同时期的生物标志物检测工具进行设计，以尝试鉴定那些更可能对特定药物作出应答的患者。该检验涉及寻找增加的基因数目、基因突变或特定基因的表达水平的改变。例如，现今许多癌症借助于检验来诊断，以确定与该疾病相关的特定基因突变或过度表达的受体蛋白的存在。然而，大多数生物标志物检验仅提供关于该疾病及其潜在原因的间接和推断信息。因此，这些检验中的大多数在预测显著治疗应答方面的成功率通常远低于50％。

因此，仍然需要为个体针对治疗有效性提供更好的诊断测定和更好的预后指标。

发明概述

生物标志物用于诊断疾病和作为治疗决策的基础的用途受限于没有评估涉及疾病的信号传导通路的活性的事实。因此，本发明提供了诊断方法，其中基于患者的病变细胞的生理活性的变化来评估涉及疾病的一条或多条信号传导通路。因此，本发明允许确定特定的信号传导通路是否在患者的病变细胞中是有活性的，使得可以基于此生理活性而不是基于实际上可能不指示信号传导通路是否牵涉在疾病过程中的生物标志物(例如细胞表面受体)的表达选择治疗方案。特别地，本发明提供了鉴定“生物标志物阴性”但是具有牵涉在疾病过程中的活性信号传导通路的患者的方法。这允许用影响信号该传导通路的靶向治疗剂选择和治疗先前基于其生物标志物阴性状态绕过此类治疗的患者。例如，本发明提供了鉴定具有ErbB2阴性癌症但具有活性ErbB信号传导通路的患者，使得可以选择那些患者用影响ErbB信号传导通路的靶向治疗剂进行治疗，而在本发明之前，针对用ErbB靶向疗法进行的治疗那些患者将被忽视。这反映了靶向ErbB2的药物的FDA标签仅被批准用于具有过度表达或扩增的ErbB2受体的患者的事实。同样，本发明提供了鉴定具有雌激素受体(ER)阴性癌症但具有活性ER信号传导通路的患者，使得可以选择那些患者用影响ER信号传导通路的靶向治疗剂(例如激素疗法)进行治疗，而在本发明之前，针对ER相关疗法(例如激素疗法)那些患者将被忽视。因此，本发明显著扩大了可以从接受用靶向治疗剂进行的治疗中受益的患者群体。

本发明的一个方面提供了诊断和治疗受试者中与病变细胞的异常信号传导通路相关的疾病的方法，其中该受试者是该疾病生物标志物阴性的，该方法包含；

制备从受试者获得的活的原代病变细胞(primary diseased cells)的样品并在基础培养基中培养该样品；

在与干扰剂(perturbing agent)接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替；

使病变细胞与已知选择性地影响与该疾病相关的信号传导通路的干扰剂接触，以便上调或下调信号传导通路，如通过相对于未与干扰剂接触的细胞在生理应答参数上的变化(例如对细胞粘附或附着的影响)来测量的；

连续测量与干扰剂接触的活病变细胞的诸如细胞粘附或附着的生理应答参数；并且

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定已在病变细胞中发生的生理应答参数的变化量，

将该被测变量与从信号传导通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较

其中针对与异常信号传导通路相关的疾病诊断该受试者，并且当被测变量大于截止值时可以选择该受试者来用影响信号传导通路的靶向疗法进行治疗。

与合适的对照相比，该变化可以是例如细胞粘附或附着的增加或减少。

在一个实施例中，该疾病是癌症，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、头颈癌或胃癌。还包罗与异常信号传导通路相关的其他类型的疾病，例如自身免疫性疾病和感染性疾病。

在一个实施例中，该疾病是癌症，并且因此病变细胞是肿瘤细胞的样品，并且健康细胞是与肿瘤细胞相同细胞类型的非肿瘤细胞的样品。在优选的实施例中，癌症是乳腺癌。在用于诊断乳腺癌的一个实施例中，干扰剂选择性地影响PI3K信号传导通路，例如NRG1。在用于诊断乳腺癌的一个实施例中，干扰剂选择性地影响ERα信号传导通路，例如雌二醇。在用于诊断乳腺癌的另一个实施例中，干扰剂选择性地影响ErbB信号传导通路，例如HER2信号传导通路。选择性影响ErbB信号传导通路的药剂是本领域已知的。

在不同实施例中，信号传导通路选自下组，该组由以下各项组成：MAPK-PK、RAS/RAF、RHO、FAK1、MEK/MAPK、MAK、MKK、AKT、EGF受体、Her2受体、Her3受体、Her4受体、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、GPER30、PIK3/PTEN、VEGF受体通路抑制剂、细胞粘附、TGFβ/SMAD、WNT、Hedgehog/GLI、HIF1α、JAK/STAT、Notch、G1/S转换控制、DNA损伤控制和细胞凋亡。另外的合适的信号传导通路包括本文公开的其他信号传导通路。在不同实施例中，干扰剂可以是例如蛋白质、肽、核酸、代谢物、配体、试剂、有机分子、信号传导因子、生长因子、生物化学物质或其组合。

被测变量一般被定义为检验中旨在测量的量。对于本文所述的发明，旨在测量的量是活细胞对干扰的生理应答的变化。如本文进一步描述的，细胞粘附或附着是可以用阻抗生物传感器或光学生物传感器测量的细胞的生理变化的实例。在一个实施例中，被测变量表示干扰的细胞样品的细胞粘附或附着的变化，并使用欧几里德(Euclidean)分析进行评定。欧几里德分析可以选自下组，该组由以下各项组成：多个时间点的差分向量的算术求和、时间最大值、时间最小值、达到最大值或最小值的时间、斜率变化、生物传感器信号的绝对下降、所有测量的总体、及其组合。在另一个实施例中，通过时间最大值或最小值的变化来测量细胞粘附或附着的变化。在优选实施例中，通过应用如下所述的算法来执行被测变量计算。

对于不同细胞条件(细胞+培养基，细胞+干扰因子F，细胞+确认剂+干扰因子F)，每分钟记录时间点与阻抗信息至少240分钟。根据疾病机制可以使用多于一种干扰因子F；在疾病沿着多个相关通路传播的情况下，单独或组合地干扰多个通路中的每个可能是有用的。例如，ErbB2癌症涉及ErbB家族受体和相关通路-MAPK和PI3K通路。在多个通路被干扰的情况下，被测变量将是为每个通路确定的单独被测变量的组合。将对应于这些条件的差异的向量相加以根据下面详细示出的方程式提供被测变量(也称为NED，非线性欧几里德距离)。

用于从时间与CAS检验数据衍生的非线性欧几里德时间点向量计算被测变量的方程式：

其中变量被如下定义：

i＝在检验期间每分钟记录的CAS步数

F1＝干扰因子1

F2＝干扰因子2(如果使用一种)

C_i＝对照，无干扰因子加入检验细胞中

CF1_i＝具有干扰因子1(F1)的细胞

CF2＝具有干扰因子2(F2)(如果使用一种的话)的细胞

CCF1_i＝具有HER2通路确认剂(confirming>

CCF2＝具有HER2通路确认剂添加的细胞(如果使用干扰因子2)

可以选择多种确认因子来执行这些步骤。

本发明包罗一个实施例，借此被测变量算法的简化版本也可以提供有用的信息。例如：

或者

或者

另外，任何上述算法中的求和的极限可以扩展到i>240或i<240以进一步增强分析而不损失分析的价值。

在另一个实施例中，使病变细胞进一步与靶向和该疾病相关的信号传导通路的确认剂接触，并且测量确认剂对细胞粘附或附着的影响。合适的确认剂是本领域技术人员已知的。选择确认剂，因为已知在与感兴趣的疾病机制相关的通路中的点抑制感兴趣的信号传导通路。此实施例使得可以量化生理应答的量，所述生理应答由病变细胞与干扰剂的接触引起，与感兴趣的信号传导通路相关联。这使得能够确认测量的生理应答是否对感兴趣的信号传导通路是特异性的。

在又另一个实施例中，使病变细胞进一步与靶向和该疾病相关的信号传导通路的靶向治疗剂接触，并且测量靶向治疗剂对细胞粘附或附着的影响。

靶向治疗剂的非限制性实例包括曲妥珠单抗、培妥珠单抗、拉帕替尼、多西紫杉醇、他莫昔芬、顺铂、阿伐沙林、紫杉醇注射液、布洛司他韦韦多顿、依维莫司、培美曲塞、依西美坦、奥美单抗、贝伐珠单抗、安非他明、伊立替康、比卡鲁胺、奥沙利铂、西妥昔单抗、维莫德吉(visomedegib)、柠檬酸托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊马替尼、伊沙匹隆、托泊替康(topeotecan)、阿西替尼、罗米地辛、卡巴他赛(cabrazitaxel)、索拉菲尼、英夫利昔单抗、来那度胺、利妥昔单抗、达沙替尼、舒尼替尼、厄洛替尼、尼罗替尼、紫杉醇、替莫唑胺、三氧化物、帕尼单抗、硼替佐米、阿扎胞苷、帕唑帕尼、克唑替尼、卡培他滨、伊匹单抗、威罗菲尼、醋酸戈舍瑞林、阿比特龙、BH3模拟物、纳曲霉素、阿那曲唑、来曲唑、芳香酶抑制剂、环磷酰胺、多柔比星、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、伊沙匹隆、卡铂、阿柏西普、替西罗莫司、替伊莫单抗(irbritumomab)、阿比特龙、库司替森、来那替尼(neratinib)、恩杂鲁胺、纳武单抗(nivolumab)、帕博西尼(palbociclib)、瑞格非尼(regorafenib)、恩替诺特(entinostat)、阿法替尼、ARN-509、ARN-810、BIND-014、达拉菲尼、达妥木单抗(daratumumab)、兰布罗利珠单抗、LDK378、MM-121、sym004、曲妥珠单抗-恩他新(trastuzumab-emtansine)、替沃扎尼(tivozanib)、曲美替尼、阿西替尼、LY2835219、MPDL320A、奥比珠单抗(obinutuzumab)、Sym004、托西莫单抗、曲美替尼、奈昔木单抗(necitumumab)、雷米珠单抗、ADXS-HER2、TAK-285、MM-302、MM-121、MM-111、REGN 1400、萨帕替尼(sapatinib)、达克替尼(dacomitinib)、波齐奥替尼(poziotinib)、ASLAN001、LIM716、AV-203、杜丽高妥珠单抗(duligotuzumab)、卢姆雷妥珠单抗(lumretuzumab)、帕尼单抗、REGN955、MM-151、吉非替尼、U3-1287(AMG888)、TK-A3/TK-A4、AZD9291、罗奇利尼及其组合。本文公开了其他合适的靶向治疗剂。在又另一个实施例中，该方法进一步包含向受试者给予靶向治疗剂。

在另一方面，本发明提供了选择具有非过表达的雌激素受体α(ERα-阴性)乳腺癌患者用于影响雌激素相关信号传导通路的靶向疗法(例如激素疗法)的方法，其包含：

制备从具有非过表达的ERα(ERα阴性)乳腺癌的受试者获得的活的原代乳腺癌细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

使活的原代乳腺癌细胞与已知选择性影响ERα信号传导通路的干扰剂接触，以便上调或下调信号传导通路，如通过对诸如细胞粘附或附着的生理应答参数的影响来测量的；并且(2)将样品的第二部分与该干扰剂和已知抑制相同雌激素相关信号传导通路活性的确认剂接触；

连续测量样品的每个部分中活的原代乳腺癌细胞的诸如细胞粘附或附着的生理应答参数；并且

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异；并且

将该被测变量与从雌激素受体通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时选择受试者用影响雌激素相关信号传导通路的靶向疗法进行治疗。

在一个实施例中，该方法包含在使样品与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替。

被测变量可以是例如与未干扰的活的癌细胞样品相比，与干扰剂接触的活的癌细胞样品的部分中的细胞粘附或附着的增加或减少，或在与干扰剂和确认剂接触之后活细胞样品的部分中的细胞粘附或附着的增加或减少。影响ERα信号传导通路的合适的干扰剂是本领域已知的并且在本文中公开，例如雌二醇。在另一个实施例中，使活肿瘤细胞进一步与已知抑制ERα信号传导通路的确认剂接触，并测量确认剂对细胞粘附或附着的影响。合适的确认剂，例如选择性雌激素受体下调剂，是本领域技术人员已知的。在另一个实施例中，使活肿瘤细胞进一步与靶向ERα信号传导通路的靶向治疗剂接触，并测量靶向治疗剂对细胞粘附或附着的影响。靶向ERα信号传导通路的合适的靶向治疗剂是本领域已知的并且在本文中公开，例如氟维司群和他莫昔芬。该方法可以进一步包含向受试者给予靶向治疗剂。

在又另一方面，本发明提供了选择具有非过表达或扩增的ErbB2癌(例如乳腺癌)的受试者用影响ErbB信号传导通路的靶向治疗剂治疗的方法，该方法包含：

制备从受试者获得的活的原代癌细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

使从受试者获得的(1)活癌细胞的样品的第一部分与神经调节蛋白接触，并且使(2)样品的第二部分与神经调节蛋白和确认剂接触，其中该确认剂选择性地抑制与神经调节蛋白相同的ErbB信号传导通路；和/或使(3)样品的第三部分与表皮生长因子接触，并且使(4)样品的第四部分与表皮生长因子和确认剂接触，其中该确认剂选择性地抑制与表皮生长因子相同的ErbB信号传导通路；

连续测量样品的每个部分中活的原代癌细胞的生理应答参数；

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异和/或样品的第三部分和样品的第四部分之间的值上的差异；并且

将该被测变量与从ErbB信号传导通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时选择受试者用影响ErbB信号传导通路的靶向治疗剂进行治疗。

在一个实施例中，该方法包含在使样品与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替。

被测变量可以是例如与未干扰的活的癌细胞样品相比，与干扰剂接触的活的癌细胞样品的干扰部分中的细胞粘附或附着的增加或减少，或在与干扰剂和确认剂接触之后活细胞样品的部分中的细胞粘附或附着的增加或减少。

影响ErbB信号传导通路的其他合适的干扰剂是本领域已知的并且在本文中公开。在另一个实施例中，使肿瘤细胞进一步与靶向ErbB信号传导通路的靶向治疗剂接触，并测量靶向治疗剂对细胞粘附或附着的影响。靶向ErbB信号传导通路的合适靶向治疗剂是本领域已知的并且在本文中公开。该方法可以进一步包含向受试者给予靶向治疗剂。

在另一方面，本发明提供了通过给予靶向治疗剂来治疗受试者的方法，其中受试者已被选择使用本发明的用以确定信号传导通路是否在受试者的细胞中有活性的方法进行治疗。因此，本发明提供了用靶向特定信号传导通路的靶向治疗剂来治疗具有生物标志物阴性癌症的受试者的方法，其中该受试者已被选择进行治疗，因为受试者已显示具有活性信号传导通路，尽管具有生物标志物阴性癌。

因此，在一个实施例中，本发明提供了治疗具有(例如，诊断患有)癌症的其癌症细胞具有非过表达的未扩增的ErbB2受体的人类受试者的方法，该方法包含向受试者给予影响ErbB信号传导通路的靶向治疗剂，其中该受试者已被选择使用包含以下的方法进行治疗：

制备从受试者获得的活的原代癌细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

使从受试者获得的(1)活的原代癌细胞的样品的第一部分与干扰剂接触，使(2)样品的第二部分与干扰剂和确认剂接触，其中干扰剂选择性地影响ErbB信号传导通路且确认剂选择性地抑制干扰剂对相同ErbB信号传导通路的影响；

连续测量样品的每个部分中活的原代癌细胞的生理应答参数；

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异；并且

将该被测变量与从ErbB信号传导通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时选择受试者用影响ErbB信号传导通路的靶向治疗剂进行治疗。

在一个实施例中，该方法包含在使样品与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替。

在不同实施例中，干扰剂选自下组，该组由以下各项组成：EGF、TGF-α、HB-EGF、双调蛋白、乙胞素(betacellulin)、上皮细胞有丝分裂蛋白(epigen)、外调蛋白、神经调节蛋白-1、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-3、神经调节蛋白-4及其组合。在一个实施例中，该方法包含：

使从受试者获得的(1)活癌细胞的样品的第一部分与神经调节蛋白接触，并且使(2)样品的第二部分与神经调节蛋白和确认剂接触，其中该确认剂选择性地抑制与神经调节蛋白相同的ErbB信号传导通路；和/或使(3)样品的第三部分与表皮生长因子接触，并且使(4)样品的第四部分与表皮生长因子和确认剂接触，其中该确认剂选择性地抑制与表皮生长因子相同的ErbB信号传导通路；并且

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异和/或样品的第三部分和样品的第四部分之间的值上的差异。

该方法可以进一步包含将活的原代癌细胞与干扰剂和靶向ErbB信号传导通路的靶向治疗剂接触，并测量靶向治疗剂对生理应答参数的影响。

在一个实施例中，生理应答参数是细胞粘附或附着。在另一个实施例中，生理应答参数是细胞代谢物的水平。在另一个实施例中，生理应答参数是与线粒体功能相关的细胞酶水平。

在一个实施例中，受试者具有非过表达的未扩增的HER2癌。在另一个实施例中，受试者具有EGFR阴性和HER2阴性癌症。在另一个实施例中，受试者具有非过表达的未扩增的ErbB2乳腺癌。在其他实施例中，受试者具有选自下组的非过表达的未扩增的ErbB癌，该组由以下各项组成：结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤和甲状腺癌。

在一个实施例中，确认剂是2C4小鼠单克隆抗体。在另一个实施例中，确认剂结合到选自下组的位点，该组由以下各项组成：HER2细胞外区段的结构域II；HER2细胞外区段的结构域IV；EGFR或HER2或HER3或HER4的胞质腺苷三磷酸结合位点；EGFR或HER2的腺苷三磷酸结合位点中的半胱氨酸残基；及其组合。

在一个实施例中，靶向治疗剂是拉帕替尼。在另一个实施例中，靶向治疗剂选自下组，该组由以下各项组成：曲妥珠单抗、培妥珠单抗、阿法替尼、来那替尼(neratinib)、ADXS-HER2、TAK-285、MM-302、MM-121、MM-111、REGN 1400、萨皮替尼(sapitinib)、达克替尼(dacomitinib)、波齐奥替尼(poziotinib)、ASLAN001、LIM716、AV-203、杜丽高妥珠单抗(Duligotuzumab)、卢姆雷妥珠单抗(lumretuzumab)、帕尼单抗、REGN955、MM-151、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、曲妥珠单抗-恩他新(trastuzumab-emtansine)及其组合。在其他实施例中，靶向治疗剂结合到选自下组的位点，该组由以下各项组成：HER2细胞外区段的结构域II；HER2细胞外区段的结构域IV；EGFR或HER2或HER3或HER4的胞质腺苷三磷酸结合位点；EGFR或HER2的腺苷三磷酸结合位点中的半胱氨酸残基；及其组合。

在另一个实施例中，受试者也用不影响ErbB信号传导通路的治疗剂进行治疗，例如用标准化疗剂或用影响与ErbB不同的信号传导通路的不同靶向治疗剂。

在另一个实施例中，本发明提供了治疗具有(例如，诊断具有)非过表达的未扩增的ErbB2乳腺癌的人类受试者的方法，该方法包含向该受试者给予拉帕替尼，其中该受试者已被选择用拉帕替尼使用包含以下的方法进行治疗；

制备从受试者获得的活的原代乳腺癌细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

在使样品与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替；

使从受试者获得的(1)活癌细胞的样品的第一部分与作为干扰剂的神经调节蛋白接触，并且使(2)样品的第二部分与神经调节蛋白和确认剂接触，其中该确认剂选择性地抑制与神经调节蛋白相同的ErbB信号传导通路；和/或使(3)样品的第三部分与作为干扰剂的表皮生长因子接触，并且使(4)样品的第四部分与表皮生长因子和确认剂接触，其中该确认剂选择性地抑制与表皮生长因子相同的ErbB信号传导通路；

连续测量与干扰剂接触的活的原代乳腺癌细胞的细胞粘附或附着；

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异和/或样品的第三部分和样品的第四部分之间的值上的差异；并且

将该被测变量与从ErbB通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时，选择受试者用拉帕替尼治疗。

上述相同的方法可以应用于除拉帕替尼以外的靶向治疗剂。因此，在其他实施例中，靶向治疗剂选自下组，该组由以下各项组成：曲妥珠单抗、培妥珠单抗、阿法替尼、来那替尼(neratinib)、ADXS-HER2、TAK-285、MM-302、MM-121、MM-111、REGN 1400、萨皮替尼(sapitinib)、达克替尼(dacomitinib)、波齐奥替尼(poziotinib)、ASLAN001、LIM716、AV-203、杜丽高妥珠单抗(Duligotuzumab)、卢姆雷妥珠单抗(lumretuzumab)、帕尼单抗、REGN955、MM-151、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、曲妥珠单抗-恩他新(trastuzumab-emtansine)及其组合。在其他实施例中，靶向治疗剂结合到选自下组的位点，该组由以下各项组成：HER2细胞外区段的结构域II或另一ErbB家族成员的同源结构域；HER2细胞外区段的结构域IV或另一ErbB家族成员的同源结构域；EGFR或HER2或HER3或HER4的胞质腺苷三磷酸结合位点；EGFR或HER2的腺苷三磷酸结合位点中的半胱氨酸残基；及其组合。

在一个实施例中，受试者具有EGFR阴性和HER2阴性乳腺癌。

在一个实施例中，受试者也用不影响ErbB信号传导通路的治疗剂进行治疗，例如用标准化疗剂或用影响与ErbB不同的信号传导通路的不同靶向治疗剂。

在另一个实施例中，本发明提供了治疗具有(例如，诊断具有)非过表达的雌激素受体(ER)乳腺癌的人类受试者的方法，该方法包含向受试者给予影响ER信号传导通路的靶向治疗剂，其中该受试者已被选择使用包含以下的方法进行治疗：

制备从受试者获得的活的原代乳腺癌细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

使从受试者获得的(1)活的原代乳腺癌细胞的样品的第一部分与已知上调或下调雌激素相关信号传导通路的干扰剂接触，并且(2)使活的原代癌细胞样品的第二部分与该干扰剂和已知抑制相同雌激素相关信号传导通路活性的确认剂接触；

连续测量样品的每个部分中活的原代癌细胞的生理应答参数；

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异；

将该被测变量与从雌激素受体通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时选择受试者用影响雌激素相关信号传导通路的靶向治疗剂进行治疗。

在一个实施例中，该方法包含在使样品与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替。

该方法可以进一步包含使原代乳腺癌细胞与靶向ER信号传导通路的靶向治疗剂接触，并测量靶向治疗剂对生理应答参数的影响。

在一个实施例中，生理应答参数是细胞粘附或附着。在另一个实施例中，生理应答参数是细胞代谢物的水平。在另一个实施例中，生理应答参数是与线粒体功能相关的细胞酶水平。

在一个实施例中，受试者具有ERα阴性乳腺癌。

在一个实施例中，干扰剂选自下组，该组由以下各项组成：雌二醇、雌酮、雷洛昔芬、雌三醇、染料木素、DHEA、雄烯二酮、雄烯二醇、孕酮、羟孕酮、睾酮、其硫酸化形式及其组合。

在一个实施例中，靶向治疗剂选自下组，该组由以下各项组成：氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、帕博西尼、阿贝马西尼(abemaciclib)及其组合。在其他实施例中，靶向治疗剂结合到选自下组的位点，该组由以下各项组成：芳香酶(CYP19A)的细胞色素P450亚基、雌激素受体的活化功能1(AFP-1)结构域、细胞周期蛋白依赖性激酶4(细胞周期蛋白D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶6(细胞周期蛋白D3)及其组合。

在一个实施例中，受试者也用不影响ER信号传导通路的治疗剂进行治疗，例如用标准化疗剂或用影响与ER不同的信号传导通路的不同靶向治疗剂。在一个实施例中，受试者也用选自下组的疗法进行治疗，该组由以下各项组成：化学疗法、CDK4/CDK6抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂及其组合。在一个实施例中，用影响ErbB信号传导通路的靶向治疗剂治疗受试者。例如，在一个实施例中，受试者以前已经接受雌激素相关的靶向疗法并且未能对其作出应答，并且然后用影响ErbB信号传导通路的靶向疗法剂治疗，其中用影响ErbB信号传导通路的靶向疗法剂治疗增强雌激素相关靶向疗法的功能。

一些药物正靶向特定的基因相关疾病指征。这种途径还没有得到广泛的利用，主要是由于当前的预测工具集的显著缺点。本文所述的试剂盒和方法提供了选择针对个体疾病显示功效的治疗剂的方法。在某些实施例中，使治疗剂与来自细胞应答测量系统(CReMS)中的病变组织的无标签的活的全细胞接触，并且在治疗剂的存在下检测细胞生理参数的变化或其缺乏。选择治疗剂来治疗受试者，与基线测量相比，其导致疾病细胞生理参数的变化。

因此，一方面，本发明提供了在初始诊断时或整个治疗期间选择一种或多种治疗剂的方法。在某些实施例中，治疗剂被商业上批准用于治疗个体的疾病或紊乱。该方法包含在细胞应答测量系统中向来自受试者的至少一个分离的疾病细胞样品给予一种或多种治疗剂；确定与给予该一种或多种治疗剂之前的细胞应答参数的基线测量相比，疾病细胞样品的细胞应答参数是否应答于该一种或多种治疗剂发生变化，其中细胞应答参数的变化表示该一种或多种治疗剂对个体受试者的疾病具有治疗功效。在某些实施例中，分离的疾病细胞样品包含无标签的全细胞。在某些实施例中，在指定时间段内连续监测分离的疾病细胞中的细胞应答参数的变化。在其他实施例中，该方法进一步包含选择导致至少一种细胞应答或生理参数变化的治疗剂或治疗剂组合，并将所选择的药剂传递给医疗保健提供者。在其他实施例中，该方法进一步包含将导致至少一种细胞应答或生理参数变化的治疗剂或治疗剂组合给予受试者。

在其他实施例中，用于选择用以治疗个体受试者的方法包含确定用在个体受试者的疾病上的药剂的治疗功效，其包含在细胞应答测量系统(CReMS)中将该药剂给予来自个体受试者的至少一种分离的无标签疾病细胞样品，其中该疾病细胞样品选自下组，该组由以下各项组成：癌细胞样品、来自患有自身免疫性疾病的受试者的细胞样品、来自被外来物质感染的组织的细胞样品及其组合；在指定时间段内连续测量在治疗剂的存在下细胞样品的至少一种生理应答参数的变化；并且确定细胞样品针对药剂的生理应答参数与基线测量相比的变化是否发生，其中生理应答的变化指示该药剂对个体受试者的疾病具有治疗功效。

在其他实施例中，用以选择用于具有癌症的个体受试者的治疗的方法包含确定用在个体受试者的癌症上的药剂的治疗功效，其包含：在生物传感器中将该药剂给予来自个体受试者的至少一种分离的无标签癌症细胞样品；在指定时间段内连续测量在治疗剂的存在下细胞样品的至少一种生理应答参数的变化；并且选择用于治疗受试者的治疗剂，其展现与基线测量相比细胞样品的生理应答参数变化。

在另一方面，本发明提供了确定从个体受试者获得的病变细胞中的细胞通路的功能状态的方法，该方法是通过使从受试者获得的病变细胞样品与已知激动细胞通路或在该通路发挥作用时拮抗细胞通路的干扰剂接触进行。可以在样品的活细胞中连续测量一个或多个生理应答参数。可以使用对连续测量的分析来确定在干扰剂存在下，相对于合适的对照，病变细胞样品中是否发生一个或多个生理应答参数的变化。在干扰剂存在下，相对于合适的基线或对照的一个或多个生理应答参数的变化指示，干扰剂所靶向的细胞通路在个体受试者中起作用。

在另一方面，本发明提供了确定由已知影响信号传导通路的药剂引起的通路干扰的量的方法，该药剂对于感兴趣的信号传导通路是特异性的。在此实施例中，使病变细胞样品与干扰剂和确认剂接触，这两者已知都会影响信号传导通路。测量生理应答参数，并确定相对于仅与干扰剂接触的细胞样品的变化。确认药剂抑制的信号传导通路活性的量对应于感兴趣的信号传导通路活性的量。如果干扰剂对于信号传导通路不是非常特异的，并且除了感兴趣的信号传导通路之外还引发其他细胞信号传导活性，则确认剂将不能抑制由干扰剂引发的其他细胞活性。因此，确认剂提供了确定由细胞样品与感兴趣的信号传导通路相关的干扰剂接触导致的生理应答参数变化的量的方法。这是为了在干扰剂引发与感兴趣的信号传导通路无关的活性的情况下限制假阳性结果的目的。

另一方面，本发明提供了选择用于个体受试者的靶向治疗剂的方法，该方法是通过如下进行：使从受试者获得的病变细胞样品与已知激动细胞通路或在该通路发挥作用时拮抗细胞通路的干扰剂接触，连续测量样品中活细胞的一个或多个生理应答参数，并且通过对连续测量的分析来确定在干扰剂存在下，相对于合适的基线或对照，病变细胞样品中是否发生一个或多个生理应答参数的变化，其中在干扰剂存在下，相对于合适的基线或对照的一个或多个生理应答参数的变化指示，受试者将对靶向细胞通路的靶向治疗剂有应答。

在一个实施例中，前述方法还可以涉及向受试者给予靶向治疗剂。

在某些实施例中，生理应答参数可以是细胞粘附、细胞附着、细胞形态、细胞增殖、细胞信号传导、细胞密度、细胞大小、细胞形状、细胞极性、pH、O₂、CO₂、葡萄糖及其组合。例如，生理应答参数可以是细胞粘附或附着。

在一个实施例中，该干扰剂靶向包括如下的一个或多个细胞通路：MAPK-PK、RAS/RAF、RHO、FAK1、MEK/MAPK、MAK、MKK、AKT、EGF受体、Her2受体、Her3受体、Her4受体、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、GPER30、PIK3/PTEN、VEGF受体通路抑制剂、细胞粘附、TGFβ/SMAD、WNT、Hedgehog/GLI、HIF1α、JAK/STAT、Notch、G1/S转换控制、DNA损伤控制和细胞凋亡。干扰剂可以是例如蛋白质、肽、核酸、代谢物、配体、有机分子、信号传导因子、生物化学物质或其组合。在一个实施例中，干扰剂靶向涉及在细胞周期调节中的细胞通路组分，其选自下组，该组由以下各项组成：CDK4、CDK6、PD-1、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白C、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白F、以及G1/S细胞周期蛋白。

在某些实施例中，靶向治疗剂可以包括以下中的一种或多种：曲妥珠单抗、培妥珠单抗、拉帕替尼、多西紫杉醇、他莫昔芬、顺铂、阿伐沙林、紫杉醇注射液、布洛司他韦韦多顿、依维莫司、培美曲塞、依西美坦、奥美单抗、贝伐珠单抗、安非他明、伊立替康、比卡鲁胺、奥沙利铂、西妥昔单抗、维莫德吉(visomedegib)、柠檬酸托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊马替尼、伊沙匹隆、托泊替康(topeotecan)、阿西替尼、罗米地辛、卡巴他赛(cabrazitaxel)、索拉菲尼、英夫利昔单抗、来那度胺、利妥昔单抗、达沙替尼、舒尼替尼、厄洛替尼、尼罗替尼、紫杉醇、替莫唑胺、三氧化物、帕尼单抗、硼替佐米、阿扎胞苷、帕唑帕尼、克唑替尼、卡培他滨、伊匹单抗、威罗菲尼、醋酸戈舍瑞林、阿比特龙、BH3模拟物、纳曲霉素、阿那曲唑、来曲唑、芳香酶抑制剂、环磷酰胺、多柔比星、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、伊沙匹隆、卡铂、阿柏西普、替西罗莫司、替伊莫单抗(irbritumomab)、阿比特龙、库司替森、来那替尼(neratinib)、恩杂鲁胺、纳武单抗(nivolumab)、帕博西尼(palbociclib)、瑞格非尼(regorafenib)、恩替诺特(entinostat)、阿法替尼、ARN-509、ARN-810、BIND-014、达拉菲尼、达妥木单抗(daratumumab)、兰布罗利珠单抗、LDK378、MM-121、sym004、曲妥珠单抗-恩他新(trastuzumab-emtansine)、替沃扎尼(tivozanib)、曲美替尼、阿西替尼、LY2835219、MPDL320A、奥比珠单抗(obinutuzumab)、Sym004、托西莫单抗、曲美替尼、奈昔木单抗(necitumumab)、雷米珠单抗及其组合。

在一个实施例中，病变细胞样品是癌细胞样品，例如乳腺癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤和甲状腺癌或头颈癌。

在一些实施例中，可以使用非线性欧几里德分析来评定一个或多个生理应答参数的变化。例如，一个或多个生理应答参数的变化可以使用分析方法进行评定，该分析方法包括多个时间点的差分的算术求和、时间最大值、时间最小值、达到最大值或最小值的时间、斜率变化、生物传感器信号的绝对下降、所有测量的总体或其组合。在一个实施例中，通过时间最大值或最小值的变化来测量一个或多个生理应答参数的变化。

在另一方面，本发明提供了鉴定个体受试者中受干扰和/或治疗剂影响的细胞通路组分的方法。这些方法涉及使从受试者获得的分离的无标签细胞样品与干扰剂和/或治疗剂接触，通过连续测量样品中活细胞的至少一个生理应答参数来监测药剂的影响，通过对连续测量的分析确定生理应答参数是否发生变化，从而表征样品对该一种或多种药剂的敏感性，并且使用选自以下的方法分析由该一种或多种药剂靶向的细胞通路的组分：蛋白质组学、qPCR、基因组学、RNA定量、串联液相色谱-质谱和代谢组学，从而确定细胞样品中干扰剂和/或治疗剂的存在是否会改变细胞通路的组分。在一个实施例中，在分析细胞通路组分之前停止干扰剂对样品的活性。

在另一个实施例中，本发明提供了确定检验的截止值的方法，该检验鉴定可能或不可能对靶向治疗剂作出应答的患者。此方法可以涉及选择一组患者，每个患者具有相同的疾病，并且处方以相同的治疗剂；从一组患者内的每个受试者导出检验值，其中该检验值结果来自对在用治疗剂和/或干扰剂治疗期间患者细胞样品中的一个或多个生理应答参数的连续测量的分析；在足以使所检验的全部患者中相当大的百分比达到预定临床终点的一段时间内，观察检验的患者组中每个成员的健康状况；记录每个患者达到预定临床终点(如果达到的话)所需的时间长短；鉴定两个或更多个在值上彼此等距的候选截止值，其中每个候选截止值表示如下的一个值，该值低于患者被预测为应答或不应答的值并且高于患者被预测为以与评分低于截止值的人相反的方式应答的值；使用统计学方法来分析检验值在截止值或以下的患者的临床终点期和检验值高于截止值的患者的临床终点期之间的差异；并且在候选截止值组中选择导致最大百分比的患者被预测不对疗法作出应答的截止值，其指示在高于和低于截止值的患者组之间存在统计学显著的差异。

在另一方面，本发明提供了通过记录具有相同疾病并用相同治疗剂检验的一组个体受试者的检验结果值来预测治疗剂对个体受试者的功效的方法，并且确定个体受试者的检验值的百分等级，其中个体受试者的检验值的百分等级预测了治疗剂对个体受试者中的疾病的功效。在一个实施例中，该方法包括将所记录的检验结果值编译成列表，并且基于个体受试者的检验结果值对列表进行排序，这些值是基于每名个体受试者的绝对数值检验值检验的。

在另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：用于来自个体受试者的疾病细胞样品的含有转运介质的容器；用于来自个体受试者的对照细胞样品的含有转运介质的容器；生物传感器；以及具有用于将来自生物传感器的数据转换成输出的计算机可执行指令的非暂时计算机可读介质，其中该输出在限定的时间段内显示细胞生理应答参数的变化，其中该细胞生理应答参数选自下组，该组由以下各项组成：pH、细胞粘附、细胞附着模式、细胞增殖、细胞信号传导、细胞存活、细胞密度、细胞大小、细胞形状、细胞极性、O₂、CO₂、葡萄糖、细胞周期、合成代谢、分解代谢、小分子合成和产生、代谢回转、以及呼吸作用、ATP、钙、镁和其他带电离子、蛋白质、特异性通路成员分子、不同细胞区室中的DNA和/或RNA、基因组学和蛋白质组学、翻译后修饰和机制、第二信使水平、cAMP、mRNA、RNAi、microRNA和其他具有生理功能的RNA、及其组合；将输出分类为无应答、应答较弱、以及有应答；并产生分类的报告。

在又另一方面，本发明提供了鉴定个体受试者中受干扰和/或治疗剂影响的细胞通路组分的方法，该方法包含：

使从受试者获得的分离的无标签细胞样品与干扰剂和/或治疗剂接触；

通过连续测量样品中活细胞的至少一个生理应答参数来监测药剂的影响；

通过对连续测量的分析确定生理应答参数是否发生变化，从而表征样品对该一种或多种药剂的敏感性；

停止干扰剂对样品的活性；并且

使用选自以下的方法分析由该一种或多种药剂靶向的细胞通路的组分：蛋白质组学、qPCR、基因组学、RNA定量、串联液相色谱-质谱和代谢组学，从而确定细胞样品中干扰剂和/或治疗剂的存在是否会改变细胞通路的组分。

在又另一方面，本发明提供了确定从个体受试者获得的病变细胞中的细胞通路的功能状态的方法，其目的是在功能水平上定义其疾病，该方法包含：

使从受试者获得的病变细胞样品与已知激动细胞通路或在该通路发挥作用时拮抗细胞通路的干扰剂接触；

测量样品中活细胞的一种或多种生理应答参数；并且

通过对测量的分析来确定在干扰剂存在下，相对于合适的基线或对照，病变细胞样品中是否发生一种或多种生理应答参数的变化；

其中在干扰剂存在下，相对于合适的基线或对照的一个或多个生理应答参数的变化指示，干扰剂所靶向的细胞通路在个体受试者中是异常或正常的。

测量步骤可以是例如连续测量或间歇地测量样品的活细胞中的一个或多个生理应答参数

在又另一方面，本发明提供了评估作为靶向治疗剂的第一药剂是否对其旨在从受试者获得的活的癌细胞的样品中解决的信号传导通路有影响，以便确定在受试者的癌细胞中靶向治疗剂是否是功能性的方法，该方法包含：

制备从受试者获得的活的原代癌细胞的样品并在基础培养基中培养它们；

在与药剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替；

使该样品与第一药剂接触，并与已知选择性地影响第一药剂旨在解决的信号传导通路的第二药剂接触，以便上调或下调信号传导通路，如通过对细胞粘附或附着的影响测量的；

相对于从受试者获得的与单独的第一药剂或第二药剂接触的活的癌细胞的样品，连续地测量与第一药剂和第二药物接触的样品中的活细胞的细胞附着或附着；并且

通过对连续测量的数学分析确定和与单独的第一药剂或第二药剂接触的样品相比，与第一药剂和第二药剂接触的样品中是否发生细胞粘附或附着的变化；并且

针对在受试者中的治疗用途选择第一药剂，该第一药剂与第二药剂组合导致与单独的第一或第二药剂相比的细胞粘附或附着的变化，指示细胞信号传导通路的变化，并且因此靶向治疗剂被预测在受试者的癌细胞中是功能性的。

附图简述

图1A、1B和1C显示了用来自两个HER2过表达乳腺癌患者(患者B1和B4)的细胞，两种用于HER2过表达乳腺癌的靶向通路药物(拉帕替尼和曲妥珠单抗)和人表皮生长因子(EGF)进行的“CELx”检验的结果。检验期间B1和B4细胞的生理变化用细胞应答测量系统(CReMS)测量，并且来自CReMS的输出记录在图中。将B1和B4细胞中每种的一个样品用拉帕替尼进行预处理，并且将B1和B4细胞中每种的另一个样品用曲妥珠单抗进行预处理，并且每组细胞对随后的EGF干扰的生理应答以连续的方式记录在整个检验中。图1A所示的CELx通路关闭(shutdown)检验预测患者B1不会对曲妥珠单抗作出应答，而是对拉帕替尼作出应答。图1B所示的结果也预测患者B4将对曲妥珠单抗和拉帕替尼均有应答。CELx检验预测与第三方临床参考记录结果的比较在图1C中显示；它显示CELx检验准确地预测了临床参考标准记录的结果，其中发现患者B1对曲妥珠单抗不应答并应答于拉帕替尼，并且发现患者B4对两者都有应答。

图2A、2B和2C显示了用来自两个乳腺癌患者(患者B1和B2)的细胞和抗增殖药物紫杉醇进行的CELx检验的结果。检验期间B1和B2细胞的生理变化用CReMS测量，并且来自CReMS的输出记录在图中。用紫杉醇处理B1和B2细胞中每种的一组，并且另一个对照组的B1和B2细胞不接受药物；在48小时过程内连续记录每组细胞的生理应答。B2检验细胞显示对紫杉醇的初始应答性，反映在与B2对照细胞相比，CReM输出显著降低，但是在大约24小时后，CReM输出反转，指示检验细胞开始增殖并且不再应答于毒品。B1检验细胞显示对紫杉醇的立即和连续应答，反映在整个检验期间与B1对照细胞相比，CReM输出降低。图2A和2B中所示的CELx检验结果预测B1和B2患者将对紫杉醇作出应答。CELx检验预测与第三方临床参考记录结果的比较在图2C中显示；它显示CELx检验准确地预测了临床参考标准记录的结果，其中患者B1和B2都被发现对紫杉醇有应答。

图3A、3B和3C显示了用来自两个结肠癌患者(患者C1和C2)的细胞、EGF和指示结肠癌的两种药物西妥昔单抗和伊立替康的组合进行的CELx检验的实验的整个时间过程内的结果。检验期间C1和C2细胞的生理变化用CReMS测量，并且来自CReMS的输出记录在图中。用西妥昔单抗和伊立替康处理C1和C2检验细胞中每种的一组，并且对照C1和C2细胞的另一组不接受药物；连续记录每组细胞的生理应答。C1和C2检验细胞都显示对药物组合的应答，如与其各自对照细胞相比检验细胞的降低的CReMS输出所反映的。这些结果预测C1和C2患者将对西妥昔单抗和伊立替康的组合作出应答。CELx检验预测与第三方临床参考记录结果的比较在图3C中显示；它显示CELx检验准确地预测了临床参考标准记录的结果，其中患者C1和C2均发现对西妥昔单抗和伊立替康组合都有应答。

图4显示了使用可能来自11种不同患者细胞的选集(来自患者B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7的患者的乳腺癌细胞、来自患者C1和C2的结肠癌细胞以及来自患者L1和L2的肺癌细胞)和15种不同药物(卡培他滨、西妥昔单抗、多西紫杉醇、氟尿嘧啶、吉非替尼、GSK1059615、GSK1120212、拉帕替尼、紫杉醇、帕唑帕尼、曲妥珠单抗、托泊替康、顺铂、厄洛替尼和奥西拉铂)的细胞和药物组合中的一些进行的57个CELx检验的总结结果。图4还显示了使用紫杉醇和顺铂的药物组合对患者L1和L2细胞进行的两次CELx组合检验的结果，且四次CELx检验用曲妥珠单抗和拉帕替尼的药物组合在患者B1、B2、B3和B4细胞上进行。在这组实验中，将靶向11种不同的细胞通路的总共十六种不同药物引入细胞样品。对于每个实验，计算检验细胞与其对照细胞相比的生理应答的变化。图4中的每个框将每个实验中测量的生理应答的变化分类为大于50％(实心框)、5％至50％之间(垂直阴影框)、小于5％(水平阴影框)或未经检验(空心框)。在此图中表示的系列实验说明了CELx检验在暴露于广泛范围的药物之后测量在各种癌细胞类型中发生生理变化的能力。

图5显示了在来自四个乳腺癌患者(B1、B2、B3和B4)的细胞上用药物西妥昔单抗和EGF分别进行的8次CELx检验的总结结果。使用“光学”生物传感器CReMS进行细胞B1、B2、B3和B4的一组检验，并使用“阻抗”生物传感器CReMS在相同细胞上进行另一组检验。结果以总结方式呈现，显示了CReMS记录的输出百分比变化范围。对于每个检验的患者细胞，每种CReMS记录的生理变化量是相同的。这些结果表明，CELx检验方法可以利用测量细胞不同生理变化的不同类型的CReMS’。

图6提供了实例1-4中描述的65个检验的总结结果。在这组实验中，将靶向11种不同的细胞通路的总共16种不同的药物引入到来自具有三种不同类型癌症的11个患者的细胞样品中。对于每个实验，计算检验细胞与其基线或对照细胞相比的生理应答的变化。图6中的每个框将每个实验中测量的生理应答的变化分类为大于50％，在5％-50％之间或小于5％。当生理应答的变化在5％-50％或大于50％之间时，CELx检验预测患者对疗法的应答良好，并且当生理应答的变化小于5％时，预测患者对疗法的应答。应答如下所示：大于50％(实心框)、5％至50％之间(垂直阴影框)、小于5％(水平阴影框)或未经检验(空心框)。在此图中表示的系列实验说明了CELx检验在暴露于影响广泛范围的细胞通路的广泛范围的药物之后测量在各种癌细胞类型中发生生理变化的能力。

图7记录了图6中描述的CELx检验预测(检验细胞对各药物的应答)和记录患者对药物应答性的第三方的结果之间的相关性(0％或100％)。实体框表示应答或不应答于治疗剂的细胞样品的检验结果与细胞样品的已知状态之间的100％一致性，空白框是未经检验的，且灰色阴影框表示与应答或不应答于治疗剂的已知细胞样品状态不一致。在检验的情况下，CELx检验和第三方产生相同的结果，除了一种情况，说明了CELx检验预测对靶向广泛范围的细胞通路的16种不同药物的乳腺、肺和结肠患者应答的能力。

图8A、8B、8C和8D记录了不同患者癌细胞和药物的CELx检验结果与记录患者对药物应答性的第三方的结果。图8A记录了检验的所有12种癌症患者细胞和16种不同药物的结果的比较。图8B记录了单独和与13种不同药物组合检验的8种乳腺癌患者细胞的结果的比较。图8C记录了单独和与3种不同药物组合检验的2种不同结肠癌患者细胞的结果的比较。图8D记录了单独和与3种不同药物组合检验的2种不同肺癌患者细胞的结果的比较。在每个图中，CELx检验显示准确地预测患者是否会对特定药物或药物组合作出应答，在一种情况下除外。

图9记录了CELx检验对检验的所有患者细胞和药物以及对所检验的子组的患者、药物、通路和CReMS类型的敏感性和特异性。总体而言，且在所研究的每个子组中，CELx检验产生高敏感性(98％+)和特异性(99.9％+)。这些结果说明了该检验跨不同癌细胞类型、药物类型、CReMS类型和靶向通路的预测能力。

图10A-C记录了特定PI3K通路活性的测量，如在PI3K通路因子(NRG1)单独或与PI3K通路抑制剂(拉帕替尼)一起存在时，通过在乳腺癌细胞系和原发肿瘤细胞中的细胞附着信号传导(CAS)测量的。图10A和10B显示NRG1增加BT474细胞(图10A)和患者54肿瘤细胞(图10B)中的CAS，并且拉帕替尼降低CAS，证实仅用NRG1测量的CAS对PI3K通路的活性是特异性的。图10C显示了原代乳腺癌细胞(患者54细胞)和健康乳腺癌细胞(H62细胞)之间对NRG1的差异应答，证明使用信号传导通路活性作为疾病活性的表型生物标志物的有效性。

图11A-C记录了特定ERα通路活性的测量，如在ERα通路因子(雌二醇)单独或与ERα通路抑制剂(氟维司群)一起存在时，通过在乳腺癌细胞系和原发肿瘤细胞中的细胞附着信号传导(CAS)测量的。图11A和11B显示雌二醇增加BT474细胞(图11A)和患者54肿瘤细胞(图11B)中的CAS，并且氟维司群降低CAS，证实仅用雌二醇测量的CAS对ERα通路的活性是特异性的。图11C显示了原代乳腺癌细胞(患者54细胞)和健康乳腺癌细胞(H62细胞)之间对雌二醇的差异应答，证明使用信号传导通路活性作为疾病活性的表型生物标志物的有效性。

图12是显示在实例7中检验的HER2在不同患者材料上的表达的FACS数据的条形图。

图13是显示针对具有不同生活力的细胞的细胞附着(阻抗)CAS结果的图。

图14是显示确认剂对具有HER2驱动疾病的低HER2患者的EGF和NRG1干扰的CAS结果的图。

图15A-D是显示在有或没有确认剂的情况下针对不同细胞系和患者样品的NRG1干扰的CAS结果的比较的条形图。图15A显示了过表达的HER2细胞系(SKBR3)的结果，图15B显示了具有HER2驱动疾病(R39)的非过表达的HER2患者的结果，图15C显示了不具有HER2驱动疾病(R49)的非过表达的HER2患者的结果，并且图15D显示了健康患者的结果(R62)。

图16是显示HER2通路的NRG1干扰的CAS结果的图，其为编译的样品数据。

图17是显示HER2通路的EGF干扰的CAS结果的图，其为编译的样品数据。

图18是显示基础培养基的年龄对信号传导通路活性测量的影响的图。

发明详细说明

为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。另外的定义贯穿详细说明而阐述。

A.定义

除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文提到的所有专利、申请、出版的申请和其他出版物通过引用以其整体并入本文。如果本节中阐述的定义与专利、申请、已公开的申请和其他出版物中所阐述的通过引用并入在本文中的定义相反或者不一致，本节中阐述的定义优于通过引用并入在本文中的定义。如本文使用的，以下术语旨在具有以下定义。

如本文使用的，术语“约”意指在大致或附近的区域中大约。当术语“约”与一个数值范围结合使用时，它通过扩展列举的数值的上限和下限将该范围加以修饰。通常，在此使用术语“约”以将一个数值以高于和低于该规定值的10％的变化加以修饰。在一个方面，术语“约”意指正在使用的数字的数值的正或负20％。因此，约50％意指在45％-55％的范围内。由端点列举的数值范围包括归入该范围内的所有数字和分数(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。

当结合提及细胞使用时，术语“活化剂”、“活化”、“干扰剂”和“干扰(perturb和perturbation)”是指特定对象或使用试剂、批准的药物、实验化合物及开发中的药物样分子和实验药物、有机分子、生长因子、信号传导因子、生物化学物质、核酸、细胞因子、趋化因子或蛋白质来生理操纵细胞的活性，这些对本领域技术人员熟知的细胞具有影响。操作是指细胞生理活性的任何调节，并且可以包括但不限于上调或下调。活化剂或干扰剂可另外包括但不限于以下单一药剂中任一种或其组合：特定的生长因子，包括成员和成员的组合，但不限于以下列表中的成员或成员的组合：血管内皮生长因子、磷脂酰肌醇、表皮生长因子和具有EGF肽序列的因子、肝细胞生长因子、m-CSF、RANK配体、肿瘤坏死因子(TNF-α)、胰岛素生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子、神经调节蛋白或神经调节素、调蛋白和与ErbB受体家族相关的因子、雌激素及其激素前体和降解产物(例如DHEA、雌酮、雄烯二酮)、孕酮、睾酮、叶酸盐、三磷酸腺苷、AMP、环AMP和FAS配体、血小板衍生生长因子(PDGF)或其他细胞通路或信号干扰剂如受试者的血浆或血清或来自患者细胞(特别是成纤维细胞和上皮)的上清液级分、Na+、K+、Mg+、Cl-、Ca+2、葡萄糖、谷氨酰胺、组氨酸、甘露醇和色氨酸、抗生素(雷帕霉素)、必需和非必需氨基酸、维生素、其他有机化合物、微量矿物质和无机盐、亚硒酸钠、血清、细胞提取物、分级细胞提取物或分级血清、细胞外信号传导因子、细胞内信号传导因子、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、乙醇胺、磷酸乙醇胺、三碘甲状腺原氨酸、丙酮酸钠、促分裂原、催产素、异丙肾上腺素、L-谷氨酰胺。

术语“粘附”可以包罗涉及任何数量的负责将细胞与ECM或其他细胞直接、间接和/或通过通路连通而间接连接的分子的过程。例如，整合素负责细胞骨架组织、细胞运动、细胞周期的调节、整合素亲和力细胞调节、细胞附着于病毒、细胞附着于其他细胞或ECM。整合素也负责信号转导，借这个过程，细胞将一种信号或刺激物细胞内和细胞间地转化到另一个。整合素可以将信息从ECM转导到该细胞，并且将信息从该细胞转导到其他细胞(例如，通过其他细胞上的整合素)或ECM。α和β亚单位的组合确定了整合素的配体特异性。许多整合素对相同的配体具有结合特异性，并且是指定体内相互作用的配体的整合素表达/活化模式与可用性的组合。在一个细胞区域或一个细胞群区域内粘附可以发生密度的变化。在一个细胞或一个细胞群内粘附可以发生量的变化。通过涉及在粘附过程中的特异性或蛋白质类型，粘附可以发生质量的变化。粘附可以发生极性的变化。

术语“测定(assay或assaying)”是指确定例如靶标的存在、不存在、数量、程度、动力学、动态或类型的分析，该靶标是例如在外源刺激物(例如治疗剂或配体)干扰时细胞的光学或生物阻抗应答。

术语“附着(attach或attachment)”是指本披露的例如表面改性剂、细胞、配体候选化合物等实体通过例如物理吸收、化学键合、化学吸引等过程或其组合连接到一个表面。特别地，“细胞附着”、“细胞粘附”或“细胞样品附着”是指细胞结合在一起或与一个表面相互作用，例如通过培养或与细胞锚定材料相互作用等。

术语“附着模式”是指细胞或细胞样品与一个表面的连接的可观察性状或特征。附着模式可以是定量的，例如附着位点的数量。附着模式也可以是定性的，例如与细胞外基质附着的优选分子位点。

术语“细胞附着信号(CAS)”是指当放置在微孔板的孔中并用阻抗生物传感器分析时由细胞产生的细胞附着的定量测量。典型地，不存在任何药剂的情况下细胞的CAS可以相比于存在单独的影响特定信号传导通路的干扰剂的情况下细胞的CAS，和/或相比于存在与特定信号传导通路的特异性抑制剂组合影响该特定信号传导通路的干扰剂的情况下细胞的CAS。典型地，细胞的CAS以欧姆测量。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且特别包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和展现出所希望的生物活性或功能的抗体片段。

例如，抗体可以是嵌合的、人源化的或人的，并且可以是这些的抗原结合片段。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是结合抗原的或其可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和多特异性抗体，例如双特异性抗体，例如从抗体片段形成的。“功能片段”基本上保持与全长抗体的抗原结合，并保持生物学活性。抗体可以通过共价或其他连接与一种或多种其他药物组合而“武装(armed)”或“共轭”，以实现比单个药物分子可以单独实现的更大的效力、特异性和功效。

如本文使用的，术语“确认剂”是指一种小分子，具有已知功能的特异性配体，或者抗体或亲和性/特异性药剂，已知破坏或影响本文所述检验中所用的感兴趣的通路活性。在检验中使用它来确认和量化当将干扰剂引入特异性启动与感兴趣的通路活性直接相关的活性的细胞样品时产生的特定作用机制相关的通路活性的量。例如，如果干扰剂是细胞表面受体的已知配体，则在引入确认剂后改变的本文所述方法中测量的活性将代表与该方法旨在分析的通路相关的活性量。在另一个实例中，如由配体结合区、受体二聚化区和受体酪氨酸激酶区组成的受体可能是这样，干扰剂可以是与受体配体结合位点结合的配体。然后，确认剂可以是如下药剂，其防止配体结合之前或配体结合之后的一个或多个事件，即受体二聚化之后的受体二聚化或受体酪氨酸激酶活性。此外，确认剂可以是将对于感兴趣的患者来说活化或功能障碍的下游信号传导通路的特定部分进行改善的药剂。

如本文中使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体中获得的抗体，即除了可能天然发生的突变(可能少量存在)之外都相同的该群体的单个抗体。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原性位点。此外，与常规的多克隆抗体制剂(它典型地包含直接对抗不同的决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体直接对抗该抗原上的单一的决定簇。修饰语“单克隆”指示当获得自基本上均一的抗体群体的抗体的特征，并且不应理解为要求通过任何具体方法产生抗体。

术语“免疫捕获试剂”是指任何类型的抗体，并且另外包括由RNA、DNA和含有碱基合成变体的聚合物构成的适体，或者任何合成分子，其中构建和选择该适体或试剂以特异性识别和结合另一种分子并表示其存在、数量和质量。

术语“培养”是指制备细胞进行本发明。制备可以包括在本发明的实践中的不同时间、各种培养基、培养基补充剂、各种温度条件、湿度、CO2％、种子密度、细胞类型纯度或混合物以及本领域技术人员已知的其他细胞培养条件。制备可以包括如下条件，这些条件允许细胞增殖、变得静止、衰老，并且进入、通过细胞周期的各个阶段或在细胞周期的各个阶段进行检查。培养可以包括本领域技术人员已知的任何数量的培养基或补充剂，例如但不限于维生素、细胞因子、生长因子、血清(例如源动物是牛、胎牛、人、马或其他哺乳动物)、代谢物、氨基酸、痕量矿物质、离子、pH缓冲液和/或葡萄糖，其允许和/或优化本发明的理想实践。培养细胞可以在通过本发明干扰之前或之后用无血清和/或无干扰剂的培养基进行实践。理想地，培养包含被设计以模拟患者的肿瘤微环境的条件。理想地，培养制剂可以包含设计用于将特定通路置于基础水平或提高水平以允许测量通路活性的激动作用或拮抗作用的条件。

术语“基础培养基”是指以明确定义的量含有无机盐、必需氨基酸、葡萄糖、维生素和pH缓冲液的培养基类型，并且其不含有刺激该方法旨在分析的信号传导通路的药剂。许多基础培养基是本领域技术人员已知的，并且可以包括例如DMEM、F12、MEM、MEGM、RPMI-1640及其组合。例如，当要分析ErbB信号传导通路时，基础培养基不含有已知干扰ErbB通路的试剂。使用基础培养基维持细胞培养物，使得细胞群体维持活力并维持其各细胞类型的异质性和代表细胞周期不同阶段的细胞的正态分布。用于恰在本文所述的方法中疾病细胞样品与干扰剂接触的步骤之前，在该方法中培养从受试者获得的病变细胞样品。

当应用于材料时，术语“新鲜”是指尚未使用的材料。因此，新鲜的基础培养基是尚未使用的基础培养基。可以将新鲜的基础培养基添加到含有已经在基础培养基中培养的疾病细胞样品的容器中，以增加含有细胞培养物的容器中的基础培养基的体积。可替代地，可以将容器中的已经用于培养病变细胞样品的基础培养基的一部分从细胞培养容器中移出并用新鲜的基础培养基代替。在任一种情况下，当细胞培养容器中的基础培养基总体积的50％以上是新鲜的基础培养基时，细胞培养容器被认为含有新鲜的基础培养基。在相同的基础培养基中培养延长时间段(例如超过72小时)的细胞将失去各细胞类型的异质性，并且大多数细胞可能进入可能干扰信号传导通路活性测量的G0/G1细胞周期阶段。放置在新鲜培养基中的细胞样品需要一段时间(例如至少12小时)以适应新培养基，使得细胞样品反映在原始细胞样品中发现的各细胞类型的异质性和代表细胞周期的不同阶段的细胞的正态分布。

术语“缓冲介质”是指含有pH缓冲液和等渗溶液的溶液。缓冲介质典型用于饥饿细胞样品或驱动细胞进入静止或衰老，例如当细胞休眠时发现的是细胞周期G₀/G₁。

“嵌合”抗体(免疫球蛋白)含有与衍生自一种特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体所对应的序列相同或同源的重链和/或轻链的一部分，而这些链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一个抗体类型或亚类的抗体、以及这些抗体的片段所对应的序列相同或同源，只要它们展示出令人希望的生物活性(美国专利号4,816,567；以及莫里森(Morrison)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:6851-6855)。

如本文使用的，术语“人源化抗体”是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的抗体。对于大部分，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受者或受体抗体)，其中该受者抗体的可变结构域高变区残基被来自具有希望的特异性、亲和力、以及能力的非人类物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长动物的高变区残基替代。高变区可以是由序列定义的互补决定区(CDR)(参见例如卡巴特(Kabat)1991，1987，1983)或由结构定义的高变环(HVL)(参见例如乔西亚(Chothia)1987)或两者。

“生物分子涂料”是包含一种分子(天然发生的生物分子或生物化学物质)或衍生自或基于一种或多种天然发生的生物分子或生物化学物质的生物化学物质的表面上的涂料。例如，生物分子涂料可以包含细胞外基质组分(例如纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白、其他糖蛋白、肽、糖胺聚糖、蛋白聚糖、玻连蛋白、细胞间CAM、血管CAM、MAdCAM)或其衍生物，或可以包含生物化学物质，如聚赖氨酸或聚鸟氨酸，它们是基于天然发生的生物化学物质赖氨酸和鸟氨酸的聚合物分子。基于天然发生的生物化学物质如氨基酸的聚合物分子可以使用天然发生的生物化学物质的异构体或对映异构体。涂料还可以包括细胞表面受体或细胞表面同源结合蛋白或对所述细胞表面蛋白具有亲和力的蛋白质。

术语“基线测量”是指要检验的一组细胞的生理学起始点，并且基于在添加药物之前的一段时间内的测量的评估。这可能包括在外源干扰之前的基础细胞代谢测量或CReMS读数。可替代地，这可以包括但不限于包括具有或不具有外源性干扰的正常健康细胞代谢功能的CReMS测量。

术语“被测变量”定义为临床检验中旨在测量的量。对于本文所述的发明，旨在测量的量是细胞对干扰的生理应答的变化。可以使用多种欧几里德数学分析以数学方式确定细胞对干扰的生理应答的测量的变化，并且可以在定量检验的情况下以数值方式报告，或者在定性检验的情况下报告为阳性或阴性结果。在定量和定性检验中，将被测变量(例如检验结果)与如下的截止值进行比较，在高于或低于该临界值时进行不同的临床决策或解释。

术语“基础形态”是指在引入药剂、干扰剂或刺激物之前细胞或细胞样品的形式和结构。

术语“细胞粘附”是指细胞与另一细胞、细胞外基质组分或表面(例如微量滴定板)的结合。

术语“细胞应答测量系统”或“CReMS”是指可以定量地确定细胞的细胞内和细胞间以及细胞和仪表装置之间的生理或细胞应答参数的变化的装置。在实施例中，细胞是无标签全细胞。通过测定分析物如葡萄糖、氧气、二氧化碳、含胺材料(如蛋白质、氨基酸)或者细胞外基质或细胞信号传导分子或者细胞增殖、细胞形态或细胞骨架重排的变化来测量生理或细胞应答参数的变化。CReMS的一个实例是生物传感器。

如本文使用的，术语“CReMS信号”被定义为当通过化学电CReMS分析细胞时那些细胞的细胞生理变化的度量。CReMS信号和CReMS信号的变化可以具有与测量生理变化的特定化学电转导器相关的各种单位。例如，CReMS信号可以具有但不限于如下单位：细胞指数、阻抗、波长单位、pH单位、电压、电流，或者通过使用单位的比率而变得无维量。这些单位中的任何一个都可能有时间组分。如生物学、生物化学和生物物理学领域的技术人员经常进行的，例如包括归一化、基线化，曲线减法或这些的任何组合，CReMS信号可以进行数学上的修饰。CReMS信号可以在单个时间点或者更优选在表示细胞生理应答的完整模式的连续的一系列时间点上测量。

术语CReM“光信号”定义为当细胞休眠时光从光子晶体生物传感CReMS反射时测量的波长值或波长值变化。这些单位典型以皮米或纳米为单位，尽管如果报告了变化比例，这些单位也可以变为无维量。“光信号”可以表示为与时间相组合的所述单位。光的反射波长的偏移与光子晶体表面上的质量成比例。因此，“光信号”是对CReMS上的细胞数目的定量度量。此外，“光信号”是细胞生理状态的度量，例如细胞形态、细胞粘附、细胞活力、细胞结构重排的变化导致传感器上被检测为波长偏移的质量差异。

如本文使用的，术语“细胞指数”被定义为阻抗的度量，并且可以通过以例如10kHz的固定电频率和固定电压测量在本发明的一个实例中应用。

并且通过如下方程式计算：细胞指数_i＝(R_tn-R_t0)/F

其中：

i＝1、2或3个时间点

F＝15欧姆，在仪器以10kHz频率工作的情况下

R_t0是在时间点T0测量的背景电阻。

R_tn是在细胞添加、细胞生理变化或细胞干扰之后的时间点Tn测量的电阻。

细胞指数是一个无维量参数，表示所测量电阻抗的代表细胞状态的相对变化。当细胞不存在或不能很好地附着在电极上时，CI为零。在相同的生理条件下，当更多的细胞附着在电极上时，CI值更大。因此，CI是在孔中存在的细胞数目的定量度量。另外，细胞生理状态例如细胞形态、细胞粘附或细胞活力的变化将导致CI的变化。

术语“生物标志物”在最通常的意义上是指细胞状况或者患者健康或疾病状态的生物学指标。通常的生物标志物的非限制性列表包括在哺乳动物中发现的生物学衍生分子、哺乳动物细胞或组织的生物活性、基因拷贝数、基因突变、单核苷酸多态性、基因表达水平、mRNA水平、剪接变体、转录修饰、转录后修饰、表位遗传修饰、细胞表面标志物、蛋白质或核酸的差异表达(包括所有形式的功能性RNA)、核酸的扩增、细胞形态学、翻译后修饰、蛋白质截短、磷酸化、去磷酸化、泛素化、去泛素化、代谢物、任何生物合成阶段的激素、细胞因子、趋化因子及其组合。生物标志物的一个子集用于诊断和治疗选择目的，以帮助病理学家诊断疾病，并帮助医生开处治疗。生物标志物典型在固定的安装的组织中测量基因拷贝数、基因突变或蛋白质的水平，而不指定蛋白质的状态或活性。本发明包括新型生物标志物，即来自患者活细胞样品的活性或动态结果的生理应答参数。

术语“生物标志物状态”是指对患者或患者细胞中的生物标志物的评定，并且当生物标志物存在时典型被报告为“生物标志物阳性”，当生物标志物不存在时，其被报告为“生物标志物阴性”。当蛋白质受体用作生物标志物(例如HER2/ErbB2或ER)时，生物标志物阳性结果也称为受体被过度表达或扩增，而生物标志物阴性结果称为受体正常表达或未扩增。对于其中生物标志物或生物标志物特征是疾病进展的预后指标或预测治疗功效的疾病，当前的临床实践依赖于对生物标志物或其相关突变的量的测量，以通过将患者分类为生物标志物阴性或阳性来改善病人的诊断。生物标志物状态的测定通常用于指导药物治疗的选择以治疗患者。用于区分生物标志物阳性和生物标志物阴性患者的生物标志物测量的截止值因生物标志物而不同。当生物标志物是药物靶标时，截止值是如下情况，高于该值的患者将接受靶向该生物标志物的治疗剂，而低于该值的患者将不会接受靶向该生物标志物的治疗剂。典型需要临床试验来鉴定生物标志物的临床相关性。

术语“HER2/ErbB2状态”是指患者或患者细胞(例如，癌细胞)中作为生物标志物的HER2/ErbB2的表达的评定，并且典型地如通过固定组织样品的IHC染色检验确定的，当与正常健康的非癌症乳腺组织样品相比生物标志物过于丰富地存在时状态报告为“HER2/ErbB2阳性”，或当生物标志物存在的水平不高于正常健康的非癌症乳腺组织样品的水平时报告为“HER2/ErbB2阴性”。各种用于评定HER2/ErbB2状态的方法是本领域已知的，典型集中于由患者细胞表达的受体(IHC)或mRNA水平(qPCR)或基因拷贝数(FISH)的量，从而诊断患者为HER2/ErbB阳性(当此受体在患者细胞中过表达或扩增时)或HER2/ErbB阴性(当此受体在患者细胞上未过表达或未扩增时)。过表达和扩增是描述水平升高到来自正常无疾病个体的类似组织中发现的水平之上的术语。对于DAKO IHC检验，典型地针对报告评分小于2+的患者报告HER2阴性结果。DAKO HER2 IHC检验染色解释指南如下表1所示：

表1：DAKO HER2 IHC检验染色解释指南：

HER2 FISH检验考虑到正常细胞各自具有染色体17上的HER2基因的两个拷贝-一个遗传自母亲，而另一个遗传自父亲。在HER2阳性的癌细胞中，可扩增该基因-每个细胞具有两个以上的拷贝。癌细胞也可能具有非整倍体染色体，这意味着它们的所有DNA(包括其HER2基因)都被扩增。HER2 FISH检验用结合染色体17(CEP17)上称为着丝粒的一个不同的区域的绿色荧光标记控制这种混杂变量。HER2阳性细胞将总是具有比着丝粒信号更多的HER2信号。通过ASCO-CAP HER2检验指南建议2013，对于那些没有内部对照探针的那些检验系统，HER2阳性患者具有>2.2的HER2与CEP17的FISH扩增比率，或>6个信号/核的平均HER2基因拷贝数，并且对于没有内部对照探针的检验系统，HER2阴性患者具有<1.8的FISHHER2/CEP17比率或<4个信号/核的平均HER2基因拷贝数。检验由认证技术人员和病理学家进行并分级。

没有设定标准来解释HER2 mRNA存在量以确定HER2驱动的癌症。

如本文使用的，针对受试者的癌细胞(例如乳腺癌细胞)的HER2/ErbB2状态，术语“HER2阴性癌症”、“ErbB2阴性癌症”、“非过表达的未扩增的HER2癌症”和“非过表达的未扩增的ErbB2癌症”可互换使用。

术语“雌激素受体状态”或“ER状态”是指患者或患者细胞(例如癌细胞)中作为生物标志物的ER的表达的评定，并且典型地该状态当在染色的固定样本的核中生物标志物过表达时被报告为“ER阳性”，或在染色的固定样品的核中生物标志物阳性常表达或不存在时被报告为“ER阴性”。各种用于评定ER状态的方法是本领域已知的，典型集中于由患者细胞表达的受体(IHC)或mRNA水平(qPCR)的量，从而将患者诊断为ER阳性(当此受体在患者细胞上表达时)或ER阴性(当此受体不在患者细胞上表达时)。

对ER状态的ASCO CAP 2010获批指南是，如果在检验时，存在内部(正常上皮元件)和外部对照的期望反应性的情况下，在样品中至少有1％阳性肿瘤细胞核，则ER测定被认为是阳性的。在有证据表明样品可表达ER或PgR(看到阳性内部控件)的情况下，如果发现<1％的肿瘤细胞核具有免疫反应性，则ER染色检验结果为阴性。如果发现没有肿瘤细胞核具有免疫反应性并且样品中存在的或从相同样品单独提交的内部上皮元件缺乏任何核染色，则ER染色检验结果对ER无法解释。检验由认证技术人员和病理学家进行并分级。

如本文使用的，针对受试者的癌细胞(例如乳腺癌细胞)的ER状态，术语“ER阴性癌症”和“非过表达的ER癌症”可互换使用。

术语“生物传感器”是指测量分析物或者分析物或细胞的生理条件的变化的装置。在实施例中，生物传感器典型含有三个部分：结合或识别分析物的生物组分或元件(包括非限制性实例如细胞外基质、细胞信号转导分子或细胞增殖、组织、细胞、代谢物、分解代谢物、生物分子、离子、氧气、二氧化碳、碳水化合物、蛋白质等)、检测器元件(以物理化学方式操作，例如光学、压电、电化学、温度测量或磁性)以及与两个部件相关的转导器。

术语“光学生物传感器”是指测量光的荧光性、吸收、透射率、密度、屈光指数和反射的装置。在实施例中，光学生物传感器可以包含用于将活细胞、病原体或其组合中的分子识别或分子干扰事件转换成可量化信号的光学转导器。此外，实施例可以包括光子晶体装置、光波导装置和表面等离子体共振装置。

术语“阻抗生物传感器”是指测量患者活细胞的复阻抗变化(ΔZ或dZ)的装置，其中阻抗(Z)与如欧姆定律(Z＝V/I)所述的电压与电流的比率相关。它对与细胞的电极界面处的局部离子环境敏感，并且检测这些变化作为电压和电流波动的函数。作为正常功能或干扰的结果，细胞的生理变化导致电极周围的电流的可量化变化并影响测量的信号的幅度和特征。在实施例中，阻抗生物传感器可以包含用于将活细胞、病原体或其组合中的分子识别或分子干扰事件转换成可量化信号的的电极或电路。在实施例中，ISFET生物传感器可以包含用于将活细胞、病原体或其组合中的分析物识别或细胞干扰事件转换成可量化信号的的离子选择性场效应电转导器。当ISFET生物传感器中的分析物浓度发生变化时，晶体管中的电流发生变化，产生一个量化信号。

术语“细胞信号传导”是指信息的细胞内或细胞间转移。细胞信号传导可以通过细胞间的直接接触或通过物质从一个细胞释放而被另一个细胞吸收来实现。细胞间信号传导可以通过两个分子(例如配体和受体)之间的相互作用发生。受体结合可以引发细胞内信号传导的级联(例如，细胞内的生物化学变化的起始或膜电位的修饰)。

术语“HER家族相关信号传导通路”是指与通过HER家族受体(HER1/ErbB1/EGFR、HER2/ErbB2、HER2/ErbB3和HER4/ErbB4)进行的信号传导相关的细胞内信号传导通路。HER家族受体和已知与每种受体结合的相应配体总结在下表2中：

表2：

术语“ER相关信号传导通路”是指与通过雌激素受体(ER)(包括ERα和ERβ)进行的信号传导相关的细胞内信号传导通路。ER的已知配体(其对ER的α或β同种型的亲和力可能不同)包括雌二醇、雌酮、雷洛昔芬、雌三醇和染料木素。

术语“细胞骨架组织”是指细胞内部支架的排列。细胞的细胞骨架包含用于支持细胞质或膜元件和/或细胞内细胞器的细丝。细胞骨架也有助于维持细胞的形状。

术语“细胞增殖”是指由于细胞生长和细胞分裂而导致的细胞数目的增加。

术语“细胞存活”是指以能够执行某些功能(如代谢、生长、运动、繁殖、某种形式的应答性和适应性)为特征的细胞活力。

术语“功效”是指特定干预产生有益结果的程度。在实施例中，干预可以是治疗剂，例如小分子或抗体。有益的结果包括但不限于症状的抑制、细胞生长的减少、细胞杀伤的增加、炎症的减少和免疫应答性的增加。

“细胞外基质组分”是发生在动物的细胞外基质中的分子。它可以是任何物种和任何组织类型的细胞外基质的组分。细胞外基质组分的非限制性实例包括层粘连蛋白，胶原，纤连蛋白，其他糖蛋白，肽，糖胺聚糖，蛋白聚糖等。细胞外基质组分还可以包括生长因子。

术语“总体表型”是指作为整体的细胞或细胞样品的多个可观察性质或其复合体，并反映发育、生物化学或生理学性质、物候、行为和行为产物。总体表型可包括但不限于细胞大小，细胞形状，与众不同的突起，外生长，扩散，附着灶密度，细胞骨架排列，细胞增殖模式，受体吞噬作用或附着灶数，pH变化，代谢物摄取或外排，信号传导蛋白和生长因子，氧，CO2，葡萄糖，ATP和离子如镁、钙、钾。

术语“事件特异性”是指对细胞的特定性质的物理观察。这些特定性质涉及特定的细胞功能、外源性干扰或通路激动/拮抗，作为细胞对特定活化剂或治疗剂的预期和/或期望的生理应答的一部分。已知活化剂和治疗剂可靶向于影响细胞功能的某一方面，例如细胞骨架结构或细胞通路。物理可观察事件被称为事件特异性，因为在活化剂或治疗剂存在下细胞中的物理可观察事件反映了活化剂或治疗剂对细胞的预期和/或期望效果。例如，在附着生物传感器类型的CReMS上向大多数细胞样品中加入长春花碱可以显著减少信号。长春花碱是细胞骨架支架破坏者。信号的减少是细胞的物理可观察事件，特异性地与由微管分子上的药物作用引起的细胞形状和附着的丧失相关联。

如本文使用的，术语“阻抗”由通过以下方程式将电压和电流相关联的物理定律定义：阻抗(欧姆)＝电压(伏特)/电流(安培)或Z＝V/I。

用于治疗或疗法目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动物、体育动物、或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选地，该哺乳动物是人类。

术语“微型悬臂装置”、“微型悬臂阵列”或“微型悬臂设备”是指一种CREMS仪器，其包含至少一个悬臂，可以是条形、V形或其他形状的柔性梁，这取决于对其的应用。微型悬臂的一端固定在支持底座上，另一端自由站立。微型悬臂可以使用电方法来测量浓度，以检测可与天然共振频率匹配的相位差信号(如通过引用并入在此的2000年3月28日授权的美国专利号6,041,642中描述的实例)使用上面配置了已知分子的微型悬臂的共振特性的变化来确定靶标种类的浓度，例如大分子的生物分子，例如DNA、RNA或蛋白质。使用光学和压电方法测量偏转。

术语“正常发挥作用”是指具有确定的检查和平衡体系的细胞中的通路，其阻止细胞由于不自然的信号传导水平、复制、丧失接触抑制以及异常基因复制和扩增而变得功能障碍。在许多情况下，随着通路起始于某些静止或稳定的基础状态，在通路成员的EC50浓度下加入少量的干扰剂将仅具有小的瞬时效应，因为细胞系统识别干扰剂，引发通路活性，并且然后调节干扰效应以维持与其他细胞功能的平衡。病变功能通常可识别为对干扰剂的过度反应、沿着该通路的过高/过低活性、不适当的通路间活性以适应干扰剂效应、以及不能下调最小干扰剂效应。另外，对于一些疾病状态，一些通路成员的基础状态不能达到通路。这些系统被描述为组成型活化的。

术语“正常参考区间”在这里被定义为参考上限和下限两个数字之间(并且包括这两个数字)的区间，估计其包涵从健康受试者(例如缺乏的感兴趣的疾病的那些)群体获得的值的特定百分比。对于大多数分析物，参考上限和下限分别被估计为参考人群的检验结果的分布的第2.5和第97.5百分位数。在一些情况下，只有一个参考极限具有医学重要性，通常是上限，即第97.5百分位数。可以构建参考区间极限估计的置信区间，假设参考群体的随机抽样-一般约120个参考受试者。每个置信区间的宽度取决于参考受试者的数量以及观察到的参考值的分布。

通过选择参考个体的过程，适用于这些参考个体的分析方法，来确定和设定正常的参考范围截止，并且由数据收集和出版物临床实验室标准协会批准指南EP28-A3C“定义、建立参考区间并在临床实验室中验证(Defining,Establishing,and VerifyingReference Intervals in the Clinical Laboratory)”(其内容通过引用以其全文并入在本文中)定义的分析得出结论。

在一个实施例中，参考个体将是无疾病(特别是所有形式的癌症)的个体。通过使用本文所述的方法检验正常参考个体来确定正常参考区间。正常参考区间的上限将代表正常通路活性的上限。在一个实施例中，区分阳性和阴性检验结果的截止值将等于正常参考区间的上限。在其他实施例中，截止值将等于正常参考区间的上限加上以下值中任一个、组合、所有，或者以下值中的一个、组合或所有的倍数：检测极限、空白极限、定量极限、被测变量的标准偏差。

无疾病的参考个体组可以通过感兴趣的疾病以外的各种特征来进一步定义。例如，在本发明的乳腺癌的应用中，可以进一步将无疾病的参考妇女组定义为包括以下特征中的任一个、组合或全部：绝经前或绝经后、泌乳中或非泌乳中、刚生完孩子、具有BRCA基因突变、存在糖尿病、通过BMI(身体质量指数)测定的肥胖症、戒除药理学剂如激素或其他药物成瘾、戒除饮食材料如酒精和/或癌症家族史。

术语“异常信号传导通路”或“功能障碍信号传导通路”可互换使用，并且是指以破坏细胞执行其正常功能的能力的方式被破坏的细胞信号传导通路。细胞信号传导破坏和由此产生的功能障碍的来源典型是损坏基因组的结果，其干扰信号传导通路的正常功能。这种损伤可能是内生过程的结果，如DNA复制的错误，某些DNA碱基的内在化学不稳定性，或者被代谢过程中产生的自由基侵袭。一些失活突变发生在负责维持基因组完整性的基因中，有助于获得额外的突变。影响细胞对照的基因组水平的其他机制涉及表观遗传学机制，借此特定基因的表达已经通过组蛋白功能的变化而改变。已经证明表观基因组功能是高度适应性的或应答于许多不同的环境条件，包括参与疾病病因学和传播的条件。已经在转录时、转录后、翻译时和翻译后水平描述了各种基于RNA的通路功能障碍机制。

此外，蛋白质水平的通路功能障碍的许多作用是细胞分子生物学领域技术人员已知的。通路功能障碍可以是以下的结果，一个或多个通路成员或一个或多个辅助因子的过表达或低表达，存在于非天然细胞类型或细胞位置的蛋白质活性，蛋白质与非天然通路成员的相互作用(也称为通路交叉反应性)，功能障碍的反馈回路。另外通路功能障碍可以是蛋白质组、蛋白酶体、蛋白激酶组、代谢组、核蛋白和因子、细胞质蛋白和因子和/或线粒体蛋白和因子的活性的结果。

当具有功能障碍通路的细胞复制时，它们可以将该异常传递给其后代，这增加了细胞变得病变的可能性。通过分析活细胞中细胞信号传导通路的活性，可以确定细胞的信号传导通路是正常还是异常发挥作用。

如在此可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在对核苷酸结构的修饰，那么在组装聚合物之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成之后诸如通过与标签共轭来进一步修饰。其他类型的修饰包括，例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然发生的核苷酸，核苷酸间修饰例如具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺化物，氨基甲酸酯)的那些以及带电荷的键(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的那些，含有侧部例如蛋白质(例如核酸酶，毒素，抗体，信号肽，ply-L-赖氨酸等)的那些，具有嵌入剂(例如，吖啶，补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属，放射性金属，硼，氧化金属等)的那些，含有烷基化剂的那些，具有改性键的那些(例如，α端基异构体核酸等)，以及一种或多种未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团所取代，被标准保护基团保护，或被活化以制备与另外的核苷酸的附加键合，或者可以与固体或半固体支持共轭。5'和3'末端OH可以被具有从1至20个碳原子的胺或有机封端基团部分磷酸化或取代。其他羟基也可以衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括例如2'-O-甲基-，2'-O-烯丙基，2'-氟-或2'-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，环状类似物和碱基核苷类似物如甲基核糖。一个或多个磷酸二酯键可以被供选择的连接基团替代。这些供选择的连接基团包括但不限于如下实施例，其中磷酸酯被P(O)S(“硫酸酯”)、P(S)S(“二硫酸酯”)、(O)NR.sub.2(“酰胺化物”)、P(O)R'、P(O)OR'、CO或CH.sub.2(“缩甲乙醛”)替代，其中每个R或R'独立地为H或者取代的或未取代的烷基(1-20C)，任选地含有醚(--O--)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有键都必须相同。前述说明适用于在此提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“多肽”是指含有两个以上通过肽键连接的氨基酸的肽或蛋白质，包括肽、寡聚体、蛋白质等。多肽可以含有天然的、修饰的或合成的氨基酸。多肽也可以被天然修饰，例如通过翻译后加工，或化学修饰，例如酰胺化、酰化、交联等。

术语“石英晶体共振器/微量天平”是指被加入旨在测量的小质量诸如病毒或任何其他微小物体妨碍时，通过测量压电石英晶体的频率变化来测量质量的一种CREMS装置。频率测量容易进行到高精度，因此容易测量小质量。

如本文使用的，“样品”是指可能含有要使用本公开中的设备、微孔板或方法来分离、操纵、测量、定量、检测或分析的部分的任何物质。样品可以是生物样品，例如生物液体或生物组织。生物流体的实例包括细胞在培养基如细胞培养基、尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰液、脑脊液、眼泪、粘液、羊水等中的悬浮液。生物组织是细胞(通常是特定种类的细胞)连同形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构(包括结缔组织、上皮、肌肉和神经组织)的结构材料之一的细胞间物质的聚集体。生物组织的实例还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和一个或多个单个细胞。生物样品可以进一步包括细胞悬浮液，含有生物分子(例如蛋白质、酶、核酸、碳水化合物、与生物分子结合的化学分子)的溶液。

术语“细胞样品”是指从特定受试者分离的细胞，其中细胞是从受试者的生物流体、排泄物或组织中分离。从组织分离的细胞可以包括肿瘤细胞。从组织分离的细胞包括均质组织和细胞提取物及其组合。细胞样品包括来自(但不限于)血液、血清、血浆、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、预射出液(考珀液(Cowper's fluid))、排泄物、眼泪、唾液、汗水、活检物、腹水、脑脊液、淋巴、骨髓或头发。

术语“CELx”检验通常涉及本文所述的方法的各种实施例。

术语“疾病细胞样品”是指来自疾病部位的多个细胞或具有疾病特征的细胞。

术语“健康细胞样品”是指如下细胞样品，其中细胞不具有正检验的疾病或是从不具有正检验的疾病的组织中提取。例如，当正针对治疗剂对受试者的乳腺癌的作用检验特定受试者时，非癌性细胞或来自非乳腺组织的细胞被认为是“健康的”。术语“健康细胞样品”不是对受试者整体健康状况的确定或反映。为了得出正常的参考区间的目的，常常是如下情况，使用的健康细胞样品获得自不具有正检验的疾病的受试者。

术语“敏感性”是指检验或检测极限，并且被定义为与零区分的最低量。(例如，通常使用零对照的平均值的95％置信区间或2个标准偏差(SD))。

术语临床“敏感性”是指具有靶标条件的检验为阳性的受试者的比例或当感兴趣的情况存在时检验为阳性的频率。检验的临床“敏感性”定义为通过计算提供的精度来估计：100％x TP/(TP+FN)，其中TP是正检验的结果的真阳性事件的数量，且FN是假阴性事件的数量，未正确确定的事件为阴性。

临床“特异性”是指不具有靶标条件的检验为阴性的受试者的比例或当感兴趣的情况不存在时检验为阴性的频率。临床特异性是通过计算来估计：100％x TN/(FP+TN)，其中TN是正检验的结果的真阴性事件的数量，且FP是假阳性的数量，错误地确定的事件为阳性。

术语“表面等离子共振装置”是指光学生物传感器类型的CReMS，其通过检测局部屈光指数的变化来测量金属表面的生物分子的结合事件。

术语“治疗剂”是指任何合成或天然发生的生物活性化合物或物质组合物，当被给予生物体(人类或非人类动物)时，通过局部和/或全身作用诱发所期望的药理学、免疫原性和/或生理学影响。该术语包罗传统上被视为药物、疫苗和生物药物的那些化合物或化学物质，包括蛋白质、肽、激素、核酸、基因构建体等分子。药剂可以是用于医学(包括兽医)应用和农业(例如植物的情况)以及其他领域中的生物活性剂。术语治疗剂还包括但不限于药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或疾患的物质；或影响身体结构或功能的物质；或前药，其在被放置在预定的生理环境中后变得具有生物学活性或更有活性。治疗剂包括但不限于抗癌治疗剂、抗精神病药、抗炎剂和抗生素。

术语“细胞毒性疗法”和“化学疗法”是指用一种或多种治疗剂治疗，其中该一种或多种药剂对病变细胞(以及可能的非病变细胞)表现出非特异性或非靶向细胞毒性。

术语“靶向通路药物”、“通路药物”或“靶向药物”是指具有治疗能力的任何分子或抗体，其被设计为结合涉及在疾病过程中的特定生物分子(例如蛋白质)，从而调节其活性。

术语“HER2疗法”或“HER2靶向疗法”是指使用设计为特异性靶向HER2分子和/或一个或多个信号传导通路的一种或多种治疗剂进行的治疗，包括但不限于例如靶向HER2分子和/或一个或多个信号传导通路的抗体和小分子。这样的HER2疗法也可以靶向HER家族的其他成员，例如靶向HER1和HER2，HER1、HER2和HER4，或者单独的HER3的疗法。

术语“ER疗法”、“ER靶向疗法”或“激素疗法”是指使用设计为特异性靶向ER分子和/或一个或多个信号传导通路的一种或多种治疗剂进行的治疗，包括但不限于芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂和选择性雌激素受体下调剂、以及这类疗法与抑制细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6的疗法的组合。

术语“抗增殖药物”、“抗增殖剂”或“细胞凋亡诱导药物”是指具有治疗能力的任何分子或抗体，其功能是减少细胞分裂、减少细胞生长或杀死细胞。在许多情况下，这些药物的活性是针对涉及在正常细胞过程中的广泛类别的生物分子(例如DNA嵌入)，并且因此该药物可能对细胞疾病状态的判别较少。

多肽的“变体”是指含有与参考序列不同的氨基酸序列的多肽。参考序列可以是全长天然多肽序列或全长多肽序列的任何其他片段。在一些实施例中，参考序列是可变结构域重链或可变结构域轻链共有序列。多肽变体通常具有与参考序列至少约80％的氨基酸序列一致性。

B.测量信号传导通路活性的诊断测定和方法

现今许多癌症借助于检验来诊断，以确定与该疾病相关的特定基因突变或过度表达的受体蛋白的存在。例如，对于乳腺癌，进行检验以确定在癌细胞中雌激素受体(ER)或人表皮生长因子受体2(HER2)是否过表达或扩增。这些检验的结果用于确定最适合治疗疾病的疗法。

尽管最好的靶向疗法的实际靶标是信号传导通路的元件(elements)，但大多数生物标志物检验仅提供关于信号传导通路活性本身的间接和推论信息。这些检验典型由对编码活化的信号转导蛋白的基因中的突变的DNA分析或固定组织中过度表达的受体蛋白的免疫组织化学组成。实际上，这种疾病不是由单个蛋白质驱动，而是通过导致肿瘤细胞存活和增殖的信号传导通路网络的动态复杂电路驱动。这样的网络不是简单的线性通路，而是涉及不可能使用遗传分析进行评定的复杂的旁路机制和反馈回路。

由于当前生物标志物检验的限制而导致误诊的可能性的一个实例可以在当前的乳腺癌生物标志物检验的情况发现。每年诊断出约30万名妇女有浸润性或非浸润性乳腺癌。诊断为雌激素受体α(ERα)阳性乳腺癌的妇女的70％的临床结果有显著改善。这些改善的结果在很大程度上是由于可以获得破坏雌二醇或其与ERα结合相关的活性的靶向疗法的结果。其余30％的女性，大约9万人，其癌症为ERα阴性，面临更糟糕的预后。

尽管功能障碍的雌激素信号传导网络(ESN)在乳腺癌中起着广泛认可的作用，但仅在临床中进行测量单个反应物ERα的检验；今天没有诊断检验可以测量患者肿瘤上皮细胞内的ESN活性。然而，当仅测量ERα表达时，分类为ERα阴性但在肿瘤细胞中具有异常ESN活性的患者被诊断为不具有雌激素驱动的乳腺癌，实际上他们确实有。这种误诊对这些患者具有显著的负面后果，因为ERα阴性乳腺癌比ERα阳性乳腺癌所处方的药物的效力差得多。ERα阳性与ERα阴性患者的结果差异非常显著。

来自临床试验的发现显示，一些ERα阴性患者受益于内分泌治疗。这表明如果可以鉴别出他们则可以改善他们的生存结果。这导致NCCN乳腺癌小组针对ERα阴性患者推荐试验内分泌治疗。

另一个实例，其中临床上使用的当前方法不测量已知驱动疾病活性的具体功能活性，是具有过表达的HER2乳腺癌(HER2阳性)。靶向HER2蛋白的药物通常是无效的，因为HER2的过表达水平的存在不一定与驱动癌细胞增殖的HER2相关通路的活性相关。在这种情况下，优选确定HER2相关通路是否活跃。

因此，作为更准确地诊断其疾病首先借助静态遗传或蛋白质分析表征的患者的检验，用于测量原代病变细胞中的信号传导通路活性的方法具有显著的商业应用。这种途径推翻了长期存在的科学共识领域，并且表明测量活的原代病变细胞中的信号传导通路活性(不仅仅是基因或蛋白质的状态)，对于患者疾病的正确诊断是必不可少的。

遗传或蛋白质分析的焦点反映了广泛持有的观点，即患者的生物标志物状态足以诊断其癌症。但是测量遗传或蛋白质表达水平仅提供关于病变信号传导通路本身的活性的间接和推断信息。当前的研究已经确定，疾病典型由信号传导通路网络的动态的复杂电路驱动。这样的网络不是简单的线性通路，而是涉及不可能使用固定细胞的静态遗传和免疫组织化学分析进行评定的复杂的旁路机制和反馈回路。分析信号传导通路活性需要使用活的不固定的细胞并开发可以测量这些活细胞随时间的动态细胞变化的方法。这种对静态遗传或蛋白质分析的依赖性部分是由常用的检验方法驱动的。它们涉及使用许多细胞固定技术之一来首先制备肿瘤组织，并且然后使用多种技术(例如免疫组织化学或荧光原位杂交(FISH))分析固定的细胞。这些方法能够检测肿瘤标本的遗传或蛋白质组成，但不能测量动态细胞通路活性。

测量信号传导通路活性可以检测到与疾病一致的异常的存在。为了实现这一点，已经开发了利用细胞信号传导通路操作和细胞粘附过程之间的紧密联系的平台。已经证明跨膜细胞粘附受体(如整合素、钙粘蛋白、Ig CAM和选择素)与细胞外基质中或其他细胞上它们的同源结合位点的相互作用与多种细胞信号传导过程有关。粘附联系通过有组织的膜近端细胞骨架结构进行通信，其与细胞内信号级联直接连接。这使得在应用通路干扰剂时可以通过特定细胞通路影响特异性粘附分子。

为了测量细胞通路的干扰如何影响细胞粘附，使用一种测量附着于涂覆微电极的特定细胞外基质(ECM)材料的患者活细胞的复阻抗变化的装置。被称为细胞阻抗生物传感器的这些装置由标准的微孔板组成，薄的金电极覆盖每个孔的底部。与选择性细胞外基质一起使用的孔以特定的方式将活细胞附着到微孔板孔电极。在孔电极顶部存在活细胞影响电极/细胞界面处的局部离子环境，导致电极阻抗的增加。当细胞被干扰或刺激以改变其功能时，伴随的细胞粘附变化因此改变阻抗。粘附应答的特异性可以通过应用特定的ECM或工具化合物或已知在通路中的各个点上起作用的药物来确定。通过由阻抗时间模式指示的时间点的特异性蛋白质组变化的免疫检测进一步支持阻抗结果。系统能够检测亚纳米至微米范围内的粘附变化，并生成用于分类活细胞上各种通路药理学的数据。测量的阻抗量(称为细胞附着信号(CAS)，以欧姆表示)可用于监测细胞活力、粘附和信号传导通路干扰。产生的数据是阻抗与时间。

因此，在本发明的诊断检验中，分析物是当放置在微孔板的孔中时，单独或存在细胞干扰的情况下，患者活细胞产生的细胞附着信号(CAS)，并用生物传感器如阻抗生物传感器分析。对于每个检验，测量和分析两组患者细胞样品的CAS。

1)仅患者细胞(C)

2)患者细胞+一个或多个干扰通路因子(CF)

3)患者细胞+一个或多个干扰通路因子+确认剂(CCF)

为了检测信号传导通路是正常还是异常发挥作用，用一种或多种通路因子和确认剂干扰患者的病变细胞中的信号传导通路，并将所得活性与干扰剂和/或确认剂具有的影响在截止值上进行比较。截止值可以从涉及自没有癌症的受试者获得的健康细胞样品组的信号传导通路活性的分析的研究中得出。测定被测变量反映了患者病变细胞中CF和C细胞之间的CAS变化以及CF和CCF病变细胞之间的CAS变化。如果信号传导通路异常，CF和C病变细胞之间的CAS变化和/或CF和CCF病变细胞之间的CAS变化将高于截止值。截止值典型高于感兴趣的通路活性的正常参考区间的上限。在一个简化的实施例中，与恰在用通路因子或确认剂干扰之前的时间点的CAS相比，在干扰点之后的CF和CDF样品的CAS的测量也可以是有用的被测变量。这种分析的实例显示在图10C和11C中，在实例6中进一步描述。在这些实验中，用特异性活化PI3K通路(NRG1，图10C)或雌激素受体α(ERα)通路(雌二醇，图11C)的干扰剂处理健康的乳腺癌细胞(H62细胞)和乳腺癌患者细胞(患者54原代肿瘤细胞)，并在细胞中测量CAS。结果证明，与健康细胞相比，病变细胞中PI3K通路的信号传导活性升高(图10C)。同样，与健康细胞相比，ERα通路中的信号传导活性升高(图11C)。

特异性靶向治疗抑制剂对信号传导通路的影响也可以使用CAS进行评估。如图10A-B和11A-B所示，已经显示PI3K通路或ERα通路的特异性抑制剂在乳腺癌细胞系(图10A、11A)和原代乳腺癌细胞(图10B、11B)中降低了信号传导通路活性。

本发明的诊断测定可用于基本上任何临床情况，特别是当前遗传或蛋白质生物标志物用作疾病指标并因此作为治疗决策指标的那些临床情况。下表3显示了FDA批准的治疗剂以及与其用于治疗各种疾病病况的用途相关的生物标志物的列表。根据本发明的方法，本文所述的途径可用于检查涉及的受治疗剂影响的信号传导通路的活性，从而确定是否应向该患者处方以用该治疗剂治疗，而不管使用标准生物标志物测定他们是否显示阳性结果。

表3.药物标签中的药物基因组生物标志物

因此，本发明的一个方面提供了诊断受试者中与病变细胞的异常信号传导通路相关的疾病的方法，其中该受试者是生物标志物阴性的，该方法包含；

制备从受试者获得的活的原代病变细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

使从受试者获得的(1)活的原代病变细胞的样品的第一部分与干扰剂接触，使(2)样品的第二部分与干扰剂和确认剂接触，其中干扰剂选择性地影响疾病相关信号传导通路且确认剂选择性地抑制干扰剂对相同疾病相关信号传导通路的影响；

连续测量样品的每个部分中活的原代病变细胞的细胞粘附或附着；并且

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异；

将该被测变量与从ErbB信号传导通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时，该受试者被诊断具有与病变细胞中的异常信号传导通路相关的疾病。

在另一个实施例中，在与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替。

在另一个实施例中，选择使用本文所述方法诊断具有异常信号传导通路活性的受试者用于已知抑制受试者被诊断具有的异常信号传导通路活性的疗法。在另一个实施例中，将该疗法给予受试者，其是使用本文所述方法选择的。

在一个实施例中，该疾病是癌症，例如乳腺癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤和甲状腺癌或头颈癌。还包罗与异常信号传导通路相关的其他类型的疾病，例如自身免疫性疾病和感染性疾病。

在一个实施例中，该疾病是癌症，并且因此病变细胞是肿瘤细胞的样品。在另一个实施例中，将从该疾病中涉及的组织类型获得的患病患者的健康细胞用作对照。在优选的实施例中，癌症是乳腺癌。在用于诊断乳腺癌的一个实施例中，干扰剂选择性地影响PI3K信号传导通路，例如NRG1。在另一个实施例中，干扰剂选择性地影响MAPK信号传导通路，例如表皮生长因子。在用于诊断乳腺癌的一个实施例中，干扰剂选择性地影响ERα信号传导通路，例如雌二醇。在用于诊断乳腺癌的又另一个实施例中，干扰剂选择性地影响ErbB信号传导通路，例如HER2信号传导通路。选择性影响ErbB信号传导通路的药剂是本领域已知的。

在不同实施例中，信号传导通路选自下组，该组由以下各项组成：MAPK、RHO、AKT、FAK1、RAS/RAF、PI3K/PTEN、MAK、MKK和MEK。另外的合适的信号传导通路包括本文公开的其他信号传导通路。在不同实施例中，干扰剂可以是例如蛋白质、肽、核酸、代谢物、配体、试剂、有机分子、信号传导因子、生长因子、生物化学物质或其组合。

如本文进一步描述的，细胞粘附或附着可以用阻抗生物传感器或光学生物传感器测量。在一个实施例中，使用欧几里德分析来评定细胞粘附或附着的变化。例如，欧几里德分析可以选自下组，该组由以下各项组成：多个时间点的差分的算术求和、时间最大值、时间最小值、达到最大值或最小值的时间、斜率变化、生物传感器信号的绝对下降、所有测量的总体、及其组合。在另一个实施例中，通过时间最大值或最小值的变化来测量细胞粘附或附着的变化。

在不同实施例中，使活的原代病变细胞进一步与靶向和该疾病相关的信号传导通路的确认剂接触，并且测量确认剂对细胞粘附或附着的影响。在另一个实施例中，确认剂是选择性雌激素受体下调剂(SERD)或已知抑制雌激素相关信号传导通路活性的选择性雌激素受体调节剂(SERM)。

在又另一个实施例中，使病变细胞进一步与靶向和该疾病相关的信号传导通路的靶向治疗剂接触，并且测量靶向治疗剂对细胞粘附或附着的影响。靶向治疗剂的非限制性实例包括西妥昔单抗、多西紫杉醇、厄洛替尼、吉非替尼、伊立替康、拉帕替尼、紫杉醇、帕唑帕尼、托泊替康、曲妥珠单抗、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、依维莫司、阿比特龙、比卡鲁胺、硼替佐米、威罗菲尼、伊匹单抗及其组合。本文公开了其他合适的靶向治疗剂。在又另一个实施例中，该方法进一步包含向受试者给予靶向治疗剂。

在另一个实施例中，本发明提供了选择具有雌激素受体α(ERα)阴性乳腺癌的受试者用于激素疗法的方法，其包含；

制备从受试者获得的活的原代乳腺癌细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

使从受试者获得的(1)活的原代乳腺癌细胞的样品的第一部分与已知上调或下调雌激素相关信号传导通路的干扰剂接触，并且(2)使第二部分与该干扰剂和已知抑制相同雌激素相关信号传导通路活性的确认剂接触；

连续测量样品的每个部分中活的原代乳腺癌细胞的生理应答参数；

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异；并且

将该被测变量与从雌激素受体通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时，选择受试者用于激素疗法。

在另一个实施例中，在与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替。

影响ERα信号传导通路的合适的干扰剂是本领域已知的并且在本文中公开，例如雌二醇。在另一个实施例中，使活的原代癌细胞进一步与抑制雌激素相关信号传导通路活性的确认剂例如选择性雌激素受体下调剂接触。在另一个实施例中，使肿瘤细胞进一步与靶向ERα信号传导通路的靶向治疗剂接触，并测量靶向治疗剂对细胞粘附或附着的影响。靶向ERα信号传导通路的合适的靶向治疗剂是本领域已知的并且在本文中公开，例如氟维司群和他莫昔芬。该方法可以进一步包含向受试者给予靶向治疗剂。

在又另一个实施例中，本发明提供了选择具有非过表达、未扩增的ErbB2癌的受试者用影响ErbB信号传导通路的靶向治疗剂治疗的方法，该方法包含；

制备从受试者获得的活的原代癌细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

使从受试者获得的(1)活的原代癌细胞的样品的第一部分与干扰剂接触，使(2)样品的第二部分与干扰剂和确认剂接触，其中干扰剂选择性地影响ErbB信号传导通路且确认剂选择性地抑制干扰剂对相同ErbB信号传导通路的影响；

连续测量样品的每个部分中活的原代癌细胞的生理应答参数；

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异；

将该被测变量与从ErbB信号传导通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时选择受试者用影响ErbB信号传导通路的靶向治疗剂进行治疗。

在另一个实施例中，在与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替。

影响ErbB信号传导通路的合适的干扰剂是本领域已知的并且在本文中公开。在一个实施例中，将活的原代癌细胞与已知可抑制ErbB相关信号传导通路信号传导的确认剂(例如2C4小鼠单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂)接触。在另一个实施例中，使活的原代肿瘤细胞进一步与靶向ErbB信号传导通路的靶向治疗剂接触，并测量靶向治疗剂对细胞粘附或附着的影响。靶向ErbB信号传导通路的合适靶向治疗剂是本领域已知的并且在本文中公开。该方法可以进一步包含向受试者给予靶向治疗剂。

在另一个实施例中，本发明提供了选择具有非过表达的未扩增的ErbB2乳腺癌的受试者用于拉帕替尼进行的疗法的方法，其包含：

制备从受试者获得的活的原代乳腺癌细胞的样品并在基础培养基中培养该样品；

在使样品与干扰剂接触之前不小于12小时但不超过72小时，将用于培养该样品的基础培养基用新鲜的基础培养基代替；

使从受试者获得的(1)活的原代乳腺癌细胞的样品的第一部分与作为干扰剂的神经调节蛋白接触，并且使(2)样品的第二部分与神经调节蛋白和确认剂接触，其中该确认剂选择性地抑制与神经调节蛋白相同的ErbB信号传导通路；和/或使(3)样品的第三部分与作为干扰剂的表皮生长因子接触，并且使(4)样品的第四部分与表皮生长因子和确认剂接触，其中该确认剂选择性地抑制与表皮生长因子相同的ErbB信号传导通路；

连续测量与干扰剂接触的活的原代乳腺癌细胞的细胞粘附或附着；

通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异和/或样品的第三部分和样品的第四部分之间的值上的差异；并且

将该被测变量与从ErbB通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较；

其中当被测变量大于截止值时，选择受试者用拉帕替尼治疗。

可替代地，上述相同的方法可以应用影响ErbB信号传导通路的其他靶向治疗剂，而不是拉帕替尼。下表(表4)总结了通路、药物靶标和旨在治疗ErbB信号传导通路癌症的靶向疗法

表4：

除了用于选择受试者用靶向治疗剂进行治疗的上述方法之外，本发明还包罗用靶向治疗剂治疗受试者的方法，该方法包含将靶向治疗剂给予受试者，其中受试者被选择通过应用上述用于选择受试者进行治疗的方法之一，使用来自受试者的活的原代细胞样品，用靶向治疗剂进行治疗。

C.选择或监测治疗剂功效的方法

像癌症这样的疾病是异质性的，部分原因是来自一个个体中的部位的癌症在基因组成、蛋白质表达水平和对治疗干预的应答上可以完全不同于另一个个体中的相同部位的癌症。疾病组织可以在基因表达或基因改变中彼此显著变化。例如，转移性肿瘤可能与原代肿瘤不同。人类基因组测序和其他基因量化工具已经告知医生，每位患者的疾病对于那位患者来说有些独特。此信息已经产生了关于个体化用药的全部业务，其中每个患者都可以接受为其疾病定制的治疗方案。

一些药物正靶向特定的基因相关疾病指征。这种途径还没有得到广泛的利用，主要是由于当前的预测工具集的显著缺点。本文所述的方法提供了选择针对个体疾病显示功效的治疗剂的方法。在实施例中，使治疗剂与从CReMS中的病变组织分离的无标签的活的全细胞接触，并且在治疗剂的存在下检测细胞生理参数的变化或其缺乏。选择治疗剂来治疗受试者，与基线测量相比，其导致疾病细胞生理参数的变化。

本公开的一个方面包括在受试者的初次诊断或整个治疗期间选择一种或多种治疗剂(包括商业上批准用于治疗疾病或紊乱的药物)的方法。在实施例中，该方法包含在细胞应答测量系统中向来自受试者的至少一个分离的疾病细胞样品给予一种或多种治疗剂；确定与给予该一种或多种治疗剂之前的细胞应答参数的基线测量相比，疾病细胞样品的细胞应答参数是否应答于该一种或多种治疗剂发生变化，其中细胞应答参数的变化表示该一种或多种治疗剂对个体受试者的疾病具有治疗功效。在某些实施例中，分离的疾病细胞样品包含无标签的全细胞。在其他实施例中，在指定时间段内连续监测分离的疾病细胞中的细胞应答参数的变化。在其他实施例中，该方法进一步包含选择导致至少一种细胞应答或生理参数变化的治疗剂或治疗剂组合，并将所选择的药剂传递给医疗保健提供者。在其他实施例中，该方法进一步包含给予导致至少一种细胞应答或生理参数变化的治疗剂或治疗剂组合。

在另一个实施例中，本发明提供了通过确定用在个体受试者的疾病上的药剂的治疗功效，选择用于个体受试者的治疗的方法，其包含：在细胞反应测量系统(CReMS)中将该药剂给予来自个体受试者的至少一种分离的无标签疾病细胞样品，其中该疾病细胞样品选自下组，该组由以下各项组成：癌细胞样品、来自患有自身免疫性疾病的受试者的细胞样品、来自被外来物质感染的组织的细胞样品及其组合；在指定时间段内连续测量在治疗剂的存在和/或不存在下细胞样品的至少一种生理应答参数的变化；并且确定细胞样品针对药剂的生理应答参数与基线测量相比的变化是否发生，其中生理应答的变化指示该药剂对个体受试者的疾病具有治疗功效。在实施例中，疾病细胞是癌细胞。

在其他实施例中，本发明提供了用于比较特定受试者的治疗剂的功效的方法，其包含在测量细胞的至少一种生理参数的装置中向来自相同受试者的单独疾病细胞样品给予至少两种不同的治疗剂；确定与基线测量相比，每个细胞样品对每种治疗剂的生理应答，其中生理应答指示每种治疗剂的功效。在某些实施例中，分离的疾病细胞样品包含无标签的全细胞。在其他实施例中，在指定时间段内连续监测分离的疾病细胞中的细胞应答参数的变化。在实施例中，该方法进一步包含选择导致更好功效的治疗剂或治疗剂的组合；并将选择传达给医疗保健提供者。在其他实施例中，该方法进一步包含给予导致对受试者更好的功效的治疗剂或治疗剂组合。

本公开的另一方面提供了确定肿瘤细胞生长速率的方法。通过测量肿瘤的生长速度，可以根据肿瘤细胞如何快地生长来选择治疗。如果肿瘤细胞是快速生长的肿瘤，医疗保健工作者将选择与用于生长较慢的肿瘤的治疗相比更积极的治疗。在某些实施例中，该方法包含在细胞应答测量系统中提供分离的肿瘤细胞样品，在指定的时间段内连续监测肿瘤细胞样品的生长速率，并且选择对那些显示出快速增长率的肿瘤细胞来说更积极的治疗和/或将所选择的治疗传达给医疗保健提供者。在其他实施例中，分离的疾病细胞样品包含无标签的全细胞。在其他实施例中，该方法进一步包含将所选择的治疗给予受试者。在实施例中，快速生长的肿瘤具有小于约100小时，优选小于20小时的细胞倍增速率，而较慢生长的肿瘤的细胞倍增速率为100小时或更长，其中细胞倍增速率是一个细胞分成两个细胞的时间。

在另一方面，本发明提供了用于确定如下的方法，即在来自个体受试者的活的原代疾病细胞样品中特定通路是否异常，和/或特定通路对确认剂是否敏感，以确认疾病细胞样品中通路的功能障碍。在这种方法中，可以获得在个体的疾病细胞样品中发挥作用的细胞通路的分布并随着治疗持续的时间进行监测。在某些实施例中，该方法涉及通过如下来表征疾病细胞样品中异常通路功能的存在，在细胞应答测量系统中向来自受试者的至少一种分离的活的原代疾病细胞样品给予一种或多种干扰剂和/或确认剂；确定与给予该干扰剂和/或确认剂之前的细胞响应参数的基线测量相比，活的原代疾病细胞样品的细胞响应参数是否响应于该干扰剂和/或确认剂发生变化，其中细胞应答参数的变化可以指示由该干扰剂活化或由该确认剂抑制的细胞通路在来自个体受试者的分离的活的原代疾病细胞样品中是异常的。在某些实施例中，干扰剂包括生长因子，蛋白质或其他配体(其与受体和细胞表面蛋白例如调蛋白结合，然后活化细胞通路)，细胞(包括具有活化疾病细胞样品中通路的细胞表面受体的转化细胞)，或小的有机分子(10,000道尔顿或更小)，肽，核酸(例如干扰RNA)，它们以期望的方式细胞内干扰细胞生理功能。在其他实施例中，确认剂包括(非限制性列表)如下那些，其抑制生长因子受体(如EGFR、Her2、PDGFR、TGFR、FGFR、TNFR、HGF、FGF、IGF、TNFα、TGFβ或VEGF受体)、拓扑异构酶活性、激酶、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、微管聚合、细胞骨架组织、细胞功能和细胞粘附。

例如，在一个实施例中，提供了用于确定从个体受试者获得的病变细胞中的细胞通路的功能状态的一种方法，其是通过将从受试者获得的病变细胞样品与已知可以激动或拮抗细胞通路的干扰剂(例如，活化剂)接触，连续测量样品中活的原代细胞的一种或多种生理反应参数，并且通过对连续测量的数学分析来确定在干扰剂存在下，相对于合适的对照，活的原代病变细胞样品中的一个或多个生理应答参数的变化量，其中在干扰剂存在下，相对于合适的对照，一个或多个生理应答参数的变化量指示干扰剂所靶向的细胞通路在个体受试者中是异常的。

在一个实施例中，可以使用对个体受试者中细胞通路的状态的认知来诊断信号传导通路驱动的疾病的存在。在另一个实施例中，用本文所述方法诊断的受试者被预测为对靶向信号传导通路疾病的治疗剂有应答。例如，如果来自受试者的病变细胞对干扰剂(例如，活化剂)异常应答，如通过在干扰剂存在下对一个或多个生理应答参数的连续测量的分析所确定的，受试者将可能应答于靶向与干扰剂相同的细胞通路的治疗剂。如果在干扰剂存在下，相对于合适的对照，在病变细胞样品的活细胞中发生一个或多个生理应答参数的变化，则来自受试者的病变细胞对干扰剂异常应答。

在另一个实例中，如果来自受试者的病变细胞没有对干扰剂(例如，活化剂)异常应答，如通过在干扰剂存在下对一个或多个生理应答参数的连续测量的分析所确定的，受试者将可能不会受益于给予靶向与干扰剂相同的细胞通路的治疗剂。如果在干扰剂存在下，在病变细胞样品的活细胞中一个或多个生理应答参数的变化小于合适的对照，则来自受试者的病变细胞对干扰剂正常应答。

因此，在另一方面，提供了选择用于个体受试者的靶向治疗剂的方法，该方法是通过如下进行：使从受试者获得的病变细胞样品与已知激动或拮抗细胞通路的干扰剂接触，连续测量样品中活细胞的一种或多种生理反应参数，并且通过对连续测量的数学分析来确定在干扰剂存在下，相对于合适的对照，病变细胞样品中发生的一个或多个生理应答参数的变化量，其中在干扰剂存在下，相对于合适的对照，一个或多个生理应答参数的变化量指示受试者将对靶向该细胞通路的靶向治疗剂有应答。

在某些实施例中，使从受试者获得的细胞样品的第一部分与干扰剂接触，并且使细胞样品的第二部分与干扰剂和确认剂接触。然后，该方法进一步包含连续地测量样品每个部分中的生理应答参数(例如，细胞粘附或附着)，随后通过对生理应答参数的连续测量的数学分析来确定被测变量，以鉴定样品的第一部分和样品的第二部分之间的值上的差异；随后将被测变量与从正常参考区间得到的截止值进行比较。当被测变量大于截止值时，选择靶向治疗剂。

在某些实施例中，该方法进一步涉及向受试者给予该靶向治疗剂(即，如果该受试者被确定为对该药剂有应答)。

在其他实施例中，该方法包含在细胞应答测量系统中向来自受试者的分离的疾病细胞样品给予一种或多种活化剂；确定与给予该干扰剂之前的细胞响应参数的基线测量相比，疾病细胞样品的细胞应答参数是否在限定的时间段内应答于该干扰剂而发生变化，向该分离的疾病细胞样品给予一种或多种确认剂，并且确定与给予该干扰剂之前或之后的细胞应答参数相比，疾病细胞样品的细胞应答参数是否在限定的时间段内应答于该确认剂而发生变化，其中相对于合适对照的细胞应答参数的变化量指示由该干扰剂活化并由该确认剂活化的细胞通路在来自该个体受试者的分离的疾病细胞样品中异常发挥作用。

另外的实施例包括用于选择受试者进行治疗、临床试验和/或评估患者对候选治疗剂的应答性的方法。在实施例中，在该候选治疗剂的临床试验之前选择受试者，以便仅选择那些最可能对候选治疗剂作出应答的患者；这种途径将增加候选治疗剂可以在所选择的患者群体内证明足以保证监管批准的功效的可能性，特别是对于仅能针对诊断具有该疾病的整个群体的一部分提供有效结果的治疗剂而言。考虑用于这种途径下的未经批准治疗的临床试验的患者将评估其病变细胞以确定异常信号传导通路活性的存在，以便预测其对未经批准的药物的应答性。只有那些证明存在异常信号传导通路活性的那些将被选中用于该试验。在其他实施例中，当将受试者的细胞的样品鉴定为应答者时选择受试者进行治疗，这是通过包含如下的方法进行：在细胞应答测量系统中向来自受试者的至少一个分离的疾病细胞样品给予一种或多种治疗剂；确定与给予该一种或多种治疗剂之前的细胞应答参数的基线测量相比，疾病细胞样品的细胞应答参数是否应答于该一种或多种治疗剂发生变化，其中细胞应答参数的变化表示该一种或多种治疗剂对个体受试者的疾病具有治疗功效。在某些实施例中，该方法进一步包含选择其细胞应答于用于治疗或临床试验的一种或多种治疗剂展现细胞应答参数的变化的受试者。

在另一方面，本发明提供了鉴定来自受试者的对治疗剂证明应答性或非应答性的疾病样品的生物标志物的方法。在一个实施例中，该方法涉及使来自受试者的分离的疾病细胞样品与细胞应答测量系统中的治疗剂接触；确定与给予该一种或多种治疗剂之前的细胞应答参数的基线测量相比，疾病细胞样品的细胞应答参数是否应答于该一种或多种治疗剂发生变化，其中细胞应答参数的变化指示该一种或多种治疗剂对个体受试者中的疾病具有治疗功效(应答者)，而缺乏变化指示治疗剂对该受试者的疾病没有疗效(无应答者)。在实施例中，该方法进一步包含进一步表征来自受试者的对于其他生物标志物的治疗剂有应答的细胞，和/或进一步表征来自受试者的对其他生物标志物的治疗剂无应答的细胞。生物标志物包含基因突变、单核苷酸多态性、基因表达水平、蛋白质、蛋白质突变、翻译后蛋白质修饰、剪接变体、细胞表面标志物、蛋白质或核酸的过表达、核酸(非限制性实例包括mRNA、miRNA或其他RNA)的扩增、细胞形态及其组合。

靶向疗法的功效取决于患者是否具有靶向疗法旨在影响的疾病(例如异常的信号传导通路活性)，无论其是否与靶标结合以及是否引起异常信号传导活性符合的变化。本文所述的方法测量干扰剂和/或确认剂和/或治疗剂对这些药剂旨在影响的通路的影响，这是通过测量细胞样品中对该一种或多种药剂的生理应答进行。基因组和蛋白质组学工具可用于鉴定受治疗剂和/或干扰剂(例如活化剂)影响的细胞通路组分的变化。因此，在一个实施例中，提供了鉴定个体受试者中受干扰剂和/或确认剂和/或治疗剂影响的细胞通路组分的方法，其是使从受试者获得的分离的无标签细胞样品与干扰剂和/或确认剂和/或治疗剂接触，通过连续测量样品中活细胞的至少一个生理应答参数来监测药剂的影响，通过对连续测量的数学分析确定生理应答参数是否发生变化，从而表征样品对该一种或多种药剂的敏感性，停止干扰剂对样品的活性，并且使用选自以下的方法分析由该一种或多种药剂靶向的细胞通路的组分或生物标志物：蛋白质组学、qPCR、基因组学、RNA定量、串联液相色谱-质谱和代谢组学，从而确定细胞通路的组分是否被细胞样品中的一种或多种药剂改变。此方法可用于确定例如哪些细胞通路组分在干扰患者细胞中的通路时发生表达或活化(例如，磷酸化)的变化。

这些方法也可用于比较来自相同个体受试者的不同组织的两个细胞样品的通路活性。

在某些实施例中，干扰剂可以是药物、干扰剂的组合、包括活化剂和通路抑制剂的干扰剂的组合、包括不同通路成员的激动剂和拮抗剂的干扰剂的组合、或包括治疗剂的干扰剂的组合。

这些方法也可用于通过评估作为候选药物的小分子或抗体是否对其靶向的通路具有影响来增强药物发现过程。

在又其他实施例中，本发明提供了用于确定特定受试者的最佳治疗方案或药物组合的方法，该方法是通过在测量细胞的至少一种生理参数的装置中向来自相同受试者的单独疾病细胞样品给予多种治疗剂组合，其中将每个治疗组合给予到来自相同受试者的单独疾病细胞样品；并且与基线测量相比，确定每个细胞样品对每个治疗组合的生理应答，其中生理应答指示潜在治疗组合中的最有效的治疗组合。在某些实施例中，该方法进一步包含选择导致至少一种细胞应答或生理参数变化的治疗剂或治疗剂组合。在其他实施例中，该方法进一步包含将导致至少一种细胞应答或生理参数变化的治疗剂或治疗剂组合给予受试者。

在另一方面，本发明提供了包含通过选择用于治疗该疾病的治疗剂来治疗患者的疾病的方法，其包含在细胞应答测量系统中向来自受试者的至少一个分离的疾病细胞样品给予一种或多种治疗剂；确定与给予该一种或多种治疗剂之前的细胞应答参数的基线测量相比，疾病细胞样品的细胞应答参数是否应答于该一种或多种治疗剂发生变化，选择引起细胞应答参数变化的治疗剂；向受试者给予导致至少一种细胞应答或生理参数变化的治疗剂。治疗剂包括靶向特定生物学通路的那些，抑制细胞增殖的那些，增强细胞杀伤的那些，抑制炎症的那些，杀死微生物的那些和/或增强免疫应答的那些。在某些实施例中，当治疗剂靶向特定生物学通路时，其可与细胞表面受体相互作用并抑制配体对受体的作用。在本发明的另一个实施例中，通过检验来自患者活细胞或组织样品的上清液部分来测量生理应答参数或生物标志物。例如，一些乳腺癌细胞对于表皮生长因子受体(EGFR)是阳性的并且对表皮生长因子(EGF)有应答。可以在存在和不存在配体的情况下确定抑制EGF对个体受试者细胞的相互作用的治疗剂的功效。

在其他实施例中，治疗剂抑制细胞增殖和/或细胞杀伤。在这些情况下，可以在样品上测量细胞应答或生理参数的变化率，并且它指示治疗剂引起细胞死亡或抑制细胞增殖的功效。在实施例中，在存在和/或不存在治疗剂和已知增强增殖和/或抑制细胞杀伤的药剂的情况下测定细胞应答的变化率。

在本发明的其他方面，提供了试剂盒。在一个实施例中，试剂盒包含：用于来自个体受试者的疾病细胞样品的含有转运介质的容器；用于对照细胞样品的含有转运介质的容器；生物传感器；以及具有用于将来自生物传感器的数据转换成输出的计算机可执行指令的非暂时计算机可读介质，其中该输出在限定的时间段内显示细胞生理应答参数的变化，其中该细胞生理应答参数选自下组，该组由以下各项组成：pH、细胞粘附、细胞附着模式、细胞增殖、细胞信号传导、细胞存活、细胞密度、细胞大小、细胞形状、细胞极性、O₂、CO₂、葡萄糖及其组合；将输出分类为无应答、应答较弱、以及有应答；并产生分类的报告。

D.细胞样品

本发明的实施例包括用于确定治疗剂的有效性，监测有效性或当给予到受试者的病变细胞时确定治疗剂的剂量的系统、试剂盒和方法。

传统上，疾病由被疾病影响的组织或器官分类。由于对潜在机制(例如，遗传、自身免疫应答等)的更好的了解，现在可以理解，影响相同组织/器官或产生相同症状的疾病可能具有不同的病因并且可能具有异质基因表达概括。另外，在许多疾病中已经显示存在治疗剂的应答者和不应答者。在实施例中，可以在本文的方法中使用对其鉴定了应答者和非应答者的任何疾病类型，以便预测或预言药物的特定治疗药物组合是否对特定个体有效，例如确定个体是应答者还是无应答者。

已知在性质上是异质性的并且具有应答者和许多无应答者的疾病类型的一个实例是癌症。癌症典型根据组织类型分类。然而，对癌症异质性的更准确的描述反映在不同癌症的不同突变中。对癌症异质性的甚至更准确的描述是特定患者细胞中突变的实际功能性生理学结果。例如，乳腺癌具有不同类型和导致此器官的癌症的不同突变。结果和治疗可以基于引起癌症的突变是功能的增加(例如，原癌基因引起蛋白质产生增加)还是功能突变的丧失(例如肿瘤抑制基因)以及其中的基因而不同。由于特定癌症的异质性，期望会对特定治疗剂产生异质性应答。本发明的实施例允许针对一种治疗剂或一组治疗剂检验特定受试者的癌细胞以确定特定治疗剂或最有效的治疗剂对特定受试者的癌症的功效来选择用于受试者的治疗。

本发明的实施例包括来自个体受试者的癌细胞的疾病细胞样品。这样的癌细胞可以衍生自但不限于急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质细胞瘤、中枢神经系统非典型畸胎样/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、乳腺癌、中级分化的松质实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、松果体母细胞瘤、支气管癌、类癌瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、导管原位癌(DCIS)、子宫内膜癌、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文肉瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤、纤维组织细胞瘤、胆囊癌症、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质肿瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、心脏癌症、肝细胞癌、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西肉瘤、肾细胞癌、喉癌、唇癌、肝癌、小叶原位癌(LCIS)、肺癌、梅克尔细胞癌、黑色素瘤、间皮瘤、嘴癌、多发性骨髓瘤、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤样增生、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、鼻咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体实质、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、鳞状细胞癌、小肠癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌、以及威尔姆氏癌。

自身免疫性疾病的特征在于由于针对自身抗原的免疫系统活化而增加的炎症。当前的治疗靶向免疫系统细胞如B细胞和炎症分子如抗TNFα。疗法可以广泛地表征为免疫调节或免疫抑制剂。药物可以靶向特定分子，例如TNFα、整合素、鞘氨醇受体和白细胞介素。其他药物充当抗炎药，如皮质类固醇。在又其他情况下，药物是免疫抑制剂如巯基嘌呤和环磷酰胺。对于自身免疫病况，可以检查外周血细胞对某种治疗剂的应答。在其他实施例中，炎症部位的组织样品，例如类风湿性关节炎中的滑膜组织或溃疡性结肠炎的结肠组织。

例如，已知一些类风湿性关节炎患者是抗TNFα抗体的无应答者。在一个实施例中，外周血细胞可以从怀疑患有RA的患者获得，并且可以使用患者的TNF受体和相关的MAPK通路的细胞信号传导能力的降低来确定患者可能是免疫调节或免疫抑制剂化合物的应答者还是非应答者。同样地，可以以相同的方式检验其他治疗剂，如靶向IL-6、干扰素α、干扰素γ等的那些。在其他实施例中，已知具有多发性硬化症的患者是干扰素β无应答者。可以针对一组药物检验来自受试者的细胞样品，以通过诱导细胞生理参数的变化来查看这些药物中哪种对于特定受试者是有效的。有利结果的实例将是美国风湿病学会(ACR)标准确定的细胞炎症参数的减少或针对增强血脑屏障功能的细胞粘附的增加。

在其他实施例中，患者可能具有由微生物、异物或外来物感染细胞引起的疾病。可以评估感染微生物的血细胞或组织样品对各种抗生素、抗病毒剂或其他治疗候选物的应答性。例如，有许多不同的针对丙型肝炎感染的治疗剂降低病毒功能，可以将感染的组织样品与一种或多种治疗剂接触，并检测细胞生理参数的变化。选择提供感染组织的细胞生理参数变化的治疗剂和/或在最低剂量下提供细胞生理参数变化的治疗剂。如细胞存活增加或细胞生长增加的结果将被认为是有利的。在其他实施例中，其中治疗剂被设计成直接影响人细胞，例如通过阻断病毒进入(凭特异性受体类型)或细胞通路干扰，可以检验患者细胞的受体结合或所述治疗剂的通路干扰，如本文其他实施例所述的。

在实施例中，可以在治疗开始、治疗期间、治疗后、缓解期间和复发时获得细胞样品。本文所述的方法可用于在治疗之前、治疗期间、患者产生抗性时和复发时预测治疗功效。本公开的方法还用于预测治疗剂或药剂组合的应答者或非应答者。

在某些实施例中，细胞不与任何种类的固定剂接触或被其处理，或包埋入石蜡或其他材料或者任何可检测标签。在其他实施例中，优选的是细胞保持完整、有活力和/或无标签的。因此，可以使用活的原代细胞作为细胞样品。在一些其他实施例中，针对病变组织和健康组织提供细胞样品。在一些实施例中，细胞样品以有活力和固定的两种形式提供。以固定形式提供的细胞样品可充当对照以与根据本文所述方法分析的活细胞进行比较，特别是针对附加生物标志物的改善的鉴定和相关性。

在本发明的其他实施例中，使用来自个体受试者的细胞来确定治疗有效性。可以通过公知的方法(即拭子、活检物等)收集和分离细胞。可以使用病变和非病变细胞两者。非病变细胞可以用作阴性对照、基线测量、随时间测量的比较等。在实施例中，也可以获得来自相同受试者的组织细胞的对照样品。对照样品可以取自受试者的另一健康组织或取自与病变组织样品相同的器官的健康组织，或者更优选地，健康组织取自无疾病的个体。病变细胞是从具有活动性疾病的组织中提取的细胞。在一个实施例中，病变细胞可以是肿瘤细胞，例如乳腺癌细胞。癌性细胞不一定必须从肿瘤中提取。例如，可从白血病患者的血液中收集白血病细胞。可以从不同的组织部位例如转移部位、循环肿瘤细胞、原发性肿瘤部位和再发性肿瘤部位收集细胞，并且将细胞应答性彼此比较。在另一个实施例中，病变细胞可以从自身免疫性疾病如类风湿性关节炎的部位中提取。在某些实施例中，每个组织样品中的细胞数目优选为至少约5000个细胞。在其他实施例中，组织样品中的细胞数目可以在约5000至100万个细胞或更大的范围内。细胞样品包括来自(但不限于)血液、血清、血浆、尿液、精子、精液、精浆、前列腺液、预射出液(考珀液(Cowper's fluid))、排泄物、眼泪、唾液、汗水、活检物、腹水、脑脊液、淋巴、骨髓或头发。在一些其他实施例中，细胞样品可以含有或衍生自患者血清、其部分、细胞器、成纤维细胞、基质细胞、间充质细胞、上皮细胞、白细胞、红细胞、B细胞、T细胞、免疫细胞、干细胞或其组合。

在一个实施例中，从受试者提取细胞是在与CReMS相同的位置(例如，实验室、医院)。如此，可以将细胞悬浮或保存在公知的转移介质中，从而从受体到生物传感器桥连时间。在另一个实施例中，在与CReMS不同的位置从受试者中提取细胞。一旦获得，将细胞样品维持在保留细胞活力的培养基中。根据转运到分析部位的时间长短，可以采用不同的培养基。在实施例中，当组织样品的转运可能需要长达10小时时，培养基的重量摩尔渗透压浓度低于400msm/L，并且包含Na+、K+、Mg+、Cl-、Ca+2、葡萄糖、谷氨酰胺、组氨酸、甘露醇、色氨酸、青霉素、链霉素，含有必需氨基酸，并且可以另外含有非必需氨基酸、维生素、其他有机化合物、微量矿物质和无机盐、血清、细胞提取物或生长因子、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、乙醇胺、磷酰乙醇胺、三碘甲状腺原氨酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺，以支持人类原代细胞的增殖和平板效率。这种培养基的实例包括赛里西欧(Celsior)培养基、洛斯维公园纪念研究所(RPMI)培养基、汉克斯(Hanks)缓冲盐水和McCoy's 5A、伊格尔氏必需基本培养基(Eagle's Essential Minimal Media，EMEM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、莱博维茨(Leibovitz)L-15或其用于实践原代细胞护理的修饰。在实施例中，培养基和容器是无内毒素、非致死性和无DNA酶和无RNA酶的。

在其他实施例中，使用包括组织标本的切碎和酶消化、按细胞类型对提取的细胞的分离和/或对提取的细胞的培养的步骤来提取从个体受试者的组织标本获得的病变细胞。培养试剂可以包括各种补充剂，例如患者血清或患者衍生因子。

另一方面包括从组织标本中提取细胞器的方法，其随后可用于确定治疗剂在个体受试者中的功效。这种方法包含切碎和酶消化步骤。另一方面包括培养来自组织标本的细胞器的方法，其随后可用于确定治疗剂在个体受试者中的功效。这种方法包含切碎、酶消化、按细胞类型分离和培养步骤。另一方面可以包括如此分离的细胞的特异性重组以执行本文所述的方法。

在某些实施例中，在评定来自受试者的活细胞样品中的信号传导通路活性之前，首先在不含血清以及可以干扰待评定的信号传导通路(即，通过正被评估在受试者细胞中的有效性的靶向治疗剂处理的信号传导通路)的任何药剂的培养基中培养细胞，使得细胞关于生理状态和通路干扰同步。在某些实施例中，将细胞样品在不含血清和生长因子的培养基中培养。在其他实施例中，将细胞在维持功能性细胞环状腺苷一磷酸(cAMP)、功能性甲状腺受体和/或功能性G蛋白偶联受体(或上述性质的两种或三种的任意组合)的培养基中进行培养以支持人类原代细胞的增殖和平板功效。

E.细胞应答测量系统(“CReMS”)

本发明的系统和方法利用细胞应答测量系统(CReMS)。CReMS是指可以定量地确定细胞的细胞内和细胞间以及细胞和仪表装置之间的生理参数的变化的装置。通过测定分析物(包括非限制性实例，例如细胞外基质、细胞信号传导分子或细胞增殖、组织、细胞、代谢物、分解代谢物、生物分子、离子、氧、二氧化碳、碳水化合物、蛋白质等)的变化来测量生理参数的变化。在实施例中，生物传感器正在测量分离的完全的无标签活细胞中生理参数的变化。在实施例中，选择可以测量由于治疗剂和/或活化剂类型引起的期望变化的生物传感器。

CReMS的一个实例是生物传感器。生物传感器的实例是电化学生物传感器、电生物传感器、光学生物传感器、质量敏感生物传感器、热生物传感器和ISFET生物传感器。电化学生物传感器测量电位、电流和/或伏安特性。电生物传感器测量表面电导率、阻抗、电阻或电解质电导率。光学生物传感器测量荧光性、吸收、透射率、密度、屈光指数和反射。质量敏感生物传感器测量压电晶体的共振频率。热生物传感器测量反应热和吸附。ISFET生物传感器测量离子、元素和简单分子如氧气、二氧化碳、葡萄糖和生命科学中其他感兴趣的代谢物。在实施例中，生物传感器选自下组，该组由以下各项组成：阻抗装置、光子晶体装置、光波导装置、表面等离子体共振装置、石英晶体共振器/微量天平和微型悬臂装置。在实施例中，光学生物传感器可以包含用于转换活细胞、病原体或其组合中的分子识别或分子干扰事件的光学转导器。在特定实施例中，该装置是阻抗装置。

在用于测量蛋白质或其他体外生物分子相互作用的生物传感器的实例中，将特定蛋白质质量的捕获转化为有意义的生物化学和生物物理学值。应用关于涉及所捕获的特定蛋白质的分子量的捕获质量的简单计算，评估摩尔数，导致平衡结合常数和本领域技术人员已知的其他相互作用描述值。在用于细胞测定的生物传感器的实例中，在通过特异性细胞通路施加外部化学或其他刺激物时，细胞表面上的特异性粘附分子调节在传感器和其他附近细胞的表面附近处它们的附着和形态。

生物传感器可以检测采用来应答刺激物的这些调节，这些调节可以以对于细胞内的刺激物和通路独特的方式来选择。当正确设计时，所述细胞测定的生物传感器结果可以在分子和功能方面精确定量。所述生物传感器结果可以是进一步独特性的时间应答模式。已知打开和关闭细胞内特定通路的生物分子活化剂或干扰剂可用作确定CReMS生物传感器信号特异性的对照。生物传感器结果的时间应答的曲线去卷积方法(例如，与对照应答的非线性欧氏距离比较)可用于进一步更细微地详述特定的细胞应答。在细胞生物传感器测定中使用滴定外部刺激也可以提供进一步的生物化学和生物物理参数描述。

无标签传感器的一个实例是高频石英共振器或石英晶体微量天平(QCM)或共振悬臂。共振器包括表面上具有有图案的金属电极的石英晶体。当施加电压时，石英材料具有充分表征的共振特性。通过以特定频率向电极施加交流电压，晶体将以特征频率振荡。当质量被捕获在传感器表面上时，以定量方式调节振荡频率；额外的质量导致较低的共振器频率。因此，通过测量石英振荡器的共振频率的小变化，可以测量沉积物质的非常小的变化，而不将标签附着到正在研究的生物分子或细胞上。

离子选择性场效应晶体管(ISFET)装置是小型化纳米尺度的装置，它们能够测量选择的离子、元素和简单分子如氧气、二氧化碳、葡萄糖和生命科学中其他感兴趣的代谢物。它们已经在机电执行层面和生物应用层面被广泛描述。迄今为止，还没有描述过将它们与特定患者的细胞一起使用以将其应答或抗性或时间模式识别为在疾病过程中提出的治疗干预。

光学生物传感器被设计成产生耦合到传感器表面的光的一些特征上的可测量变化。这种途径的优点是不需要激发源(传感器的照明光源)、检测转导器(聚集反射光或透射光的装置)及转导器表面本身之间的直接物理联系。换句话说，不需要与光学生物传感器的电连接，简化稳定和研究大多数生物系统所需的用于将传感器与流体连接的方法。所有光学生物传感器不是直接检测质量，而是依靠检测物质的介电常数产生可测量的信号。介电常数的变化与自由空间中的光速与介质中的光速之比的差异有关。此变化基本上代表介质的屈光指数。屈光指数形式上定义为介质的介电常数的平方根(这种关系更明确的处理参见麦克斯韦方程)。光学生物传感器依赖于如下事实，即所有生物材料如蛋白质、细胞和DNA具有高于自由空间的介电常数。因此，这些材料都具有减慢通过它们的光速的内在能力。光学生物传感器被设计成将光通过含有生物材料的介质的传播速度的变化转化成与捕获在传感器表面上的生物材料的量成比例的可量化信号。

不同类型的光学生物传感器包括但不限于椭圆计、表面等离子体共振(SPR)装置、成像SPR装置、光栅耦合成像SPR装置、全息生物传感器、干涉生物传感器、反射干涉光谱(RIFS)、比色干涉生物传感器、差分干涉仪、哈特曼干涉仪、双极化干涉仪(DPI)、波导传感器芯片、集成输入光栅耦合器装置、啁啾波导光栅装置、光子晶体装置、基于伍德异常的的导引模式共振滤波器装置、三角形银粒子阵列。并且进一步包括测量电磁波谱的各种波长包括但不限于可见光、紫外线、近红外线和红外线的装置。操作模式包括但不限于散射、非弹性散射、反射、吸光度、拉曼、透射率、横向电波和横向磁波。

表面等离子共振装置是光学生物传感器类型，其通过检测局部屈光指数的变化来测量金属表面的生物分子的结合事件。通常，高通量SPR仪器由自动采样机器人、高分辨率CCD(电荷耦合装置)相机和镀金或银镀玻璃滑动芯片组成，每个芯片都有四个以上的阵列单元嵌入塑料支架平台。SPR技术利用可以在某些金属(最突出的是银和金)界面激发的表面等离子体(特殊电磁波)。当入射光以大于临界角的角度与金属界面耦合时，由于能量从入射光到表面等离子体的共振转移，反射光呈现出反射率的急剧衰减(SPR最小值)。生物分子在表面的结合改变局部屈光指数，并导致SPR最小值的偏移。通过监测SPR信号的变化，可以实时地测量表面的结合活性。

由于SPR测量基于屈光指数变化，所以分析物的检测是无标签和直接的。分析物不需要任何特殊的特征或标签(放射性或荧光性)，并可直接检测，无需多步检测协议。测量可以实时进行，允许收集动力学数据和热力学数据。最后，SPR能够检测广泛的分子量和结合亲和力的大量分析物。因此，SPR技术作为细胞应答测量系统是相当有用的。

在本实施例中描述了用于测量患者活细胞的复阻抗变化(ΔZ或dZ)的CReMS，其中阻抗(Z)与如欧姆定律(Z＝V/I)所述的电压与电流的比率相关。例如，将恒定电压施加到患者细胞附着的电极，产生以不同频率在细胞周围、细胞间以及穿过细胞流动的电流。此CReMS对与细胞的电极界面处的局部离子环境敏感，并且检测这些变化作为电压和电流波动的函数。作为正常功能或干扰的结果，细胞的生理变化导致电极周围的电流的可量化变化并影响在这样的CReMS中测量的信号的幅度和特征。

在某些实施例中，生物传感器利用事件特异性检测总体表型的变化。总体表型包含选自下组的一种或多种细胞应答参数，该组由以下各项组成：pH、细胞粘附、细胞附着模式、细胞增殖、细胞信号传导、细胞存活、细胞密度、细胞大小、细胞形状、细胞极性、O₂、CO₂、葡萄糖、细胞周期、合成代谢、分解代谢、小分子合成和产生、代谢回转、以及呼吸作用、ATP、钙、镁和其他带电离子、蛋白质、特异性通路成员分子、不同细胞区室中的DNA和/或RNA、基因组学和蛋白质组学、翻译后修饰和机制、第二信使水平、cAMP、mRNA、RNAi、microRNA和其他具有生理功能的RNA、及其组合。关于事件特异性，选择如下细胞参数，其反映作为该类型的治疗剂和/或活化剂的期望变化的细胞样品的变化。例如，如果已知治疗剂靶向细胞骨架元件，则与这种药物接触的细胞将期望在药剂存在下显示出细胞粘附的变化。

在其他实施例中，附着模式的变化是细胞粘附的变化。在一些情况下，细胞粘附的变化由屈光指数的变化或阻抗的变化表示。在又其他实施例中，附着模式的变化是基础形态的变化、细胞密度的变化、或细胞大小或细胞形状的变化。在特定实施例中，基础形态的变化是细胞极性的变化。在实施例中，细胞信号传导的减少指示细胞骨架组织的变化。

在其他实施例中，本公开的方法提供了无标签并且可以实时测量的细胞样品的分析。在一个实施例中，分析的细胞样品是无标签的、有活力的，并且不经受用以固定细胞的任何处理。在另一个实施例中，本公开的方法和试剂盒中使用的治疗剂和/或活化剂也是无标签的。迄今为止，无标签方法尚未用于有效地确定治疗功效。

无标签测定可以通过减少标签测定的时间和误导性并发症来减少筛选活动的时间和成本。可以鉴定和定量基因表达、基因突变和蛋白质功能的测定以能够进行大规模并行的格式进行。通过无标签测定，可以更经济地同时进行数万到数百万的蛋白质-蛋白质或DNA-DNA相互作用。

与各种各样的标签方法相比，有相对较少的无标签方法允许检测分子相互作用，并且对于细胞功能甚至仍然更少。无标签检测消除了由标签对治疗剂和活化剂的分子折叠、细胞上活性位点的阻断的影响产生的实验不确定性，或者对在实验中找到对所有分子相等发挥作用的可被有效地放置在细胞内的适当标签的无力。无标签检测方法大大简化了测定开发所需的时间和精力，同时消除了来自猝灭、保质期和背景干涉的实验假象。

标签是生物化学和基于细胞的测定的支柱。标签包含所有测定方法的大多数，并且必须克服若干问题，特别是在人类活细胞中的复杂动态活性研究的背景下。使用放射性标签产生大量受污染的物质，并且必须在具有监管方法的专门设施中使用，以防止伤害(在细胞水平上)使用它们的那些人。荧光团的激发/发射效率由于时间和光暴露而降低，降低了使标签准确和精确的能力，并且需要仅以端点方式读取一次测定，使得不能获得时间信息。所有基于标签的测定都需要大量的时间来开发以均匀和统一的方式附着标签的工艺，确定标签将是线性定量的，并且不会干扰或影响正测量的相互作用或过程。标签在复杂混合物中的统一施加由于过程自然进行所需的所有分子的存在而变得复杂。标签的添加仅允许间接地将该分子功能可视化，而不是直接地将整个系统功能可视化(即，可能需要一些扩展假设)。细胞活性甚至更难用标签进行准确测量。一个有用的检验必须弄清标签如何在正确的位置上以正确的方式进入正确的分子，并确定标签不会妨碍正常的细胞过程。

无标签检测通常涉及使用能够直接测量生物化合物或生物实体如DNA分子、肽、蛋白质或细胞的一些物理性质的转导器。所有生物化学分子和细胞具有体积、质量、粘弹性、介电常数、热容和导电性的有限物理值，其可用于指示其存在或不存在、增加或减少、以及使用一个类型的传感器进行的修饰。另外，生活系统利用分子来提供能量并实现其生命过程，例如O₂/CO₂消耗/产生、葡萄糖生产/消耗、ATP生产/消耗，它们导致可测量的变化，例如有限时间段内的其环境中的pH。该传感器作为可以将这些物理特性之一转换为可量测信号(例如可测量的电流或电压)的转导器发挥作用。

在一些情况下，为了使用转导器作为生物传感器，转导器的表面必须具有选择性捕获诸如蛋白质的特定材料或特定细胞类型的能力，同时不允许不希望的材料附着。选择性检测能力是通过在转导器表面上构建化学分子的特定涂料来提供的。将附着于传感器表面的材料称为传感器涂料，而将检测到的材料称为分析物。因此，在一些情况下，生物传感器是可以从附接到转导器的材料产生可测量信号的转导器与含有可以从检验样品结合靶标分析物的受体配体的特定识别表面涂料的组合。

在某些实施例中，选择与特定细胞组分或通路相关联的生物传感器的涂料。例如，在那些情况下，其中细胞生理参数是细胞粘附的变化，选择提供细胞样品中细胞粘附到生物传感器表面的涂料。在实施例中，增强细胞粘附到生物传感器的涂料包括细胞外基质、纤连蛋白、整合素等。在其他实施例中，选择基于细胞表面标志物结合特定细胞类型的涂料。在实施例中，这样的细胞表面标志物包括CD20、CD30、EGFR、EGFR-TK、PI3K、MEK1、MEK2、HER2受体、Her3受体、Her4受体、VEGFR和其他细胞表面癌症生物标志物。

在其他实施例中，生物传感器涂覆有生物分子涂料。在加入细胞之前、在加入细胞期间或在加入细胞后，接触细胞的CReMS表面可以含有生物分子涂料。涂覆材料可以是合成的、天然的、动物来源的、哺乳动物的、或由放置在传感器上的细胞产生的。例如，生物分子涂料可以包含已知接合整合素、粘附素、钙粘蛋白和其他细胞粘附分子的细胞外基质组分和细胞表面蛋白(例如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、胶原、细胞间CAM、血管CAM、MAdCAM)或其衍生物，或者可以包含生物化学物质，如作为基于天然发生的生物化学物质赖氨酸和鸟氨酸的聚合物分子的聚赖氨酸或聚鸟氨酸，基于天然发生的生物化学物质如氨基酸的聚合物分子可以使用天然发生的生物化学物质的异构体或对映异构体、抗体、抗体的片段或肽衍生物、补体决定区(CDR)，其设计用于将特异性细胞表面蛋白附着于生物传感器。

将活细胞附着到微孔板的方法可以包括例如用具有设计成与生物传感器的表面相互作用的一端和设计为与肽上的官能团反应的另一端的反应性分子涂覆传感器微孔板表面。例如，当使用镀金生物传感器时，反应性分子可以包括硫原子或设计成与生物传感器表面在化学上相互作用的其他化学部分。分子的另一端可以与例如肽上的酰胺或羧基特异性反应。

在另一个实例中，生物传感器表面可以涂覆有通过范德华力、氢键、静电吸引、疏水相互作用或这些的任何组合(例如本领域中实践的可以用于施加蛋白质的一种)粘附的分子。细胞外基质(ECM)分子也可以加入到第一表面分子涂料中。汉弗莱斯(Humphries)2006整合素配体一览(Integrin Ligands at a Glance).细胞科学杂志(Journal of CellScience)119(19)p3901-03描述了用于本发明的粘附分子。可用于接触特定细胞粘附分子的另外的ECM分子包括高田(Takada)等人，基因组生物学(Genome Biology)8:215(2007)的表1所述的那些。这个实例是针对细胞-ECM和细胞-细胞粘附中涉及的整合素。许多其他粘附分子已被描述为具有与生理控制和应答相关的性质。(见下表5)。

表5：

另外的涂料可以包括抗体或已知对患者细胞表面蛋白具有亲和力的其他蛋白质，以便使得患者细胞与生物传感器紧密接近，目的是执行本文所述的方法。确认患者细胞以所需的方式附着到微孔板也可能是有益的。另外可以使用特异性生物传感器涂料来通过将传感器涂料连接到特定的细胞通路来增强、改善、澄清、分离或检测来自特定患者细胞类型的特定细胞信号和对干扰和治疗剂的细胞信号传导应答(参见例如海因斯(Hynes)，整合素(Integrins)，细胞(Cell)，110:673-687(2002))。生物传感器包含用以接种细胞的区域。例如，生物传感器可以包含含有用以接种细胞的孔的微量滴定板。一个或多个细胞样品可以通过物理吸附到不同位置的表面而接种在生物传感器上。生物传感器可以包含1、10、24、48、96、384个或更多个不同的位置。细胞样品可以包含约100至约100,000个单个细胞或其间的任何细胞数目。最佳细胞样品取决于生物传感器上不同位置的大小和性质。细胞样品可以包含约5000个细胞或更少；约10,000个细胞或更少；约15,000个细胞或更少；约20,000个细胞或更少；约25,000个细胞或更少；或约50,000个细胞或更少。细胞样品可以包含约1000至约2500个细胞；约1000至约5000个细胞；5000至约10,000个细胞；约5000至约15,000个细胞；约5000至约25,000个细胞；约1000至约10,000个细胞；约1000至约50,000个细胞；和约5000至约50,000个细胞。

在某些实施例中，在限定的时间段内测量细胞应答或生理参数的变化。在其他实施例中，所定义的时间段是对照细胞达到其中生理参数的输出变化改变20％或更少的稳定状态所花费的时间量。在其他实施例中，细胞中的变化在1小时或更少的时间内观察到。在其他实施例中，细胞中的变化在至少1分钟至约60分钟内以及之间的每一分钟观察到。在其他实施例中，从约10分钟至约一周或200小时测量细胞应答的变化。在其他实施例中，当治疗剂靶向细胞通路时，从约10分钟至约5小时、约10分钟至约4小时、约10分钟至约3小时、约10分钟至约2小时、约10分钟至约1小时、或约10分钟至约30分钟或之间的任何时间点测量细胞应答。在其他实施例中，当治疗剂影响细胞增殖或细胞杀伤或细胞抗性时，从约1小时至约200小时测量细胞应答。在又其他实施例中，使用1分钟至200小时之间的应答的组合(以其他方式描述为完整时间模式)来确定化合物对细胞的治疗效果和细胞发展抗性的能力。此时间框架包罗短期通路信号传导、动态重编程和长期细胞应答的重要过程，其在评定患者可能的应答和维持该应答中是重要的。

一旦特定受试者的细胞接种在生物传感器上，就可以确定基线测量。基线测量可以在相同的细胞样品或对照细胞样品上进行。对照样品可以包含来自相同患者和/或相同组织的健康细胞或病变细胞。对照样品可以包含没接受干扰剂或药剂的病变细胞。对照样品可以包含已知对该药剂作出应答的疾病细胞。在其他实施例中，对照样品包含已知不应答于该药剂的疾病细胞。对照样品可以包括向特定患者的健康或病变细胞施加活化剂，其被设计为引发与细胞健康、细胞代谢或细胞通路活性相关的标准化应答。

将针对每种疾病和/或药物类型来确定对照。在一个实施例中，这涉及与来自相同患者的健康细胞对照的比较或与非病变患者池(例如正常参考范围)的结果的比较。例如，使用细胞杀伤药物，该方法将显示杀死疾病细胞超过健康细胞的益处，以达到显著的治疗指标。其他实施例包括使用通路工具来确定通路功能和药物控制。对于靶向治疗剂，这些工具可以是干扰剂(例如活化剂)、生物药剂或小分子，其用作对照以干扰通路并确定靶向药物破坏干扰的能力。在又其他实施例中，在没有活化剂的外源性干扰的情况下测量药物对细胞的生理影响，注意到例如时间模式或氧消耗速率、酸化速率或时间模式、离子通量或代谢物周转。

在特定实施例中，在连续的时间过程中测量生物传感器信号。在时间与生物传感器信号图上有与众不同的图案，其指示患者细胞对药物治疗的应答。对这些模式的评估对于鉴定有效事件的存在是有用的。活体和全功能细胞的时间过程或不断变化的测量比仅代表一个时间点的典型全细胞测定中使用的当前实践更有益。本文所述的方法测量动态系统，因为它们将发生在患者体内，并且代表确定患者应答的最准确的手段。在路径应答的情况下，完整的时间过程或时间模式的记录在支持更复杂的分析的能力方面是优越的，并且避免选择单个测量的最佳时间点。

与对照的比较可以在时间最大值、最小值发生或作为最大信号-最小信号之间的差异，或者通过比较时间过程图的曲线下积分面积(AUC)，或者检验孔与阳性或阴性对照孔的其他非线性比较(例如差分向量的和)或者相同患者活病变细胞的干扰和未干扰孔的比较。仅通过用生物传感器进行测量支持的另外的分析是达到最大值/最小值的时间和时间过程的其他衍生物。在长期应答的情况下，比较的时间可以是在几天或一周的治疗或多次施用药物之后的特定时间点。更长的时间过程也可以在一周药物治疗的开始、中期或结束时比较斜率变化或比较时间与生物传感器信号图。与对照相比的显著变化可能包括生物传感器信号与削减细胞代谢相关的绝对下降。可替代地，下降之后可以是增加，其可以指示在测定期间药物抗性的发展。此外，非线性欧几里德分析可用于在整个时间过程内产生对照和患者样品之间的总差异的度量。这对于预测患者的结果也是重要的。

在某些实施例中，生物传感器在限定的时间段内的输出表示为细胞指数。细胞指数是检验起点的阻抗变化。细胞指数被定义为阻抗的度量，并且可以通过以例如10kHz的固定电频率和固定电压测量在本发明的一个实例中应用。

并且通过如下方程式计算：细胞指数_i＝(R_tn-R_t0)/F

其中：

i＝1、2或3个时间点

F＝15欧姆，在仪器以10kHz频率工作的情况下

R_t0是在时间点T0测量的背景电阻。

R_tn是在细胞添加、细胞生理变化或细胞干扰之后的时间点Tn测量的电阻。

细胞指数是一个无维量参数，表示所测量电阻抗的代表细胞状态的相对变化。当细胞不存在或不能很好地附着在电极上时，CI为零。在相同的生理条件下，当更多的细胞附着在电极上时，CI值更大。因此，CI是在孔中存在的细胞数目的定量度量。此外，细胞生理状态的变化，包括细胞形态，基础、稳定或静止状态的变化，细胞粘附或细胞活力，将导致CI的变化。

基于起点或基线阻抗测量，细胞指数是存在、密度、附着或其变化的定量测量。基线起点阻抗是在用药物或其他干扰剂进行任何处理之前细胞的健康、活力和生理状态的物理可观察特征和指示。基线起点可用作CELx检验的定性对照。药物或干扰剂的添加导致阻抗在时间模式上的变化，反映细胞经历的细胞生理变化的特异性。细胞生理状态例如细胞形态、细胞数目、细胞密度、细胞粘附或细胞活力的变化将导致细胞指数的变化。

生理应答参数可另外包括细胞周期分析，并且可以使用任何数量的化学生物传感器(例如共轭或未共轭的荧光染料)或与功能通路和功能障碍通路相关的患者细胞中的其他比色变化来测量。例如使用未共轭的染料，细胞群的细胞周期变化可以用碘化丙啶或已知插入DNA中的相似染料来定量，并且通过评定DNA量的变化与G0、G1、S、G2、Gm期生长和复制的细胞循环相关联。使用一种染料类型，碘化丙啶，G2/M期细胞的荧光将是G0/G1期细胞的荧光强度的两倍。碘化丙啶也可以嵌入RNA中，并且通常使用核糖核酸酶来区分与RNA相比的DNA荧光信号。实例还包括与细胞周期检查点相连的对于特定蛋白质来说特异性的染料，并提供额外的细胞周期状态测量。用于进行这些测量但不限于此处列出的那些的常规仪器是荧光显微镜、共焦激光扫描显微术、流式细胞术、荧光测定、荧光偏振、均相时间分辨荧光和荧光活化细胞分选(FACS)。

非共轭染料可以在本发明中用作细胞或通路的生理状态的化学生物传感器，同时测量代谢参数如合成代谢、分解代谢、小分子合成和产生、周转和呼吸。名为瓦伯格效应的众所周知的细胞生理应答描述了针对肿瘤和其他病变细胞中的能量产生，从氧化磷酸化转变为乳酸生产，并且关键信号传导通路、致癌基因和肿瘤抑制因子(例如但不限于Akt、mTor、c-myc、p53)可以通过本文所述的任何化学生物传感器方法或光电生物传感器来测量。细胞氧消耗或呼吸和细胞应答中的糖酵解产生质子，并引起溶解氧和游离质子的浓度或酸度的快速的容易测量的变化。

使用化学生物传感器，生理应答参数的另外但非限制性实例是基于存在的ATP的定量而培养的细胞所利用的ATP的量(例如CellTiterGlo和类似的荧光素酶驱动的测定)，即代谢上有活性和无活性的细胞功能的指标。

对生物分子折叠和功能重要的钙、镁和其他带电离子归因于生理应答而不断变化。这些也可以通过针对特定离子络合和测量的化学生物传感器如Cal-520、Oregon GreenBAPTA-1、fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4、Calcium Green-1和其他EGTA或EDTA样化学进行测量。这些生理应答参数可以使用许多类型的未共轭的反应性或结合染料或者其他电子或光谱手段来测量。这些方法中的许多可以排列成对细胞是非破坏性的，允许相同细胞群体的生理功能随时间重复连续测量。

共轭染料，例如连接到天然细胞蛋白结合配体或连接到免疫颗粒(抗体或抗体片段或者高特异性高亲和力合成分子如适配体)或核酸聚合物杂交探针的那些，可用于测量与蛋白质、特异性通路成员分子、各种细胞区室中的DNA和/或RNA、基因组学和蛋白质组学相关的生理应答参数，并且能够测量特异性的翻译后修饰和机制。细胞对照的翻译后修饰和表观遗传学手段可以涉及通过众多的执行通路功能的酶进行调节，包括但不限于核酶、激酶、磷酸酶、泛素酶、去泛素酶、甲基化酶、脱甲基酶和蛋白酶。用于染色福尔马林固定石蜡安装的死细胞样品的这些分子的实例可以在DAKO免疫组织化学染色方法教育指导第六版(DAKO Immunohistochemical Staining Methods Education Guide-Sixth Edition)或细胞信号传导技术教程和应用指南http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp？id＝tutorials-and-applicatio n-guides中找到。这两个实例对于测量活细胞应答的本发明可能甚至更有用。用于进行此测量但不限于这些方法的常用仪器是荧光显微镜、共焦激光扫描显微术、流式细胞术、荧光测定、均相时间分辨荧光、荧光偏振和荧光活化细胞分选(FACS)。

本发明也可以用共轭和未共轭染料的组合来测量细胞的生理应答。活化后，负责控制生理应答的一种类型的受体是GPCR。它们通过两个信号传导通路传递信息和控制细胞：第二信使cAMP水平的变化或细胞内Ca2+水平的变化，其由第二信使肌醇(1,4,5)三磷酸(IP3)释放。例如，cAMP检测可以基于使用有穴合物标签的抗cAMP抗体(或其他免疫捕获分子)和有d2标签的cAMP的竞争性免疫测定，该cAMP与细胞cAMP竞争进行GPCR反应和随后的抗体结合。特定信号(即能量转移)与标准品或样品中cAMP的浓度成反比。

通过定量mRNA、RNAi、微小RNA和具有生理功能的其他RNA来测量生理应答可以是本发明实践中用于确定转录水平的细胞变化的干扰的非常敏感的方法。RNA可以通过使用例如但不限于在此列出的所有采用化学传感器的rtPCR、qPCR、选择性序列探测、选择性序列捕获和序列杂交方法进行定量。

免疫捕获和杂交方法包括使用基于珠的方法例如路明克斯(Luminex)或光纤尖端技术例如依诺米那(Illumina)或蛋白质、DNA、RNA或其他杂交微阵列技术的那些，其中特异性捕获试剂被固定在固体表面，其用于从细胞中找出、分离并准确测量一个或多个生理应答分子。这些方法提供了在单个实验中测量众多应答参数的益处。

通过与基线测量进行比较来确定细胞应答或生理参数的变化。细胞参数或生理应答的变化取决于CReMS的类型。例如，如果细胞应答的变化是光学测定的，则物理上可观察到的变化可以例如作为多个光谱波长处的光密度针对化学吸光度或透射率、表面等离子体测量装置的变化或光子晶体装置检测的变化的函数来测量。如果细胞参数或生理应答的变化是电气测定的，则物理上可观察到的变化可以例如使用粘附到电极上的细胞的毫阻抗或微阻抗变化来测量。可以使用离子选择性场效应晶体管(ISFET)以电子方式测量pH、葡萄糖、二氧化碳或离子的变化。

在其他实施例中，通过测量在测定对治疗剂的细胞生理应答的差异所需的时间段内的CReMS应答的方法来测定变化率。变化率通过对时间过程数据的各种解释来描述，并且可以表示为速率或速率另外的导数函数(包括速率的加速度)。

测量患者生理状况的检验可以导出一个或多个临界值，在高于和低于该临界值时预测患者将经历不同的临床结果。在实施例中，针对确定细胞应答变化的一个或多个截止值由包含以下的方法确定：确定标准偏差、信噪比、标准误差、方差分析或本领域技术人员已知的其他统计检验值，用于确定来自已知应答细胞样品的一组样品和来自已知非应答患者的一组样品的统计学显著性的适当置信区间；并确定两者之间的差异且设置两组的置信区间之间的截止值。另外的实施例利用由来自已知未病变的患者的CReMS应答定义的正常参考范围确定的截止值。在此实施例中，通过将本发明其他地方进一步描述的干扰和未干扰的活癌细胞结果与正常(健康)参考范围区间进行比较来报告单个患者疾病材料检验结果。

正常(健康)参考范围检验结果通过使用来自健康受试者的正常组织进行研究来确定什么是“正常”通路活性。然后检验结果评定当与正常参考区间研究得出的值相比时，不期望具有病变通路的任何患者(例如生物标志物阴性患者)是否实际上具有异常的通路活性。还针对从生物标志物阴性患者观察到的异常测量与从当前诊断患有该疾病的那些受试者(生物标志物阳性患者)进行的测量比较本发明的结果，以观察生物标志物阴性的患者是否具有既异常又堪比生物标志物阳性患者的通路活性的通路活性。具有堪比当前接受并受益于旨在破坏通路活性的治疗的患者的通路活性的异常通路活性的那些患者因此将被诊断为具有通路疾病，并且因此应该用靶向该生物标志物的药物治疗以破坏该通路活性。

因此，本发明使得医师能够基于病变通路的功能活性建立更精确的诊断疾病的方法。这与测量单一生物标志物时使用的依赖于相关性而不是致病模型的途径形成对比。当前的生物标志物途径可能导致高比例的假阴性和假阳性结果。本发明将减少假结果的百分比。

优选的实施例包括80％-90％置信区间，更优选的实施例包括>90％置信区间，并且最优选的实施例包括>95％或>99％置信区间。

在实施例中，通过使用截止值确定盲法已知作为应答者或非应答者的样品的状态来验证截止值，并且破盲样品且确定预测样品状态的准确性。在单个截止值的情况下，低于截止值或更接近针对已知应答者值的值指示患者样品对治疗剂显示出应答性。如果值等于或高于截止值或更接近已知非应答者值的值，则细胞样品被鉴定为治疗剂的非应答者。在一些实施例中，将生物传感器在限定的时间段内的输出分类为无应答、弱应答或应答。

在优选实施例中，通过使用截止值确定盲法已知具有疾病通路应答(例如癌症患者)或不具有疾病通路应答(例如健康无疾病的患者)的样品的状态来验证截止值，并且破盲样品且确定预测样品状态的准确性。在单个截止值的情况下，低于截止值或更接近不具有疾病通路应答的样品的值的值指示患者样品不显示通路疾病。如果这些值等于或高于截止值或更接近已知病变通路样品值的值，则将细胞样品鉴定为病变通路存在。在一些实施例中，将生物传感器在限定的时间段内的输出分类为通路疾病不存在、通路疾病不确定或通路疾病存在。

选择在限定的时间段内的输出以便将输出分类到各类别中。在其他实施例中，限定的时间段是在生物传感器中连续监测细胞的时间段的终点。在其他实施例中，时间段为至少60分钟、240分钟、300分钟、10小时、24小时、60小时或120小时。在优选实施例中，在限定的时间段的输出为30分钟和10小时之间。在更优选实施例中，在限定的时间段的输出为180分钟和600分钟之间，或为240分钟。

在实施例中，在给予治疗剂之前或未用治疗剂处理的对照细胞不同于基线输出值的输出值指示不超过至少20％或更低、15％或更低、10％或更低、或者5％或更低被分类为无应答的输出。

在其他实施例中，在给予治疗剂之前或未用治疗剂处理的对照细胞不同于基线输出值的输出值指示至少50％或更低且大于5％被分类为弱应答的输出。在其他实施例中，在给予治疗剂之前或未用治疗剂处理的对照细胞不同于基线的输出值指示至少大于50％被分类为应答的输出。在实施例中，对照样品是来自相同受试者且未用治疗剂处理的疾病细胞的样品。

本文所述的方法的另一方面涉及开发可用于预测治疗剂在个体受试者中的功效的算法。该算法将使用本文所述的方法导出的值结合，与分配给定义个体受试者健康的一个方面的一个或多个患者特征的值相组合。患者特征可以包括但不限于转移的存在、转移的位置、淋巴结状态、从癌症的初步诊断到转移诊断的无疾病区间、接受辅助化疗的、接受其他药物疗法、接收放射疗法、主要疾病部位、肿瘤质量大小、身体质量指数、软关节数、肿胀关节数、疼痛、残疾指数、医师总体评定、患者总体评定、巴斯(Bath)强直性脊柱炎功能指数、巴斯强直性脊柱炎疾病活性指数、巴斯强直性脊柱炎计量指标、C-反应蛋白、总背痛、炎症、遗传状况、其他疾病史、其他重要的健康统计状况及其任何组合。结合这些值的算法将根据其与具有治疗剂旨在治疗的疾病的患者群体中的疾病进展的相关性来加权这些值。没有证明与差异应答的任何相关的疾病特征将不被包括在算法中。

在一个实施例中，置于患者特征上的值可以从研究的一组患者的检验结果(即，从如此处所述确定对治疗剂、干扰剂、活化剂等的应答性的方法得出的值)、患者特征和临床结果的回归分析得出。从此分析可以得出算法值。在一个实例中，可以使用与基于患者特征数据的变量组合的检验，通过将检验值基于9个等距切点分为10个区间(宽度为0.10，以0.10开始)来执行算法的优化。对于每个切点，如果受试者的算法值小于或等于切点，则可使用指标变量运行Cox回归，取值“一”，否则为“零”。对于每个切点，将确定危险比，即在截止值或截止值以下的那些与截止值以上的那些的比。然后选择最小化估计危险比的切点的值。

例如，可以发现，当患者的总体肿瘤质量高于某一值时，如通过本文所述的方法测定的它们对药物的应答性将不足以将患者的潜在无进展期延长超过对于对药物无应答的那些患者发现的中值结果。在检验结果指示该药物在患者中发挥作用并且期望另外它们将受益于其的情况下，包括患者特征变量的算法将报告，结果是不确定的，因为肿瘤质量变量抵消检验结果值。

本文所述的方法的另一方面提供了用于确定如下的检验的临界值的方法，该检验鉴定可能或不可能对靶向治疗剂作出应答的患者。此方法涉及：a)选择一组患者，每个患者具有相同的疾病并且被处方以相同的治疗剂，b)使用本文所述的方法来得到一组患者内每个受试者的检验值，c)在足以使所检验的全部患者中相当大的百分比达到预定临床终点并且记录每个患者达到预定义的临床终点(如果他们达到)的时间长度的一段时间内，观察检验的患者组中每个成员的健康状况，d)鉴定两个或更多个在值上彼此等距的候选截止值，其中每个候选截止值表示如下的一个值，该值低于患者被预测为应答或不应答的值并且高于患者被预测为以与评分低于截止值的人相反的方式应答的值，e)使用统计学方法来分析检验值在截止值或以下的患者的临床终点期和检验值高于截止值的患者的临床终点期之间的差异，并且f)在候选截止值组中选择导致最大百分比的患者被预测不对疗法作出应答的截止值，其指示在高于和低于截止值的患者组之间存在统计学显著的差异。

使用本文所述的方法，可以得到针对个体受试者的数值检验结果值，该值可以与从具有相同疾病的其细胞用相同的治疗检验的其他个体得到的检验值相比较。这使得可以通过以下来预测治疗对个体受试者的功效：a)记录具有相同疾病并用相同治疗方法检验的一组个体受试者的检验结果值，b)将这些值编入列表，c)基于个体受试者的检验结果值对列表进行排序，这些值是基于每名个体受试者的绝对数值检验值检验的，并且d)确定个体受试者的检验值的百分等级，其中个体受试者的检验值的百分等级预测了治疗剂对个体受试者的疾病的功效。

另一个实施例包括分析从检验相同疗法的功效的临床试验中获得的结果以估计特定结果的百分位排序，并且然后鉴定个体受试者的检验值的百分位排序，并且鉴定对应于相同的百分位排序的临床试验终点结果，其中在与个体受试者的检验值相同的百分位排序的临床试验终点结果预测个体受试者可能从用于该疾病的治疗剂获得的临床结果。临床试验终点可以包括例如时间进展期、无进展生存期、总体生存期、客观应答期、ACR应答、总Sharp评分变化、侵蚀评分和联合空间狭窄、临床应答、疼痛、残疾指数、临床缓解、体表面积参与、医师全球评定、和牛皮癣面积以及严重程度指数。

另一个实施例包括确定从本文所述方法得到的检验结果值与接受所检验治疗的个体的临床结果之间的统计学相关性的方法。此方法包含：a)选择一组患者，每个患者具有相同的疾病，并且处方以相同的治疗剂，b)使用本文所述的方法得到个体的检验结果值，c)将具有相同疾病并用相同治疗检验的一组患者内的每个受试者的检验结果值编入列表，d)在足以使所检验的全部患者中相当大的百分比达到预定临床终点的一段时间内，观察检验的患者组中每个成员的健康状况，e)记录每个患者达到预定临床终点(如果达到的话)所需的时间长短，f)以这样的方式分析终点数据(例如时间进展期、无进展生存、ACR应答)，使得确定终点结果与检验值之间的统计学关系。

通过举例，一旦临床试验的结果可用，如下进行对截止值-“C*”-的估计的确定。假设Cox回归检验指示检验值预测患者结果，如时间进展(TTP)，则检验值将基于9个等距切点分为10个区间，宽度为0.10，以0.10开始。对于每个切点，如果受试者的测定值小于或等于切点，则使用指标变量运行Cox回归，取值“一”，否则为“零”。对于每个切点，将确定危险比，即在截止值或截止值以下的那些与截止值以上的那些的比。最大化估计危险比的切点的值将被选择用于研究的后续关键阶段。为了最后的分析，Cox比例风险回归可以用指标变量(低于切点与高于切点)运行。最终分析还可以包括TTP的其他推定预测患者特征变量。

F.治疗剂和活化剂

通常，当患者被诊断患有特定疾病或病症时，有一系列治疗选择。在一些情况下，治疗可能非常昂贵，或者与治疗相关的副作用可能是严重的，所以知道患者是否可能是治疗的应答者或非应答者将是有用的。此外，如果患者变得具有抗性，既然患者的病变细胞已经变得具有抗性，知道现在哪些其他治疗可能是有效的将是有用的。

在某些实施例中，可以在本文所述的方法中分析用于治疗一些患者有应答而其他不应答的病症的任何一种或多种治疗剂。例如，对于癌症，可获得许多靶向免疫疗法，包括许多不同的嵌合和人源化抗体。对于自身免疫病症，可以分析诸如靶向炎性细胞因子或其受体的分子。靶向炎症细胞因子的药剂的实例是抗TNFα剂，靶向干扰素α、白细胞介素等的药剂。免疫抑制剂如皮质类固醇、他克莫司(FK-506或TACR)(抑制T细胞代谢和增殖)、西罗莫司(SIRO/81768)、麦考酚酸、吗替麦考酚酯(MMF)、钙调神经磷酸酶抑制剂(CI)、环孢菌素(CsA)、和雷帕霉素(mTOR抑制剂)。

在其他实施例中，该方法涉及针对引起来自个体受试者的病变细胞的生理参数变化的能力，检验一种或多种治疗剂、干扰剂(例如，活化剂)、确认剂或其组合。在实施例中，治疗剂也是无标签的。在一些实施例中，在来自相同患者的病变细胞的单独样品上可以单独或组合地检验两种或更多种治疗剂。选择以比其他治疗剂低的剂量引起细胞应答或生理特征的最大变化的治疗剂。可以确定提供最大治疗效果的化合物的组合。在实施例中，该测定可以与患者的健康细胞或非病变患者的健康细胞或非病变患者结果的池相比以确定治疗指数和其他个体安全性和耐受性效应。

在一些实施例中，当治疗剂是影响细胞通路的靶向治疗剂时，在不存在或存在通路的活化剂或干扰剂(即干扰剂)的情况下测量细胞应答性的变化。与基线测量或截止值相比，并且任选地与其他治疗剂相比，选择抑制对通路干扰剂的细胞应答性的治疗剂。

在其他实施例中，当治疗剂是与细胞表面受体结合的靶向治疗剂时，在不存在或存在与受体结合的活化剂或干扰剂的情况下测量细胞应答性的变化。在实施例中，治疗剂在活化剂或干扰剂之前或之后给予到细胞样品。在实施例中，活化剂或干扰剂是无标签的。与基线测量相比，并且任选地与其他治疗剂相比，选择抑制对活化剂或干扰剂的细胞应答性的治疗剂，不管细胞表面受体的密度如何。在一些实施例中，选择抑制活化剂或干扰剂的作用而与细胞受体密度无关的治疗剂。

生理参数的变化可以是与基线或健康或不受干扰的细胞对照相比参数的增加或减少。这些变化可代表完全激动、超激动、不可逆的激动、选择性激动、共激动(co-agonism)、反向激动、或部分限制性激动、可逆和不可逆的拮抗、竞争性拮抗、非竞争性拮抗、无竞争力拮抗。与适当的对照相比，变化可能会更早、更晚发生或不发生。可以选择变化发生更长或更短的时间段。可以选择可逆或不可逆的变化。

例如，导致细胞信号传导下降的治疗剂将被选择用于治疗自身免疫性病症。应答于抑制细胞因子作用的药物的外周血细胞显示细胞信号传导的减少。在另一个实例中，对于应答于抗癌剂(例如靶向受体如Her2的人源化抗体)的疾病细胞，这些疾病细胞将显示EGF家族通路信号传导的显著减少。在其他情况下，对于应答于抗血管生成剂的疾病细胞，这些疾病细胞将显示VEGF通路信号传导的减少或增殖能力的降低。针对每种类型的药剂测量的CReMS应答或物理可观察的特征取决于药物被设计引发的预期生理应答，并且可以根据需要具有特异性或一般性。关键是使用CReMS进行一段时间的活细胞的生理测量，以检验药物旨在改变的应答。

特定的一种或多种治疗剂可以给予到病变细胞和任选地健康细胞，以确定特定的一种或多种治疗剂的有效性。病变细胞和/或健康细胞也可以是未经处理的，以便比较一种或多种治疗对经处理和未处理的病变和/或健康细胞的影响。可以给予单一治疗以确定受试者如何对治疗性治疗作出应答。在另一个实施例中，可将一组不同的治疗剂给予特定受试者的细胞。

在某些实施例中，在一个实施例中通过加入药物和测量生理应答来确定治疗剂抑制细胞通路活化的功效的截止值。在另一个实施例中，通路在有和没有药物预处理的情况下被干扰。在85％置信区间或理想地大于90％置信区间或更理想地大于95％或99％置信区间的药物对生理基线信号的变化或干扰信号的减少被认为是有效的。在实施例中，通过记录随时间的生理应答确定抑制细胞增殖或增强细胞杀伤的治疗剂的功效的截止值。与未处理或健康细胞相比，在85％置信区间或理想地大于90％置信区间或更理想地大于95％或99％置信区间的药物对生理基线信号的减少或与时间模式的偏差被认为是有效的。

通过比较如由CReMS测量的细胞生理学通路应答以确定该药物如被设计的那样对特定靶标起作用并确定已经达到功效的截止值，来确定治疗剂治疗个体受试者的疾病的敏感性和特异性。

在一些实施例中，滴定活化剂和/或治疗剂以获得任一药剂的希尔(Hill)斜率、EC₅₀或IC₅₀值。从活化剂滴定和/或治疗剂滴定获得的数据可以用于评定任一药剂的效力(什么浓度达到一半最大效果)和/或功效(最大可实现效果)。另一方面包括使用来自受试者的病变细胞通过滴定活化剂或治疗剂来预测个体受试者中的治疗剂的功效以便产生IC₅₀值的方法，其中活化剂降低细胞通路活性并且治疗剂激动细胞通路活性。

治疗剂可以包括但不限于靶向特定细胞通路的药剂和/或抑制细胞增殖或引起细胞杀伤的药剂。治疗剂靶向的通路的实例包括MAPK-PK、RAS/RAF、RHO、FAK1、MEK/MAPK、MAK、MKK、AKT、EGF受体、Her2受体、Her3受体、Her4受体、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、GPER30、PIK3/PTEN、VEGF受体通路抑制剂、细胞粘附、TGFβ/SMAD、WNT、Hedgehog/GLI、HIF1α、JAK/STAT、Notch、G1/S转换控制、DNA损伤控制和细胞凋亡。在一些实施例中，治疗剂靶向涉及在细胞周期调节中的细胞通路。影响细胞周期调节的示例性靶向治疗剂包括靶向CDK4、CDK6、PD-1和细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白A、B、C、D、E或F，和G1/S细胞周期蛋白)的那些。在一些实施例中，靶向治疗剂靶向芳香酶。

在其他实施例中，治疗剂选自许多小分子和抗体药物，例如曲妥珠单抗、培妥珠单抗、拉帕替尼、多西紫杉醇、他莫昔芬、顺铂、阿伐沙林、紫杉醇注射液、布洛司他韦韦多顿、依维莫司、培美曲塞、依西美坦、奥美单抗、贝伐珠单抗、安非他明、伊立替康、比卡鲁胺、奥沙利铂、西妥昔单抗、维莫德吉(visomedegib)、柠檬酸托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊马替尼、伊沙匹隆、托泊替康(topeotecan)、阿西替尼、罗米地辛、卡巴他赛(cabrazitaxel)、索拉菲尼、英夫利昔单抗、来那度胺、利妥昔单抗、达沙替尼、舒尼替尼、厄洛替尼、尼罗替尼、紫杉醇、替莫唑胺、三氧化物、帕尼单抗、硼替佐米、阿扎胞苷、帕唑帕尼、克唑替尼、卡培他滨、伊匹单抗、威罗菲尼、醋酸戈舍瑞林、阿比特龙、BH3模拟物、纳曲霉素、阿那曲唑、来曲唑、芳香酶抑制剂、环磷酰胺、多柔比星、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、伊沙匹隆、卡铂、阿柏西普、替西罗莫司、替伊莫单抗(irbritumomab)、阿比特龙、库司替森、来那替尼(neratinib)、恩杂鲁胺、纳武单抗(nivolumab)、帕博西尼(palbociclib)、瑞格非尼(regorafenib)、恩替诺特(entinostat)、阿法替尼、ARN-509、ARN-810、BIND-014、达拉菲尼、达妥木单抗(daratumumab)、兰布罗利珠单抗、LDK378、MM-121、sym004、曲妥珠单抗-恩他新(trastuzumab-emtansine)、替沃扎尼(tivozanib)、曲美替尼、阿西替尼、LY2835219、MPDL320A、奥比珠单抗(obinutuzumab)、Sym004、托西莫单抗、曲美替尼、奈昔木单抗(necitumumab)、雷米珠单抗及其组合。这些治疗剂的靶标是已知的。可以使用周(Chou)和塔拉利(Talalay)方法(周(Chou)，癌症研究(Cancer Res.)，70(2):440-446(2010))来选择治疗剂的另外的组合。

在一个实施例中，用于确定药剂对个体受试者中疾病的治疗功效的方法包含：在细胞反应测量系统(CReMS)中将该药剂给予来自个体受试者的至少一种分离的疾病细胞样品；并且确定细胞样品针对药剂的细胞应答参数与基线测量相比的变化是否发生，其中细胞应答的变化指示该药剂对个体受试者的疾病具有治疗功效。在实施例中，方法进一步包含在细胞应答测量系统中在给予治疗剂之前或之后，向来自个体受试者的至少一种分离的疾病细胞样品给予干扰细胞应答通路的活化剂或干扰剂。

在一些实施例中，治疗剂靶向作为细胞通路成员的细胞表面受体。在用活化剂或通路的干扰剂活化样品之前，可以将这些样品与治疗剂接触。在其他实施例中，活化剂或干扰剂包含特异性生长因子、血管内皮生长因子、磷脂酰肌醇、表皮生长因子、肝细胞生长因子、m-CSF、RANK配体、肿瘤坏死因子(TNF-α)、神经调节蛋白、雌激素、孕酮、叶酸、三磷酸腺苷和FAS配体、血小板衍生生长因子(PDGF)或其他细胞通路或信号干扰剂如受试者的血浆或血清、Na+、K+、Mg+、Cl-、Ca+2、葡萄糖、谷氨酰胺、组氨酸、甘露醇和色氨酸、抗生素(雷帕霉素)、必需和非必需氨基酸、维生素、其他有机化合物、微量矿物质和无机盐、血清、细胞提取物、分级细胞提取物或分级血清、细胞外信号传导因子、细胞内信号传导因子、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、乙醇胺、磷酸乙醇胺、三碘甲状腺原氨酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺。在其他实施例中，治疗剂是通过抑制细胞增殖、增强细胞杀伤和使得细胞对导致疾病状态的信号无应答或应答较小而影响病变细胞的那些。这些治疗剂的实例包括环磷酰胺、5-FU、卡培他滨和其他嘧啶药物、其他SN-38代谢物类似物(例如伊立替康)、紫杉酚和含铂药物(例如顺铂)。

在一些实施例中，样品对这些药剂中的一种或多种的应答也可以在存在或不存在干扰细胞增殖的生长因子或抗凋亡剂的情况下测量。干扰细胞增殖的生长因子包括生长激素、表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子以及本领域技术人员已知的其他。抗凋亡剂包括调节抗凋亡蛋白或通路的化合物(例如针对Bcl-2蛋白活性的紫杉酚和用于控制抗凋亡Ras信号级联的吉非替尼)。

例如，对于诊断具有乳腺癌并确定具有过表达或扩增的HER2受体的特定受试者，可以检验从该受试者分离的细胞对特定抗癌治疗剂(特别是抗HER2治疗剂)的应答性。例如，在存在或不存在表皮生长因子(EGF)和/或同源结构化肽、神经调节蛋白或调蛋白的情况下，可以检验来自过表达的HER2受试者的细胞对曲妥珠单抗或拉帕替尼的应答性。在一个实施例中，来自受试者的细胞可以接种在生物传感器上。在实施例中，细胞是无标签的全细胞。这样的细胞可以是来自乳腺癌肿瘤和健康乳腺组织的细胞。曲妥珠单抗或拉帕替尼可以给予到病变细胞样品和任选地健康细胞样品。在一些实施例中，然后使用曲妥珠单抗处理的细胞样品与Her受体活化剂例如神经调节蛋白接触。病变和健康细胞的样品可以保持未经处理。使用细胞应答测量系统(CReMS)确定细胞应答。在实施例中，在1小时或更短时间后确定细胞应答。然后处理特定受试者的细胞的曲妥珠单抗的有效性可以在存在或不存在通路的干扰的情况下确定。

在某些实施例中，选择抑制个体受试者的细胞样品对细胞通路的活化剂、细胞增殖活化剂或细胞凋亡抑制剂的细胞应答的药剂。当在本公开的方法中评估活化相同或不同通路的许多不同治疗剂时，优选选择能够以比其他更低的浓度抑制活化剂或抑制剂应答的药剂。

在类似的实施例中，治疗剂是通过激动或部分激动细胞活性影响病变细胞的那些，其中活性降低导致病变状态。

该检验可以测量从低于1nM至大于100uM的浓度范围内的药物的有效性，通常具有小于20％的标准偏差并且最佳地具有小于5％的标准偏差。复合检验范围将对应于被称为最大耐受剂量的药物包装标签上定义的给药水平。与大多数无法确定检验中实际细胞集中的活细胞数目的检验不同，此检验仅对活细胞起作用，如在检验开始时在质量控制和基线生理测定步骤中确定的。此特点导致检验结果方差的减少。该检验可以使用本领域技术人员普遍已知的细胞活力通常可接受的温度、氧气、湿度和二氧化碳范围进行。在一些情况下，优选的温度范围为25℃-40℃。在其他情况下，在特定干扰的这个范围内，温度进一步优化至±0.5℃，并使用标准温度控制的孵化器柜进行维持。

在另一个实施例中，可以检验来自个体的病变细胞的样品针对一组抗癌治疗剂的应答性。对于癌症，可以使用许多小分子和抗体药物。此类治疗剂的实例包括曲妥珠单抗、培妥珠单抗、拉帕替尼、多西紫杉醇、他莫昔芬、顺铂、阿伐沙林、紫杉醇注射液、布洛司他韦韦多顿、依维莫司、培美曲塞、依西美坦、奥美单抗、贝伐珠单抗、安非他明、伊立替康、比卡鲁胺、奥沙利铂、西妥昔单抗、维莫德吉(visomedegib)、柠檬酸托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊马替尼、托泊替康(topeotecan)、阿西替尼、罗米地辛、卡巴他赛(cabrazitaxel)、索拉菲尼、英夫利昔单抗、来那度胺、利妥昔单抗、达沙替尼、舒尼替尼、厄洛替尼、尼罗替尼、紫杉醇、替莫唑胺、三氧化物、帕尼单抗、硼替佐米、阿扎胞苷、帕唑帕尼、克唑替尼、卡培他滨、伊匹单抗、威罗菲尼、醋酸戈舍瑞林、阿比特龙、BH3模拟物、纳曲霉素、阿那曲唑、来曲唑、芳香酶抑制剂、环磷酰胺、多柔比星、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶及其组合。

例如，可以针对一组抗乳腺癌治疗剂(包括抗HER2治疗剂)检验从过表达的HER2受试者收集的细胞样品。在一个实施例中，可以将抗乳腺癌治疗剂之一给予到来自受试者的每个细胞样品。一组抗乳腺癌治疗剂可以包括但不限于曲妥珠单抗、培妥珠单抗、拉帕替尼、多西紫杉醇、他莫昔芬、顺铂、BH3模拟物、芳香酶抑制剂、环磷酰胺、多柔比星、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、NeuVax^TM(E75肽，与佐剂沙格司亭(rGM-CSF)一起给予)及其组合。芳香酶抑制剂可以是芳香酶抑制剂阿那曲唑、来曲唑或依西美坦中的至少一种。BH3模拟物可以是纳曲霉素。

在一个实施例中，抗乳腺癌治疗剂可以是Her/Neu受体家族活性调节剂(例如，培妥珠单抗)、细胞生长因子受体调节剂(例如血管内皮生长因子(VEGF)受体的调节剂)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路调节剂、(PI3K)通路调节剂、BH3模拟物、芳香酶抑制剂或其组合。

本发明的方法包括将候选治疗剂给予受试者的细胞以确定安全性并确定治疗有效性。此外，向受试者的病变细胞给予候选治疗剂可以用作为II期或III期临床试验选择合适的患者群体的方法。本发明的方法包括针对已知的治疗组合检验病变细胞。此外，本发明的方法包括检验已知和候选治疗剂。

本发明的方法还包括给予治疗剂的组合以确定药剂的特定组合是否产生更有效的结果(即改善或治愈疾病症状)。治疗剂的组合是给予到相同细胞样品的两种或更多种治疗剂。在本发明的一个实施例中，将治疗剂的组合同时给予细胞样品。在一个实施例中，在不同于组合的其他至少一种治疗剂的给予的时间向细胞样品给予至少一种治疗剂。

在向细胞样品给予治疗剂后，可以在细胞样品的多个方面收集实时数据。例如，可以测量pH和温度。另外，可以确定其他因素，例如“细胞死亡因子”。由CReMS测定的细胞死亡因子可以是通过CReMS测量的物理化学性质的变化。例如，癌细胞将附着于表面并提供屈光指数的基线读数。促进癌细胞死亡的治疗剂的给予将引起屈光指数的变化，因为样品中的癌细胞会集拢并从表面脱离。这可以以连续实时方式利用表面等离子体共振通过光学生物传感器来测量。

在一个实施例中，本发明提供了通过如下来确定药剂对特定受试者的治疗功效的方法：在CReMS中向受试者的疾病细胞样品给予该药剂并且确定相比于基线测量细胞样品对该药剂的生理应答，其中该生理应答指示该药剂的治疗功效。向疾病细胞样品给予的药剂可以是单一药剂或两种或更多种药剂。当药剂是两种或更多种药剂时，两种或更多种药剂可以同时或不同时间给予。例如，可以将一种药剂给予细胞样品，并且可以在稍后的时间(例如，10分钟后)给予第二种药剂。方法还可以包括向病变细胞样品给予安慰剂。方法还可以包括给予该一种或多种药剂以在健康细胞样品上检验。

在某些实施例中，该方法涉及确定特定治疗剂的最佳剂量范围。剂量范围的确定允许合适设计临床试验和/或允许医师将功效与有害的副作用进行平衡。在实施例中，方法包含向来自相同患者的病变细胞的单独样品给予一系列剂量的治疗剂，并且确定导致如本文所述的与基线和/或健康对照细胞相比细胞的生理参数变化的剂量范围。

一旦使用本文所述的任何方法来确定个体受试者的疾病细胞是否响应于一种或多种治疗剂，则将结果传达给保健工作者以允许选择用于治疗受试者的治疗剂。在实施例中，该方法进一步包含将所选择的治疗剂给予受试者。

G.确定个体受试者中的细胞通路的状态

如上所述，许多疾病是由功能障碍的细胞通路引起的。在许多情况下，特定的遗传突变通常与这些功能障碍通路相关，导致例如过表达或低表达的蛋白受体。已经设计了多种治疗剂以特异性靶向生物标志物，其被认为是给定紊乱的特征。不幸的是，靶向治疗剂通常仅在接收它们的不到一半的患者中有效，至少部分是因为患者疾病的性质不仅仅随特定遗传生物标志物的存在而变。因此，疾病生物标志物或基因特征的鉴定不足以准确地预测药物功效。涉及在疾病过程中的细胞通路的活性对于用静态定量遗传状况捕获来说太复杂。如上所述，治疗剂在个体受试者中的功效可以通过将受试者的病变细胞样品单独或与干扰剂组合暴露于治疗剂来测定，并测量药物对经处理的细胞的生理影响。

在另一个实施例中，还可以通过确定从受试者获得的细胞样品中药剂靶向的细胞通路的状态来确定个体受试者对靶向治疗剂的应答性。致病通路的活性可以使用已知在细胞通路正常发挥作用时干扰特定细胞通路的药剂来测量。此实施例反映了在活的病变细胞的上下文中细胞通路的作用根本上是疾病活性的观察，其不仅仅归因于存在于该通路内的蛋白质的过表达的程度。

因此，在一方面，本发明提供了确定从个体受试者获得的病变细胞中的细胞通路的功能状态的一种方法，该方法是通过使从受试者获得的病变细胞样品与已知在该通路正常发挥作用时干扰特定细胞通路的干扰剂(例如活性剂)接触进行。可以在样品的活细胞中测量一个或多个生理应答参数(例如，在细胞应答测量系统(CReMS)中)，并且可以使用对连续测量的数学分析来确定在干扰剂和/或确认剂的存在下发生的生理应答参数的变化量是否大于合适的对照(例如正常参考区间)。在干扰剂存在下，相对于合适的对照，一个或多个生理应答参数的变化量指示干扰剂所靶向的细胞通路在个体受试者中是异常还是正常的。

另一方面，本发明提供了选择用于个体受试者的靶向治疗剂的方法，该方法是通过使从受试者获得的病变细胞样品与已知在通路异常发挥作用时干扰特定细胞通路的干扰剂接触进行。可以在样品的活细胞中测量一个或多个生理应答参数(例如，在细胞应答测量系统(CReMS)中)，并且可以使用对连续测量的数学分析来确定在干扰剂的存在下生理应答参数的变化是否发生。在干扰剂存在下，相对于合适的对照，一个或多个生理应答参数的变化可指示干扰剂所靶向的细胞通路在个体受试者中是功能障碍的(例如异常的)，并且因此该受试者将对靶向相同细胞通路的靶向治疗剂有应答。在一些实施例中，该方法进一步包含向该受试者给予靶向治疗剂。此实施例允许通过确定治疗剂影响的细胞通路是正常还是异常地发挥作用来确定个体受试者对靶向治疗剂的应答性。

在具体实施例中，个体受试者中的细胞通路的功能状态在施用本文所述的方法之前是未知的。在另一个具体实施例中，从受试者获得的细胞样品含有病变细胞，和/或可以是无标签的。

干扰剂的影响可以通过在足以检测样品中活细胞的此参数的变化的限定时间段内，监测在存在干扰剂和/或确认剂的情况下细胞样品的至少一个生理应答参数来测量。在一些实施例中，样品基本上由活细胞组成。

干扰剂可包括本文所述的那些干扰剂(例如活化剂)。例如，干扰剂可以是蛋白质、肽、核酸、代谢物、配体、有机分子、信号传导因子、生物化学物质或其组合。某些干扰剂包括但不限于激动剂或拮抗剂，生长因子，细胞因子，激素，设计用于激发或拮抗特定细胞活性的小分子，上述任何一种的酶、肽和肽级分，抗体或抗体片段。

确认剂可以包括已知抑制如本文所述干扰剂可以引发的信号传导通路活性的那些药剂。干扰剂和确认剂靶向的通路的实例包括MAPK-PK、RAS/RAF、RHO、FAK1、MEK/MAPK、MAK、MKK、AKT、EGF受体、Her2受体、Her3受体、Her4受体、PIK3/PTEN、VEGF受体通路抑制剂、细胞粘附、TGFβ/SMAD、WNT、Hedgehog/GLI、HIF1α、JAK/STAT、Notch、G1/S转换控制、DNA损伤控制和细胞凋亡。在一些实施例中，这些药剂靶向涉及在细胞周期调节中的细胞通路。影响细胞周期调节的示例性药剂包括靶向CDK4、CDK6、PD-1和细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白A、B、C、D、E或F，和G1/S细胞周期蛋白)的那些。在一些实施例中，药剂靶向芳香酶。

在示例性实施例中，干扰剂和确认治疗剂作用于涉及在以下细胞过程中的至少一种的细胞通路：MAP激酶信号传导、凋亡、PI3K/Akt/mTOR信号传导、染色质/表观遗传调控、细胞代谢、细胞周期控制、免疫学和炎症、发育和分化、和/或细胞骨架调节和粘附。示例性干扰剂及其靶向的通路在下表6-14中提供。

表6.细胞过程-MAP激酶信号传导

通路

促分裂原活化蛋白激酶级联

生长和分化中的MAPK/Erk

到MAPK/Erk的G蛋白偶联受体信号传导

SAPK/JNK信号传导级联

信号传导通路活化p38MAPK

表7.细胞过程-凋亡通路

凋亡(概述)

凋亡抑制

死亡受体信号传导

凋亡的线粒体控制

表8.细胞过程-PI3激酶/Akt/mTOR信号传导

通路

PI3K/Akt信号传导

PI3K/Akt结合配偶体表

PI3K/Akt底物表

两种TORC和Akt(The two TORCs and Akt).发育细胞学(Dev.Cell)12(4),487-502(2007)

表9.细胞过程-染色质/表观遗传调控

表10.细胞过程-细胞代谢

通路

胰岛素受体信号传导

AMPK信号传导

瓦伯格效应

表11.细胞过程-细胞周期/DNA损伤

通路

细胞周期控制：G1/S检查点

细胞周期控制：G2/M DNA损伤检查点

表12.细胞过程-免疫学和炎症

通路

Jak/Stat信号传导：IL-6受体家族

NF-κB信号传导

TLR通路

B细胞受体信号传导

T细胞受体信号传导

表13.细胞过程-发育和分化

通路

河马信号传导

TGF-β信号传导

刺猬信号传导

Notch信号传导

Wnt/β-联蛋白信号传导

血管生成

核受体信号传导

ErbB/HER信号传导

Ras信号传导

表14.细胞过程-细胞骨架调控和粘附

·肌动蛋白动力学的调控-与许多通路相关，参见例如整合素受体结合ECM配体、GPCR配体、生长因子结合受体(受体酪氨酸激酶)

·微管动力学的调控-与上述许多通路相关，参见例如Wnt信号传导、嗜中性粒细胞/营养蛋白

·粘附结合动力学-与上述许多通路相关，参见例如PI3K、MAPK

生理应答参数包括本文所述的那些，例如细胞粘附、细胞附着、细胞形态、细胞增殖、细胞信号传导、细胞密度、细胞大小、细胞形状、细胞极性、pH、O₂、CO₂、葡萄糖及其组合。在示例性实施例中，生理应答参数是细胞粘附或附着的变化。

本文描述了分析连续测量以确定细胞样品中生理应答参数变化是否发生变化的方法(例如，应答(阳性或阴性)的幅度，时间到最大或最小，时间与应答时间线任一点处的幅度的斜率等)。可以使用这些和其他非线性分析方法来确定生理应答参数的变化是否在干扰剂的存在下发生。

基线和对照可用于判断细胞通路的状态。合适的基线可以包括但不限于没有干扰剂的样品、干扰剂的无限稀释样品、在加入干扰剂之后足够长的时间之前或之后的相同样品、以及本领域技术人员已知的基于细胞的测定的其他这样的基线活性。

合适的对照可以包括但不限于来自同一患者的健康材料的样品、来自足够数量的缺乏感兴趣的疾病的患者的健康材料的样品集以导出正常参考区间、具有相似但不同的活化剂的样品、具有已知阳性或阴性应答的细胞系、用相反活性的活化剂处理的样品、来自一个或多个患者的病变材料的样品、以及本领域技术人员已知的基于细胞的测定的其他这样的阳性和阴性对照。

在一些实施例中，通过滴定干扰剂的量获得的数据可用于确定靶向治疗剂在个体受试者中的功效。例如，如果病变细胞样品暴露于增加浓度的干扰剂，则可以产生干扰剂对细胞样品中活细胞的EC50值，其中该细胞样品的EC50值预测当细胞通路正常发挥作用时，靶向治疗剂已知破坏受干扰剂影响的细胞通路的功效。通过确定EC50值，获得患者细胞样品对干扰剂的敏感性，并且因此可用于评定相关细胞通路在该患者中发挥功能或功能障碍的程度。

在一个实例中，EC50是非常小的数字，指示患者对最小量的干扰剂非常敏感。如果干扰剂是在正常人体液中发现的天然药剂，则设计用于减少此药剂的处理可能在将该药剂水平降低到低于低EC50上是无效的。在另一个实例中，通路的成员是组成型的，并且可能导致该通路对干扰剂无应答或非常弱的应答，指示细胞通路是功能障碍的。在这个实例中，EC50是一个很大的数字。在另一个实例中，通路成员可能过表达，导致加入干扰剂后通路的过度生理应答，导致功能障碍的通路状态。在又另一个实例中，通路成员可能通过例如突变、低表达、锁定在无活性状态或螯合中而活动减退，导致功能障碍状态。在另一个实施例中，通路成员可能不适当地连接到其他细胞功能，产生正常通路应答的生理应答无特征，导致功能障碍状态。

从滴定干扰剂获得的数据也可用于评定干扰剂的效力(即，什么浓度达到一半最大效果)和/或功效(即，最大可实现的效果)。

来自一个个体受试者的分离的无标签疾病细胞样品的EC50结果可以与来自含有基本上相同细胞类型并用相同干扰剂检验的其他个体受试者的分离的无标签细胞样品的EC50结果进行比较。可以进行统计分析，其中统计分析预测细胞通路的功能状态。个体受试者中细胞通路的功能状态指示受试者对靶向该通路的治疗剂的应答性。

H.分析细胞周期状态以测量药物疗效的方法

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)充当细胞周期的主要调控剂。开发了许多用于治疗各种类型的癌症靶标CDK的靶向治疗剂。在本文所述的方法的一个实施例中，分离CDK通路的活性以测量细胞周期的状态，并且此测量可以与药物功效相关。

因此，在一些实施例中，本文所述的方法可以利用干扰细胞通路的干扰剂和/或确认剂和/或靶向治疗剂，其涉及到将细胞移动至特定细胞周期状态。例如，当药物曲妥珠单抗按照预期的方式起作用时，清楚地引起细胞周期在G1/S期变得静止，使得细胞不能进一步增殖并破坏癌性状态。本文所述的方法将通过测量G1/S期细胞的功能状态，例如通过检验与G1/S状态相关的通路的状态来确定曲妥珠单抗在患者样品中的功效。这样的通路是本领域公知的。在其他实例中，可以选择干扰剂，其在G0期中暂停细胞，并且本文所述的方法可用于检验与此休眠或静止细胞期相关的通路功能。在又其他实例中，可以选择引起细胞进入或开始进入凋亡的药剂，并且本文所述的方法可以检验与进入细胞死亡周期相关的通路功能。

I.对测试结果的分析和解释

可以以多种方式分析和解释使用本文所述的方法获得的检验结果，以向临床医生和/或患者提供信息。某些实施例如下所述。

(i)病变通路分析。此分析离体鉴定在患者中是否发生病变通路活性。该分析将首次向医师提供动态评估疾病过程是否存在于患者的病变细胞中。在此实施例中，检验的通路可以分为四组类别之一：持续活性、过度活性、根本无活性(低活性)或正常活性。为了确定该通路是否病变并因此适合于用已知抑制感兴趣的通路活性的靶向疗法进行的治疗，将通过本文所述的方法测定疑似患有该疾病的患者的通路活性与从该通路活性的正常参考区间得到的截止值进行比较。发现具有异常的通路活性(例如高于描绘异常和正常通路活性的截止值)的药物靶向通路将预期会破坏该活性，从而在患者体内产生预期的效果。

(ii)药物功能分析。此分析提供了药物功能的两个离体测量。

1)应答评分(RS)：应答评分表征了检验药物对靶向通路的功能作用。可以以0-1的比例报告，其中较高的评分指示更大的药物功能。

2)应答评分百分位排序(RSPR)：RSPR表征了患者的应答评分排序，相对于使用相同药剂检验的其他患者接收的评分。对于每个患者，确定总体组中其应答评分的百分位数。一旦分配了百分位排序，患者就可以分为三组之一：a)低于中值，b)接近中值，或c)高于中值。对于某些药物，由临床终点(如进展时间(TTP))测量的患者药物应答的广泛变化将反映在应答评分的变化中。因为情况往往是这样的，临床试验中第75百分位患者的TTP期比第25百分位患者的TTP期大5-10倍，为医师提供患者应答评分的相对排名给予他们重要的解释背景。例如，他们可以估计个体患者的TTP期，根据对应于个体患者的应答评分百分位的百分位范围内的临床试验中患者的TTP期。

(iii)预测可能的临床结果。此分析反映了在接收所讨论的药剂后在检验和观察的患者的应答评分和临床终点之间的临床试验中发现的相关性。通过这种相关性，可以鉴定临床结果与在临床试验中接收某种应答评分的患者一致。例如，如果TTP是测量的临床结果，则患者的结果可以分为三类之一。

1)可能的TTP期-最低：落入此子群体的患者可能经历的TTP期远远低于整个群体患者将经历的中位TTP期。

2)可能的TTP期-不确定：对于接收落入此类别的应答评分的患者，不提供评定。

3)可能的TTP期-最高：落入此子群体的患者可能经历的TTP期远远高于整个组的患者将经历的中位TTP期。

临床医生将使用CELx Profile检验的结果作为指导，因为它们决定了选择哪种药物疗法。当用多种药物检验患者的细胞时，可以比较每种药物的可能的临床结果，使得医师可以用与最可能的临床结果相关的检验结果来选择药物。

J.试剂盒

在本发明的另一方面，提供了试剂盒。在某些实施例中，试剂盒包含：用于来自个体受试者的疾病细胞样品的含有转运介质的容器；用于来自个体受试者的对照细胞样品的含有转运介质的容器；生物传感器；具有用于将来自生物传感器的数据转换成输出的计算机可执行指令的非暂时计算机可读介质，其中该输出在限定的时间段内显示细胞生理应答参数的变化，其中该细胞生理应答参数选自下组，该组由以下各项组成：pH、细胞粘附、细胞附着模式、细胞增殖、细胞信号传导、细胞存活、细胞密度、细胞大小、细胞形状、细胞极性、O₂、CO₂、葡萄糖、细胞周期、合成代谢、分解代谢、小分子合成和产生、代谢回转、以及呼吸作用、ATP、钙、镁和其他带电离子、蛋白质、特异性通路成员分子、不同细胞区室中的DNA和/或RNA、基因组学和蛋白质组学、翻译后修饰和机制、第二信使水平、cAMP、mRNA、RNAi、microRNA和其他具有生理功能的RNA、及其组合；将输出分类为上述或低于指示作为应答者或无应答者的状态的截止值，和/或将样品分类为无应答、应答较弱、以及有应答；并产生分类的报告。

本文描述了疾病细胞样品的类型和量。在某些实施例中，疾病细胞样品是具有至少5,000个细胞的全细胞无标签活细胞样品。在实施例中，对照细胞样品选自下组，该组由以下各项组成：来自相同受试者的疾病细胞样品、来自相同受试者的健康细胞样品、已知无疾病的受试者的健康细胞样品、来自足够数量的缺乏感兴趣的疾病的患者的健康材料的样品集以导出正常参考区间、已知对治疗剂作出应答的细胞样品，已知对治疗剂无应答的细胞样品及其组合。

容器和转运培养基设计用于维持细胞活力并使细胞活化最小化。在实施例中，培养基和容器是无内毒素、非致死性和无DNA酶和无RNA酶的。一旦获得，将细胞样品维持在保留细胞活力的转运培养基中。根据转运到分析部位的时间长短，可以采用不同的培养基。在实施例中，当组织样品的转运可能需要长达10小时时，培养基的重量摩尔渗透压浓度低于400msm/L，并且包含Na+、K+、Mg+、Cl-、Ca+2、葡萄糖、谷氨酰胺、组氨酸、甘露醇、色氨酸、青霉素、链霉素，含有必需氨基酸，并且可以另外含有非必需氨基酸、维生素、其他有机化合物、微量矿物质和无机盐、血清、细胞提取物或生长因子、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、乙醇胺、磷酰乙醇胺、三碘甲状腺原氨酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺，以支持人类原代细胞的增殖和平板效率。这种培养基的实例包括赛里西欧(Celsior)培养基、洛斯维公园纪念研究所(RPMI)培养基、汉克斯(Hanks)缓冲盐水和McCoy's 5A、伊格尔氏必需基本培养基(Eagle's Essential Minimal Media，EMEM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、莱博维茨(Leibovitz)L-15或其用于实践原代细胞护理的修饰。

本文描述了生物传感器。在某些实施例中，生物传感器选自下组，该组由以下的生物传感器组成，其检测选自下组的细胞参数，该组由以下各项组成：细胞粘附、细胞附着、细胞形态、细胞表型、细胞增殖、细胞信号传导、细胞密度、细胞极性、pH、O₂、CO₂、葡萄糖及其组合。在实施例中，该装置是阻抗或光学装置。生物传感器可以如本文所述任选地涂覆。在实施例中，选择生物传感器，其测量与本文所述的治疗剂和/或活化剂类型相关的生理参数的变化。

在其他实施例中，试剂盒包含：具有用于将来自生物传感器的数据转换成输出的计算机可执行指令的非暂时计算机可读介质，其中该输出在限定的时间段内显示细胞生理应答参数的变化，其中该细胞生理应答参数选自下组，该组由以下各项组成：pH、细胞粘附、细胞附着模式、细胞增殖、细胞信号传导、细胞存活、细胞密度、细胞大小、细胞形状、细胞极性、O₂、CO₂、葡萄糖及其组合；将输出分类为应答者或无应答者和/或无应答、应答较弱、以及有应答；并产生分类的报告。

在其他实施例中，本发明提供具有实现本公开的方法的指令的计算装置或计算机可读介质。计算机可读介质包括非暂时性CD、DVD、闪盘驱动器、外部硬盘驱动器和移动装置。

本文所述的试剂盒和方法可以使用处理器/计算机系统。例如，本文所述的一个实施例可使用通用计算机系统，包含处理器，其耦合到用以实现该方法的程序存储器存储计算机代码，耦合到运转存储器和诸如常规计算机屏幕、键盘、鼠标和打印机之类的接口以及其他接口诸如网络接口和包括数据库接口的软件接口。

计算机系统接收来自数据输入装置(例如键盘、输入数据文件或网络接口)或另一个系统(例如，解释例如在限定时间段内生物传感器产生的数据的系统)的输入并且向输出装置(例如打印机、显示器、网络接口或数据存储装置)提供输出。输入装置(例如网络接口)接收包含如本文所述的细胞生理参数的变化和/或这些变化的量化的输入。输出装置提供诸如显示器的输出，包括描绘细胞参数变化的检测和/或量化的一个或多个数字和/或图形。

计算机系统可以耦合到存储由本文所述的方法生成的数据的数据存储器。为每个测量和/或每个受试者存储此数据；可任选地，对应于每个受试者存储这些数据类型中的每一个的多个集合。可以使用一个或多个计算机/处理器，例如作为单独的机器，例如通过网络耦合到计算机系统，或者可以包含在计算机系统上运行的单独的或集成的程序。无论使用哪种方法，这些系统接收数据并作为交换提供关于检测/诊断的数据。

在一些实施例中，计算装置可以包括单个计算装置，诸如服务器计算机。在其他实施例中，计算装置可以包括被配置成通过网络(未示出)彼此通信的多个计算装置。计算装置可以在存储器内存储多个数据库。存储在计算装置上的数据库可以由临床执业临床医生、程序员鉴定码或任何其他期望的类别来组织。

来自生物传感器的数据可以发送到远程计算系统或另一数据存储装置。通信过程在起始模块初始化并开始，并继续下去到连接操作。连接操作例如经由有线连接、无线局域网(WLAN或Wi-Fi)连接、细胞网络、无线个人局域网(WPAN)(例如)或任何所希望的通信链路将医疗保健提供商的存储信息通信地耦合到远程计算系统。

传送操作将数据从生物传感器发送到计算装置。在一个实施例中，传输操作在于装置间发送传输数据之前加密数据。通信过程可以在停止模块处完成并结束。一旦生物传感器数据被传送到远程计算装置，数据被转换成输出，例如随着时间的细胞指数测量。在某些实施例中，选择限定的端点，并且用于将细胞样品分类为如本文所述的无应答、弱应答或应答。在实施例中，作为应答者或非应答者的样品分析的状态使用类似的过程通信回医疗保健提供商，经由有线连接、无线局域网(WLAN或Wi-Fi)连接、细胞网络、无线个人局域网(WPAN)(例如)或任何所希望的通信链路。

在某些实施例中，计算机可读存储介质具有计算机可执行指令，当由计算装置执行时，这些计算机执行指令使计算装置执行包含以下的步骤：将来自生物传感器的数据转换成输出，其中该输出在限定的时间段内显示细胞生理应答参数的变化，其中在存在和/或不存在治疗剂的情况下，该细胞生理应答参数选自下组，该组由以下各项组成：pH、细胞粘附、细胞附着模式、细胞增殖、细胞信号传导、细胞存活、细胞密度、细胞大小、细胞形状、细胞极性、O₂、CO₂、葡萄糖及其组合；在限定的终点将输出分类为无应答和有应答，通过将在存在治疗剂的情况下来自细胞样品的生物传感器的输出与在不存在治疗剂的情况下来自细胞样品的生物传感器的输出进行比较；并产生分类的报告。在实施例中，计算机可执行指令包含用于将分类传达给医疗保健提供者的指令。

在其他实施例中，计算机可读存储介质可以包括如下指令，其用于鉴定在受试者的疾病细胞样品中哪些通路是可操作的。当由计算装置执行时，这些指令包含确定来自用第一活化剂或干扰剂治疗的受试者的疾病细胞样品的生物传感器数据的输出与来自没有用第一活化剂或干扰剂处理的相同受试者的第二疾病细胞样品的生物传感器数据的输出彼此之间是否存在差异，以确定对该第一活化剂或干扰剂有应答的通路在疾病细胞样品中是否是有活性的；鉴定输出中差异的存在，作为该通路活性的指示，并且将该通路的活性传达给医疗保健提供者。本文描述了活化剂或干扰剂及其通路。

使用本文所述的方法设想了至少五种类型的CELx检验。

1)确定靶标通路药物功效的通路关闭检验。在此检验中，测量由靶标通路药物与其细胞靶标结合引起的检验细胞的生理变化，并将其与基线测量值进行比较。

2)确定抗增生药物功效的抗增生检验。在此检验中，测量由抑制其增殖能力引起的检验细胞的生理变化并与基线测量进行比较。

3)确定组合使用的两种或更多种药物的功效的组合检验。在此检验中，测量由药物引起的检验细胞的生理变化并与基线测量进行比较。组合检验可以包括两种或更多种靶向通路药物、两种或更多种抗增生药物、或每种类型药物中的一种或多种。

4)证明特定患者中通路功能的功能性通路检验。在此检验中，通过添加干扰剂和/或确认剂引起的检验细胞的生理变化指示患者中信号传导通路的功能状态。将此结果与单独确定的截止值进行比较，以确定该通路功能是否异常(例如疾病相关)或正常。

5)通过测量配体和/或组合靶标的存在来确定配体和/或靶标是否存在的配体/靶标检验。

实例

实例1-5的实验设计的讨论

该方法利用CReMS来测量在细胞或细胞通路中发生蛋白结合后细胞或细胞通路的生理变化。通常理解，除非结合，否则药物不能起作用，并且几乎所有的疾病基因都落入核心信号传导通路。鉴于此，并且事实上蛋白质结合的生化原理跨细胞类型是通用的，因此本文所述的方法广泛适用于可发生蛋白质和其他生物分子结合的所有细胞和细胞通路。

当今技术水平的遗传检验不能直接指示药物或通路是否结合，并且因此不能可靠地预测药物应答。通过鉴定在引入药物后在细胞内发生的生理变化，CELx检验可以可靠地预测受试者细胞对药物的应答，

为了说明这些方法所能实现的类型的检验的一些实施例，对来自患有三种不同类型癌症的11个不同患者的细胞进行了65次实验。检验了影响11种不同细胞通路的16种不同药物，并利用了两种不同的CReMS类型。在下面的表15中提供了在本申请实例中报告结果的检验的列表：

表15.执行的检验的列表

实验设计原则

组织：

选择来自具有最高发病率的癌症中的三种的组织。

乳腺癌.乳腺癌细胞被用于64％的检验，因为乳腺癌模型在进展、各种各样的细胞形态、可变代谢率和存活率方面代表了许多其他癌症，并且在许多其他的组织中发现了对于癌症来说普遍的异常分子和通路。

结肠癌和肺癌.利用结肠癌和肺癌细胞来说明本公开的系统和方法对其他重要癌症类型的适用性。

细胞：

选择8名患有乳腺癌上皮细胞类型普遍临床表现的患者的细胞进行检验。使用组织收集领域技术人员经常使用的细胞样品采集技术获得来自患者的细胞。

患者B1：细胞来源于61岁女性的TNM>

患者B2：细胞来源于51岁白种女性乳腺腺癌的胸腔积液。细胞具有约28小时的倍增时间，出现浸润性鳗鱼样形态，并具有高表达水平的ERB>

患者B3：细胞来源于43岁白人女性乳腺腺癌的胸腔积液；约20小时倍增时间，鹅卵石上皮形态，非常高表达水平的ERB>

患者B4：细胞来源于47岁黑人女性乳腺浸润性导管癌腹水液；具有110小时的倍增时间，圆形的葡萄样集群形态，具有非常高表达水平的ERB>

患者B5：细胞来源于60岁白人女性原发性乳腺浸润性导管癌；28小时倍增时间，无定形扩散和浸润性形态的混合，非常高表达水平的ERB>

患者B6：细胞来源于70岁黑人女性原代乳腺化生癌TNM>

患者B7：细胞来源于69岁白人女性乳腺浸润性导管癌的胸腔积液；30小时倍增时间，小马赛克上皮形态，低表达水平的ERB>

患者B8：细胞来源于48岁白人女性乳腺腺癌的胸腔积液；24小时倍增时间，非常小的葡萄状集群形态，低表达水平的ERB>

选择2名患有结肠癌上皮细胞类型普遍临床表现的患者的细胞进行检验：

患者C1：细胞来源于男性结肠直肠癌。细胞具有14小时的球体体积倍增时间、高水平的ERB>

患者C2：细胞来源于44岁白人女性的原发性结肠腺癌2级。细胞具有46小时的球体体积倍增时间、高水平的ERB>

选择2名患有非小细胞肺癌上皮细胞类型普遍临床表现的患者的细胞进行检验：

患者L1：细胞来源于25岁男性非小细胞肺癌的胸腔积液；48小时倍增时间，上皮形态，升高表达水平的ERB>

患者L2：细胞来源于52岁白人男性的细支气管肺泡腺癌；约30小时倍增时间，上皮形态，正常表达水平的ERB>

细胞通路靶标：

为这些实验选择的药物影响11个细胞通路，其代表大多数细胞调控通路如何广泛互连，通过结合而调控，涉及酶活性如磷酸化和去磷酸化，并控制关键的细胞功能。

MAPK.(EGFR，EGFR-TK，HER1，HER2)。在所有细胞类型中都发现促分裂原活化蛋白(MAP)激酶，并且是对细胞外刺激(有丝分裂原、渗透胁迫、热休克和促炎细胞因子)有应答的必需丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，并调控各种细胞活性，例如基因表达、有丝分裂、分化、增殖和细胞存活/凋亡。它们的紧密调控对于维持细胞活力是重要的。表皮生长因子受体(人类中的EGFR；ErbB-1；HER1)是细胞外蛋白质配体的表皮生长因子家族(EGF家族)成员的细胞表面受体。导致EGFR过表达(称为上调)或有过度活性的突变与许多癌症相关，包括肺癌、肛门癌和多形性成胶质细胞瘤。EGFR或家族成员的突变、扩增或错误调控牵涉所有上皮癌的约30％，并且它是扩大类别的抗癌疗法的靶标。

PI3K/PTEN(Her2、3、4，VEGF)。在几乎所有细胞类型中发现的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路对于细胞存活和细胞生长至关重要，并且可以通过结合细胞表面受体的生长因子来活化。它是复杂的信号传导级联，是癌症中最常活化的通路之一。它是基因组畸变靶向的，包括突变、扩增和重排，比人类癌症中任何其他通路更频繁。VEGF受体跨广泛范围的人肿瘤和细胞系表达。已经显示VEGF的表达导致促进肿瘤生长和转移的血管网络的发育和维持。VEGF在大多数非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌和其他肿瘤中表达。随着肺癌的进展，VEGF以更高的水平表达。此外，大量且越来越多的证据指示VEGF基因表达与预后不良密切相关。

细胞粘附.细胞粘附通路几乎贯穿所有主要的生理功能。这些通路涉及使用细胞粘附分子如选择素、整合素和钙黏蛋白将细胞与表面、细胞外基质或另一个细胞结合。正确的细胞粘附对维持多细胞结构至关重要。细胞粘附可以连接细胞的细胞质并且可以涉及在信号转导中。所有的粘附是由细胞表面介导的，无论直接涉及质膜的整体组分，或是间接地通过排出并沉积在细胞外部的材料。

MEK.MEK是RAS/RAF/MEK/ERK通路中的关键蛋白激酶，其表示癌细胞增殖和存活。癌症中经常活化MEK，特别是在RAS和RAF癌基因中具有突变的肿瘤中。MEK还调控炎症细胞因子TNF、IL-6和IL-1的生物合成，其可以充当癌症中的生长和存活因子。MEK通路充当不同肿瘤增殖的中心轴，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、头/颈癌和胰腺癌。并且单独或与其他药物组合的MEK抑制是治疗癌症的重要治疗策略。

RHO.Rho蛋白涉及到多种多样的细胞功能中，如细胞极性、囊泡运输、细胞周期和转录组学动态。Rho活化可以在癌细胞中具有许多不同的作用。在肿瘤开始时，Rho活性的修饰可以抑制细胞凋亡并且因此有助于人造细胞的长命。在抑制天然凋亡后，可以通过其中Rho蛋白发挥不可或缺的作用的极性的丧失观察到异常的肿瘤生长。接下来，通过改变可能由Rho蛋白引起的粘附蛋白，生长的物质可以侵入其正常边界。

AKT.AKT是丝氨酸/苏氨酸激酶，并且作为聚集上游信号传导通路的群集的基本节点在细胞内发挥作用，其涉及受体酪氨酸激酶如IGF-1R、HER2/Neu、VEGF-R、PDGF-R和受体PI-3K的膜上区域化复合物的集合的刺激和通过第二信使PIP活化Akt。由于AKT及其上游调控因子在广泛范围的实体瘤和血液恶性肿瘤中被解除调控，并且考虑到此通路的上述生物学后遗症，AKT通路被认为是这些肿瘤的生物侵袭性的关键决定因素，并且是新型抗癌疗法的主要潜在靶标。

FAK1.由于事实上这种酪氨酸激酶在胚胎发育、控制细胞迁移、细胞周期进展和细胞凋亡中起着根本性作用，因此强调了黏着斑激酶1(FAK1)介导的信号转导的生物学重要性。它在贴壁依赖性细胞的存活中起核心作用，并且对于整合素连接的细胞迁移至关重要-在恶性肿瘤发展中发挥重要作用的过程。FAK在广泛范围的人上皮癌中上调，表达与浸润潜能密切相关。最近，FAK表达已经牵涉在肿瘤细胞进展到恶性肿瘤或癌症的发病机制中。FAK1在调控乳腺癌抗雌激素耐药方面起主要作用。

RAS/RAF.RAS通路是癌症中最常见的解除调控的通路之一。RAS通过多种效应通路发出信号，包括RAF/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调控激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK>

MAK通路.转移相关激酶(MAK)是细胞生长所需的转录因子的新型调控因子。此通路的抑制导致细胞周期阻滞活性。

MKK.促分裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)信号传导通路一直致力于重要细胞过程的转录和翻译后调控，包括细胞分化、增殖、运动性和存活。由于MKK信号传导通路在调节VEGF的释放和对VEGF的应答中起至关重要的作用，所以认为MKK在促进肿瘤血管形成中起重要作用。

凋亡通路.凋亡通路的活化是细胞毒性药物杀死肿瘤细胞的关键机制。凋亡通过两个主要通路发生。第一个，称为外源或细胞质通路，通过Fas死亡受体(肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员)触发。当干扰导致细胞色素c从线粒体释放和死亡信号活化时，第二个通路是内在或线粒体通路。两个通路都汇合到最终的共同通路，涉及称为半胱天冬酶的蛋白酶级联的活化，这种蛋白酶会切割调控和结构分子，以细胞死亡而终结。凋亡信号传导的缺陷有助于肿瘤的抗性。

治疗剂：

选择的治疗剂包括代表小分子药物和衍生自抗体的那些。检验的治疗剂包括一些如下的，具有设计来关闭细胞内功能特异性通路的作用机制以及被设计来引起细胞凋亡的其他。

西妥昔单抗.西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux))是嵌合(小鼠/人)单克隆抗体，一种表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，通过静脉输注给予的用于治疗转移性结肠直肠癌和头颈癌。当生长因子与其受体在细胞表面结合时，这些受体给出引起细胞分裂的信号。一些癌症是由突变的受体引起的，即使没有生长因子也能给出分裂信号。这导致细胞不可控制地分裂。西妥昔单抗那样与受体结合，并关闭该信号。

埃罗替尼.盐酸埃罗替尼(特罗凯(Tarceva))是用于治疗非小细胞肺癌、胰腺癌和几种其他类型癌症的药物。它是一种可逆的酪氨酸激酶抑制剂，其作用于表皮生长因子受体(EGFR)。埃罗替尼特异性靶向表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶，其高度表达并且在各种形式的癌症中偶有突变。它以可逆的方式结合受体的腺苷三磷酸(ATP)结合位点。

拉帕替尼.拉帕替尼(泰克博(Tykerb)/泰维博(Tyverb))是用于乳腺癌和其他实体瘤的口服活性药物。它是双重酪氨酸激酶抑制剂，其中断HER2生长受体通路。其用于HER2阳性乳腺癌的联合疗法。拉帕替尼抑制与两种癌基因EGFR(表皮生长因子受体)和HER2/neu(人类EGFR>

曲妥珠单抗.曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin))是干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。其主要用途是治疗某些乳腺癌。当它结合有缺陷的HER2蛋白时，HER2蛋白不再导致乳腺细胞不可控制地再现。

多西紫杉醇.多西紫杉醇(泰索帝(Taxotere))是一种临床上良好建立的抗有丝分裂化疗药物(即，它干扰细胞分裂)。它主要用于治疗乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和非小细胞肺癌。多西紫杉醇是化疗药物类；紫杉烷，是紫杉醇(紫杉酚)的半合成类似物。

GSK1059615.磷酸肌醇3-激酶抑制剂(PI3K抑制剂)是通过抑制作为在癌症中起关键作用的PI3K/AKT/mTOR通路的部分的磷酸肌醇3-激酶而发挥作用的潜在医用药物。抑制这种通路通常抑制肿瘤生长。

GSK1120212.GSK1120212是具有有希望的抗肿瘤活性的MEK1和MEK2(MEK1/2)酶的有效和选择性的变构抑制剂。

帕唑帕尼.帕唑帕尼(福退癌(Votrient))是VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-a/β和c-kit的有效和选择性的多靶向受体酪氨酸激酶抑制剂，其阻断肿瘤生长并抑制血管生成。

紫杉醇.紫杉醇是一种有丝分裂抑制剂，用于治疗患有肺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌和晚期卡波西肉瘤的患者。紫杉醇稳定微管并且因此在细胞分裂过程中干扰微管的正常分解。与多西紫杉醇一起，它形成紫杉烷药物类别。

氟尿嘧啶.氟尿嘧啶(5-FU或f5U)(Adrucil，Carac，Efudix，Efudex和Fluoroplex)是用于治疗癌症的嘧啶类似物的药物。它是一种自杀性抑制剂，并且通过对胸苷酸合酶的不可逆抑制而起作用。它属于称为抗代谢物的药物家族。

卡培他滨.卡培他滨(希罗达(Xeloda))是用于治疗转移性乳腺癌和结肠直肠癌的口服化疗剂。卡培他滨是前体药物，其在肿瘤中酶促转化为5-氟尿嘧啶，其中它抑制DNA合成并减缓肿瘤组织的生长。

托泊替康.托泊替康(和美新(Hycamtin))是作为拓扑异构酶抑制剂的化疗剂。它用于治疗卵巢癌和肺癌以及其他癌症类型。拓扑异构酶-I是防止DNA复制的核酶，并最终导致细胞死亡。此过程导致DNA链断裂并导致细胞凋亡。

伊立替康.伊立替康(Camptosar)是用于治疗结肠癌的药物。伊立替康通过水解活化为SN-38，是拓扑异构酶I的抑制剂。活性代谢物SN-38对拓扑异构酶I的抑制最终导致DNA复制和转录的抑制。

奥沙利铂.奥沙利铂是用于癌症化疗的配位复合物。这些基于铂的药物通常被分类为烷化剂。奥沙利铂是通过在DNA中形成链间和链内交联而发挥作用的烷化剂。DNA中的交联阻止DNA复制和转录，导致细胞死亡。

顺铂.顺铂(普拉廷(Platin))用于治疗各种类型的癌症，包括肉瘤、一些癌(例如小细胞肺癌和卵巢癌)、淋巴瘤和生殖细胞肿瘤。它是一类含铂的抗癌药物的第一成员，其现在也包括卡铂和奥沙利铂。这些铂络合物在体内发生反应，与DNA结合并引起DNA的交联，其最终引发凋亡。

CReMS类型

使用两种类型的CReMS，光学生物传感器和阻抗生物传感器，来测量检验过程中细胞的生理应答，并证明如何在不同类型的CReMS上测量发生的生理变化的量。

预测标准

疾病诊断：

将从本文所述方法得到的检验结果与截止值进行比较；其中截止值以上的检验结果记录为检验阳性，且低于截止值的记录为检验阴性。当发现患者信号传导通路活性的被测变量大于针对该特定信号传导通路导出的截止值时，因此认为有异常的信号传导通路活性的患者被诊断具有与该异常信号传导通路活性相关的疾病。相反，当发现患者信号传导通路活性小于针对该特定信号传导通路导出的截止值时，因此认为有正常的信号传导通路活性的患者被诊断不具有与异常信号传导通路活性相关的疾病。

在多种情况下，其中患者首先诊断患有与信号传导通路相关的生物标志物，本文所述的方法可以校正基于生物标志物的诊断。

药物功效：

通过抑制靶向通路或凋亡通路在CELx检验过程中引起的生理变化量被记录为三类之一：

1)非应答者：与未处理的对照细胞相比，由于两种药物的最高生理相关浓度，细胞指数降低<25％。这一结果将指示患者不会对所检验的药物组合作出应答；

2)应答者(弱)：由于任何水平的浓度的药物，细胞指数降低25％-50％之间。这指示患者将在一定程度上对检验药物的组合作出应答。

3)应答者(强)：由于任何水平的浓度的药物，细胞指数降低>50％。这指示患者将对检验药物作出应答。

使用阻抗或光学生物传感器的细胞指数使用阻抗测量或屈光指数测量的基线起点计算。基线起点阻抗或屈光指数是在用药物或其他干扰剂进行任何处理之前细胞的健康、活力和生理状态的物理可观察特征和指示。药物或干扰剂的添加导致阻抗或屈光指数的基线读数在时间模式上的变化，反映细胞经历的细胞生理变化的特异性。

实例1

显示两个患者对两种药物的差异化应答的通路关闭检验

使用来自两个HER2过表达乳腺癌患者(患者B1和B4)的细胞，两种用于HER2阳性乳腺癌的药物(拉帕替尼和曲妥珠单抗)和人表皮生长因子(EGF)进行CELx通路关闭检验。检验期间B1和B4细胞的生理变化用阻抗生物传感器CReMS测量，并且来自CReMS的输出记录在图1A和1B中。CELx检验结果与第三方临床参考文献的比较记录在图1C中。这个实例说明了CELx检验如何能够通过使用CReMS在几个小时内持续测量患者细胞的生理变化来预测患者对不同靶向通路药物的应答性。此实例还说明了遗传生物标志物(在这种情况下是过表达的HER2受体)的存在如何不是预测药物功效的充分条件。

材料与方法

CReM和微孔板：将4"x6"，96孔阻抗微孔板放入设计用于维持恒压的罗氏应用科学(Roche>

细胞：利用来自患者B1和B4的细胞。于-80℃接收细胞，解冻并根据标准人上皮细胞处理程序进行培养，典型在具有37℃，5％CO2的血清的缓冲培养基的T75培养瓶中培养。在添加到阻抗微孔板之前，将细胞从其含维尔烯的生长容器中除去，计数并重新悬浮于不含血清或其他生长因子的培养基中。

缓冲液和试剂：购买并使用如从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)或生命科技公司(Life>

程序：将每个孔中的6,000-12,000个之间的细胞接种到含有具有血清的120μL标准培养基的阻抗微孔板上。用不含血清的培养基代替溶液，以使细胞相对于生理状态和通路干扰进行同步。在通路干扰之前两小时，向无血清培养基中加入20微升药物。使用EC80剂量的受体配体(在20uL中典型为6nM)开始通路干扰。通过对通路干扰的完全细胞应答，生理变化的CReMS记录从缓冲液交换中连续维持数小时。通路检验在37℃，5％CO2和相对湿度75％下进行。

CReMS在整个检验中连续记录数据，其中数据表示两种治疗剂对B1和B4细胞的影响。

结果：图1A和1B分别表示在CELx检验期间用抗体药物曲妥珠单抗和小分子药物拉帕替尼在B1和B4细胞上收集的数据。由阻抗CReMS收集的数据在每个图中以X轴上的分钟时间和Y轴上的细胞指数表示。细胞指数表示检验期间B1和B4细胞的生理变化。

结果指示，用配体受体且未添加药物的全通道干扰产生最高细胞指数。药物曲妥珠单抗加入受干扰的B1细胞后，检验细胞的细胞指数变化小于5％，指示B1检验细胞不受添加曲妥珠单抗的影响。相反，将药物拉帕替尼加入B1细胞后，检验细胞的细胞指数下降50％以上，指示靶向通路中的活性明显降低。药物后，将拉帕替尼和曲妥珠单抗各自加入到B4细胞的单独样品中，每个检验细胞样品的细胞指数下降超过50％。这指示每个检验细胞样品的靶向通路中的活性显著降低。

基于这些结果，图1A所示的CELx通路关闭检验预测患者B1不会对曲妥珠单抗作出应答，而是对拉帕替尼作出应答。图1B所示的结果也预测患者B4将对曲妥珠单抗和拉帕替尼均有应答。CELx检验预测与第三方临床参考记录结果的比较在图1C中显示；它显示CELx检验准确地预测了临床参考标准记录的结果，其中发现患者B1对曲妥珠单抗不应答并应答于拉帕替尼，并且发现患者B4对两者都有应答。

讨论：在本发明的本实例中，CELx检验使用细胞B1和B4细胞准确地预测了两种药物曲妥珠单抗和拉帕替尼的功效。B1和B4细胞用受体配体对HER2通路的干扰作出应答，指示患者可以对能够关闭该通路内的活性的药物作出应答。在此实例中，尽管药物具有相似的作用机制，B1细胞表现出对这两种药物的差异化应答。发现患者B1对拉帕替尼有应答，而对曲妥珠单抗无应答。

这个实例说明了如何将CELx检验应用于不同类型的治疗剂，包括在细胞表面起作用的治疗剂，如曲妥珠单抗的情况(一种抗体药物)或在细胞质中起作用的治疗剂，如激酶抑制剂药物的情况，拉帕替尼。它还说明了本公开的系统和方法如何有效地检测对靶向MAPK、RHO、AKT、FAK1、RAS/RAF、PIK3和细胞粘附通路的药物的应答的变化。此实例还说明了如下原则，对相关遗传生物标志物(在这种情况下是过表达HER2基因)的存在的了解不是预测药物是否将根据其预期作用机制发挥作用的充分条件。在这个实例中，药物曲妥珠单抗并不总是关闭每个Her2阳性癌细胞类型的HER2生长因子信号传导通路，正如所打算的。尽管遗传概况类似，患者B1和B4对曲妥珠单抗的应答不同，如CELx检验所证实的。相反，本发明方法的一个实施例准确地预测了在HER2位点起作用的另一种药物拉帕替尼能够按照为两个患者设计的那样关闭通路。此实例的结果与第三方报告的应答相关，证实了使用患者病变细胞中生理变化的测量来预测治疗剂是否将提供预期功效的能力。对于本发明，医师基于肿瘤细胞对药物的实际应答性来选择针对乳腺癌患者的治疗。

实例2

显示两种患者对一种药物的差异化应答的抗增殖检验

使用来自两个乳腺癌患者(B1和B2患者)的细胞和药物紫杉醇进行CELx抗增殖检验。检验期间B1和B2细胞的生理变化用阻抗生物传感器CReMS测量，并且来自CReMS的输出记录在图2A和2B中。CELx检验结果与第三方临床参考文献的比较记录在图2C中。该实例证明了CELx检验在引入抗增殖药物之后通过测量患者的癌细胞几天的过程中的生理变化来预测治疗剂的功效的能力。此实例还证明了在测量结果时基线(在这种情况下，未处理的患者细胞)的作用。此外，为患者B2记录的结果证明，由于细胞对药物的应答性随时间推移而发生变化，因此在几天内连续监测细胞生理应答的重要性。

材料与方法

CReMS，微孔板，试剂和缓冲液：实例1中使用的CReMS、微孔板、试剂和缓冲液与实例2中使用的相同，除了所检验的治疗剂。在实例2中，检验治疗剂紫杉醇。紫杉醇购自塞莱克化学品(Selleck>

细胞：患者B1和B2的乳腺癌细胞以与实例1所述相同的方式利用和处理。

程序：将每个孔中的6,000-12,000个之间的细胞接种到含有具有血清的120μL沉淀培养基的阻抗微孔板上。将40微升药物紫杉醇加入到一组B1和B2细胞中的每种；B1和B2细胞的另一个对照组没有接受药物。从细胞首次通过完全细胞应答接种在微孔板上48-72小时之间时，生理变化的CReMS记录吃维持连续。检验在37℃，5％CO2和75％相对湿度下进行。

结果：图2A和2B显示了CELx检验期间用药物紫杉醇在B1和B2细胞上收集的数据。由阻抗CReMS收集的数据在图中以X轴上的小时时间和Y轴上的细胞指数表示。细胞指数表示检验期间B1和B2细胞的生理变化。细胞指数的增加通常指示细胞增殖的增加。而长期细胞指数的减少通常表示细胞活力丧失或活细胞数目减少。B2检验细胞显示对紫杉醇的初始应答性，反映在与B2对照细胞相比，CReM输出显著降低，但是在大约24小时后，CReM输出反转，指示检验细胞开始增殖并且不再应答于毒品。B1检验细胞显示对紫杉醇的立即和连续应答，反映在整个检验期间与B1对照细胞相比，CReM输出降低。图2A和2B中所示的CELx检验结果预测B1和B2患者将对紫杉醇作出应答。CELx检验预测与第三方临床参考记录结果的比较在图2C中显示；它显示CELx检验准确地预测了临床参考标准记录的结果，其中患者B1和B2都被发现对紫杉醇有应答。

讨论：在本实例中，CELx检验准确地预测了两个乳腺癌患者B1和B2的抗增殖药物紫杉醇的功效。此外，患者B2的CELx检验结果指示，短期内紫杉醇抗性发展，说明延长时间段内连续监测细胞生理应答的重要性。这个结果很重要，因为药物疗法的主要问题之一是抗药性的快速发展。当患者被处方以无效疗法时，时间就会损失。除了增加化学毒性的风险和引起化学疗法的常见副作用外，在许多情况下，用一种药物治疗消除了用可能更有效的另一种药物治疗的可能性。

实例3

显示两个患者对两种药物作为整体的应答的组合检验

使用来自两个结肠癌患者(患者C1和C2)的细胞EGF和指示结肠癌的两种药物西妥昔单抗和伊立替康的组合进行CELx组合检验。检验期间C1和C2细胞的生理变化用阻抗生物传感器CReMS测量，并且来自CReMS的输出记录在图3A和3B中。CELx检验结果与第三方临床参考文献的比较记录在图3C中。此实例证明了CELx检验如何能够预测个体患者对两种或更多种药物的组合的应答性，这是无法使用遗传检验或表达谱分析进行的。该检验还说明除了乳腺癌细胞之外，CELx检验如何操作结肠癌细胞。

材料与方法

CReMS，微孔板，试剂和缓冲液：实例1和2中使用的CReMS、微孔板、试剂和缓冲液与实例3中使用的相同，除了所使用的治疗剂。在实例3中，检验了两种治疗剂，西妥昔单抗和伊立替康。伊立替康是从塞莱克化学品(Selleck>

细胞：患者C1和C2的结肠癌细胞以与实例1所述相同的方式利用和处理。

程序：将每个孔中的6,000-12,000个之间的细胞接种到含有具有血清的120μL沉淀培养基的阻抗微孔板中。用不含血清的培养基代替溶液，以使细胞相对于生理状态进行同步。将20微升伊立替康和西妥昔单抗中的每种加入到一组C1和C2细胞中的每种；C1和C2细胞的另一个对照组没有接受药物。从细胞首次通过完全细胞应答接种在微孔板上48-72小时之间时，生理变化的CReMS记录吃维持连续。检验在37℃，5％CO2和75％相对湿度下进行。

结果：图3A和3B表示CELx检验期间在C1和C2细胞上收集的数据以及抗体药物西妥昔单抗和小分子药物伊立替康的组合。由阻抗CReMS收集的数据在图中以X轴上的小时时间和Y轴上的细胞指数表示。细胞指数表示检验期间C1和C2细胞的生理变化。结果表明，未处理的对照C1和C2细胞产生最高的细胞指数。将两种药物加入C1和C2检验细胞后的结果显示每个细胞样品的细胞指数降低大于50％。这些结果预测C1和C2患者将对西妥昔单抗和伊立替康的组合作出应答。CELx检验预测与第三方临床参考记录结果的比较在图3C中显示；它显示CELx检验准确地预测了临床参考标准记录的结果，其中患者C1和C2均发现对西妥昔单抗和伊立替康组合都有应答。

讨论：在本实例中，CELx检验准确预测了两个结肠癌患者C1和C2对两种药物西妥昔单抗和伊立替康的功效。

然而，尽管患者C1对两种药物的总体结果显示细胞指数降低了大于50％，但CELx检验结果指示，药物中的一种即西妥昔单抗并不会导致患者C1细胞的生理变化。这表明药物组合在患者C1中的整体治疗益处可能是归因于伊立替康。如果医师知道联合疗法中只有一种药物有效(在这种情况下，伊立替康)，则他们只能开出有效的药物。CELx检验结果指示，患者2对每种单独的药物有应答，表明药物的组合比仅使用单一药物更有效。

结果说明了CELx检验如何能够预测个体患者对两种或更多种治疗剂的组合的应答性。该检验说明了CELx检验如何操作结肠癌细胞。它进一步说明了癌细胞对不同类型药物(在这种情况下，抗体药物西妥昔单抗，其通过结合细胞表面起作用)以及凋亡通路抑制剂(在这种情况下，伊立替康，其通过结合到细胞核起作用)的生理应答性。并且还说明了癌细胞对靶向MAPK、RHO、AKT、FAK1、RAS/RAF、PIK3和细胞粘附通路及凋亡通路的药物的生理应答性。结果将允许医师为结肠癌患者选择更有效的治疗

实例4

使用不同药物的另外的CELx检验

使用可能来自11种不同患者细胞的选集(来自患者B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7的患者的乳腺癌细胞、来自患者C1和C2的结肠癌细胞以及来自患者L1和L2的肺癌细胞)和15种不同药物(卡培他滨、西妥昔单抗、多西紫杉醇、氟尿嘧啶、吉非替尼、GSK1059615、GSK1120212、拉帕替尼、紫杉醇、帕唑帕尼、曲妥珠单抗、托泊替康、顺铂、厄洛替尼和奥西拉铂)的细胞和药物组合中的一些进行51个CELx通路关闭和抗增殖单药检验。进行六次CELx组合检验，两次用紫杉醇和顺铂的药物组合以及患者L1和L2细胞，且四次用曲妥珠单抗和拉帕替尼的药物组合以及患者B1、B2、B3和B4细胞。用阻抗生物传感器CReMS测量所检验的细胞和药物的生理变化，并且来自CReMS的总结输出记录在图4中。这些CELx检验结果与第三方临床参考之间的相关性记录在图7中。

材料与方法

CReMS，微孔板，试剂和缓冲液：图4中列出的57个检验中的每一个依赖于与实例1-3中所述相同的CReMS、微孔板、试剂和缓冲液。

细胞：来自患者B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、C1、C2、L1和L2的细胞以与实例1所述相同的方式被利用和处理。

程序：在涉及靶向通路药物(西妥昔单抗，吉非替尼，GSK1059615，GSK1120212，拉帕替尼，帕唑帕尼，曲妥珠单抗和厄洛替尼)的那些实验中，利用实例1中所述的程序。在涉及抗增殖药物(卡培他滨、多西紫杉醇、氟尿嘧啶、紫杉醇、托泊替康、顺铂和奥西拉铂)的那些实验中，利用实例2中所述的程序。在涉及药物组合的那些实验中，利用实例3中所述的程序。患者细胞和用细胞检验的药物的列表在图4中表征。

结果：对所列细胞和药物的各种组合进行的57个CELx检验的总结结果示于图4中。对于每个实验，计算检验细胞与其对照细胞相比的生理应答的变化。图4中的每个框将每个实验中测量的生理应答的变化分类为大于50％，在5％-50％之间或小于5％。图4中所示的系列检验说明了CELx检验在暴露于靶向广泛范围的细胞通路的广泛范围的药物之后测量在各种常见癌细胞类型中发生生理变化的能力。CELx检验预测与第三方临床参考记录结果的比较在图7中显示；它显示CELx检验结果与针对患者和药物组合报告的第三方临床参考相关。

讨论：在本实例中描述的57个检验中，本文所述的发明用以下证明了功效：

结肠癌、乳腺癌和肺癌细胞；

靶向通路药物，其通过包括EGFR、EGFR-TK、PI3K、MEK1、MEK2、HER2受体和VEGFR的靶标抑制MAPK、RHO、AKT、FAK1、RAS/RAF、PI3K、MAK、MKK、MEK和细胞粘附通路；以及

抗增殖药物，其通过包括拓扑异构酶I、TUBB1、BCL2、DNA、嘌呤交联(GG、AG、GNG)和胸苷酸合酶的靶标靶向凋亡通路。

每个CELx检验结果(除了一个)与针对此患者细胞和药物组合的结果相关。

实例5

从不同CReMS产生的结果之间的一致性检验

使用具有过表达表皮生长因子(EGF)受体的四名乳腺癌患者(患者B1、B2、B3、B4)的细胞、一种药物西妥昔单抗和人表皮生长因子(EGF)进行CELx通路关闭检验。用阻抗生物传感器CReMS和光学生物传感器CReM测量了检验期间四种患者细胞的生理变化，以证明两种不同CReMS产生的结果的相关性。CReMS的输出记录在图5中。此实例说明了CELx检验如何能够使用两种不同的CReMS来获得患者细胞中相同生理变化的测量。

材料与方法

CReMS和微孔板：在这个实例中使用了两种不同的CReMS。在一系列检验中，将4"x6"，96孔阻抗微孔板放入设计用于维持恒压的罗氏应用科学(Roche>

试剂和缓冲液：实例1中使用的试剂和缓冲液与实例5中使用的相同，除了所采用的治疗剂。在实例5中，检验治疗剂西妥昔单抗。西妥昔单抗从医疗药房获得。

细胞：将患者B1、B2、B3和B4的乳腺癌细胞用于两组检验，并以与实例1所述相同的方式处理。

程序：在用阻抗生物传感器CReMS进行的一组检验中，将每个孔中的6,000-12,000个之间的细胞接种到含有具有血清的120μL沉淀培养基的阻抗微孔板上。在通路干扰之前2小时，将四十微升药物西妥昔单抗加入到含有一组B1、B2、B3和B4患者细胞中每个的无血清培养基中；B1、B2、B3和B4细胞的另一个对照组不接受药物。使用EC80剂量的受体配体(在20uL中为6nM)开始通路干扰。从细胞首次通过完全细胞应答接种在微孔板上20-48小时之间的范围时，生理变化的阻抗CReMS记录吃维持连续。检验在37℃，5％CO2和75％相对湿度下进行。

在用光学生物传感器CReMS进行的一组检验中，将每个孔中的6,000-12,000个之间的细胞接种到含有具有血清的60μL沉淀培养基的光学微孔板上。在通路干扰之前2小时，将二十微升药物西妥昔单抗加入到含有一组B1、B2、B3和B4患者细胞中每个的无血清培养基中；B1、B2、B3和B4细胞的另一个对照组不接受药物。使用EC80剂量的受体配体(在20uL中为6nM)开始通路干扰。从细胞首次通过完全细胞应答接种在微孔板上20-48小时之间的范围时，生理变化的光学CReMS记录吃维持连续。检验在25℃-30℃，<5％CO2和30％相对湿度下进行。

结果：图5显示了在来自四个乳腺癌患者(B1、B2、B3和B4)的细胞上用药物西妥昔单抗和EGF分别进行的8次CELx检验的总结结果。使用光学生物传感器CReMS进行细胞B1、B2、B3和B4的一组检验，并使用阻抗生物传感器CReMS在相同细胞上进行另一组检验。结果以总结方式呈现，显示了CReMS记录的输出百分比变化范围。对于每个检验的患者细胞，每种CReMS记录的生理变化量是相同的。这些结果表明，CELx检验方法可以利用测量细胞不同生理变化的不同类型的CReMS。

讨论：在本实例中，在具有不同转导器界面的两种不同的CReMS上进行CELx检验以测量细胞生理变化。尽管用于获得对治疗的生理应答的装置有显著差异，但是光学生物传感器CReMS和阻抗生物传感器CReMS为每个患者样品提供了相同的结果。此结果对于将本发明延伸到许多CReMS类型以及说明本发明使用个体患者的细胞生理变化来预测对药物的治疗应答的普遍性是重要的。

CELx检验结果和实例1-5的临床预测的总结

实例1-4中描述的所有65个总CELx检验的总结结果示于图6中。图6中描述的CELx检验结果与记录患者对单一药物或药物组合的应答性的第三方临床参考结果的相关性(0％或100％)示于图7中。在所有65个检验中，除了一个外，CELx检验预测和第三方测量产生了相同的结果，说明了CELx检验预测对靶向广泛范围的细胞通路的16种不同药物的乳腺、肺和结肠患者应答的能力。

实例1-4中检验的各患者癌细胞的CELx检验预测与第三方记录提供在图8A、8B、8C和8D中。准确预测患者将对药物或药物组合作出应答的CELx检验结果表示为真阳性(TP)结果。患者不会对药物或药物组合作出应答的准确预测表示为真阴性(TN)结果。患者对药物或药物组合作出应答的不准确预测表示为假阳性(FP)，并且患者将对药物无应答的不准确预测表示为假阴性(FN)。

图8A记录了实例1-4中用单独检验或与16种不同药物组合检验的12种癌症患者细胞进行的所有检验的结果与第三方记录的比较。图8B记录了单独和与13种不同药物组合检验的8种乳腺癌患者细胞的结果与第三方记录的比较。图8C记录了单独和与3种不同药物组合检验的2种不同结肠癌患者细胞的结果的比较。图8D记录了单独和与3种不同药物组合检验的2种不同肺癌患者细胞的结果的比较。在每个图中，显示了CELx检验准确地预测患者是否将对特定药物或药物组合作出应答，除了一种情况，在图8B中，可以看出期望作为吉非替尼的应答者的一种患者乳腺癌细胞样品在CReMS检验中没有显示出应答。

图9中提供了CELx检验对实验1-4中检验的患者细胞和药物以及对所检验的子组的患者、药物、通路和CReMS类型的敏感性和特异性。总体而言，且在所研究的每个子组中，CELx检验产生高敏感性(98％+)和特异性(99.9％+)。这些结果说明了该检验跨不同癌细胞类型、药物类型、CReMS类型和在实例1-5中描述的检验中靶向的通路的预测能力。

实例6

使用细胞附着信号(CAS)的诊断测定系统

本文使用的诊断检验的分析物是当放置在微孔板的孔中时，单独或存在细胞拮抗剂的情况下，患者活细胞产生的细胞附着信号(CAS)，并用阻抗生物传感器分析。对于每个检验，测量和分析两组患者细胞样品的CAS。

1)仅患者细胞(C)

2)患者细胞+一个或多个通路因子(CF)

3)患者细胞+一个或多个通路因子+确认剂(CCF)

为了检测信号传导通路是否正常发挥作用，患者病变细胞中的信号传导通路被干扰，并将所得活性与干扰剂对其健康细胞的信号传导通路活性的影响或干扰剂对来自患者或已知无疾病的患者的健康细胞的信号传导通路活性的影响进行比较。该测定测量患者健康细胞中CF和C细胞之间的CAS变化，相对于病变细胞中CF和C细胞之间的CAS变化。可替代地，该测定可以测量患者病变细胞中CF和C细胞之间的CAS变化，可以将其与来自患者或已知无疾病的患者池的已知结果进行比较。基本上，如果信号传导通路异常，健康和病变细胞之间的CAS变化将是不同的。对来自受试者的CF和CCF病变细胞之间的CAS变化的测量证实了CF CAS表示感兴趣的信号传导通路的活性。在CCF相对于CF不变化的情况下，这将指示CF中的信号传导通路活性表示与感兴趣条件无关的一些其他信号传导通路活性。在这些情况下，患者不会被认为具有被分析的疾病。

进行了研究，证实这种细胞分析方法测量原代非转化恶性和健康上皮细胞以及细胞系中的特定通路活性的能力。来自这些研究的代表性数据显示在图10和11中，针对涉及在乳腺癌、PI3K和ERα中的两个关键通路。

图10A和10B显示NRG1，一种PI3K信号传导通路因子(即，干扰PI3K信号传导通路的药剂)，如预期的那样增加被检验的细胞(图10A中的BT474乳腺癌细胞系细胞和图10B中的患者54原代乳腺癌细胞)中的细胞附着信号(CAS)，并且确认剂拉帕替尼，一种双重PI3K和MAPK抑制剂，降低CAS，证实仅用NRG1测量的CAS对PI3K通路的活性是特异性的。图10C显示了原代乳腺癌细胞(患者54细胞)和健康乳腺癌细胞(H62细胞)之间对NRG1的差异应答，证明使用信号传导通路活性作为疾病活性的表型生物标志物的有效性。

图11A和11B显示雌二醇，一种ERα通路因子，如预期的那样改变被检验的细胞(图11A中的BT474乳腺癌细胞系细胞和图11B中的患者54原代乳腺癌细胞)中的CAS，并且确认剂氟维司群，一种ERα抑制剂，逆转CAS，证实仅用雌二醇测量的CAS对ERα通路的活性是特异性的。图11C显示了原代乳腺癌细胞(患者54细胞)和健康乳腺癌细胞(H62细胞)之间对雌二醇的差异应答，证明使用通路活性作为疾病活性的表型生物标志物的有效性。

实例7

测量信号传导通路活性以鉴定病变细胞中具有非过表达的HER2受体和异常HER2信号传导通路活性的乳腺癌患者

为了证明本发明的价值和效用，并且本发明足够精确和准确地用作临床试验，用本发明分析来自大量健康和病变患者的细胞。确切而言，此实例证明了本发明如何鉴定癌细胞具有非过表达或未扩增水平的HER2受体但具有功能障碍的HER2相关通路活性的患者子组，其与够资格进行基于当前的IHC或FISH诊断的HER2靶向疗法的患者的通路活性至少一样功能障碍。这是一个意想不到的且临床上重要的结果。

HER2驱动的癌症：HER2驱动的乳腺癌当前被诊断为仅在乳腺上皮细胞上具有过表达或扩增HER2受体(通过IHC或FISH)的患者中发生。

已知当前没有可以鉴定其癌细胞具有非过表达或未扩增的HER2受体水平但具有HER2驱动的癌症的患者的方法。本发明的此实例证明本文所述的方法提供了有效的检验来鉴定HER2受体水平是非过表达或未扩增且具有HER2驱动的癌症的患者。

HER2受体是ErbB受体家族(HER1、HER2、HER3和-HER4)的普遍存在的成员，因为它可以与家族的任何其他成员配对。ErbB受体家族的成员成对或二聚以实现其细胞信号传导功能。ErbB受体家族的成员可以与自身配对为同型二聚体(例如HER2-HER2)或异源二聚体，即混合家族成员配对(例如HER1-HER2或HER2-HER3)。HER2可以有效地提供受体酪氨酸激酶活性，这是通过与此家族受体配对在此通路中启动信号传导的关键组分。HER2受体普遍存在的性质可以使细胞群体内的功能活性难以量化。当HER2与ErbB家族的不同成员配对时，可以产生不同的通路信号。认为HER2驱动的癌症主要通过与HER1受体配对的HER2受体并通过与HER3受体配对的HER2发生。HER2受体没有已知的直接干扰配体，并且因此不知道发生HER2-HER2配对干扰。通过添加表皮生长因子(EGF)可以在活细胞上干扰HER1-HER2受体配对。通过添加神经调节蛋白1(NRG1)可以在活细胞上干扰HER2-HER3受体配对。如此实例所示，本发明的一个实施例采用两种干扰剂来确定HER2受体对通路信号传导活性的特定贡献，而与HER2受体所配对的ErbB家族成员无关。干扰剂是特异于ErbB通路受体的药剂，并且确认剂是特异于破坏干扰剂功能中HER2受体的作用的药剂。

分析物和被测变量：本文使用的诊断检验的分析物是当置于阻抗生物传感器微孔板的孔中并连续测量电阻抗时，单独或存在特定细胞信号传导通路干扰剂的情况下，患者活细胞产生的细胞附着信号(CAS)。对于每个检验，CAS是连续测量的并在被测变量算法中用于来自相同患者的多达四部分的患者细胞样品。

1.仅患者细胞(C)

2.患者细胞+干扰通路因子1(CF1)

3.患者细胞+干扰通路因子2(CF2)(如有必要)

4.患者细胞+干扰通路因子+确认剂(CCF)

对于检验的多达四部分的患者细胞样品(C、CF1、CF2、CCF)中的每一个进行CAS量化。为了量化患者病变细胞的信号传导通路活性，将在CF1和/或CF2部分中测量的CAS与在C部分中测量的CAS进行比较。这使得能够确定CF和C样品部分之间的CAS变化，相对于CCF和CF样品部分之间的CAS变化，以确认CF和C之间的变化有多少与感兴趣的信号传导通路相关。

此实例中使用的确认剂(抗体药物)具有如下作用机理，借此HER2受体的二聚臂从与其他HER2受体、HER1受体、HER3受体或HER4受体的配对中被空间阻断。在使用此确认剂时，CF1和/或CF2和C的CAS之间的差异可以正确地分配给HER2参与。当此确认剂在干扰剂之前施用于细胞样品时，干扰剂从HER2受体相关活性上被阻断，从而产生低于CF1和/CF2CAS值的针对CCF的CAS值，通过与相对于C的CF1和/或CF2变化中的HER2受体参与成比例的量。

可以使用不同的确认剂，例如小分子。这些具有如下的作用机制，借此它们结合于ErbB家族中的受体酪氨酸激酶的ATP结合位点。这些确认剂空间阻断HER2受体、HER1受体、HER3受体或HER4受体的启动信号传导酶功能。这些小分子确认剂使干扰剂信号能够正确地分配给受体酪氨酸激酶参与，由于加入干扰剂后的CAS信号变化。当这些确认剂在干扰剂之前单独施用于细胞样品时，干扰剂从受体相关酶活性上被阻断，从而产生低于CF1和/或CF2CAS值的CCF CAS值，通过与受体酶功能的参与成比例的量。

用于从时间与CAS检验数据衍生的非线性欧几里德时间点向量计算被测变量的方程式：

其中变量被如下定义：

i＝在检验期间每分钟记录的CAS步数

F1＝NRG1干扰因子

F2＝EGF干扰因子

C_i＝对照，无干扰因子加入检验细胞中

CF1_i＝具有干扰因子(F1)的细胞

CF2_i＝具有干扰因子(F2)的细胞

CCF1_i＝具有F1和HER2通路的确认(C)剂的细胞

CCF2_i＝具有F2和HER2通路的确认(C)剂的细胞

注意，在上面所示的完整算法中加法运算符(+)的任一侧找到用于计算个体干扰因子贡献的被测变量的算法。

试剂和缓冲液：购买并使用从VWR(拉德纳，宾夕法尼亚州)或生命科技公司(格兰德岛，纽约)交付的不含血清含抗生素(例如青霉素、链霉素、两性霉素)和HEPES缓冲液的基于DMEM/F12的的标准培养基。另外的生长因子/干扰剂(人EGF>

细胞样品：利用来自商业来源的标准长寿命乳腺癌上皮细胞系(例如DSMZ，Leibniz-Institut>

细胞样品列表

·三十五(35)名HER2阴性患者

·六(6)名无疾病的健康患者

·十(10)个过表达的HER2阳性细胞系

·九(9)个非过表达的HER2阴性细胞系

在干冰上接收商业来源的细胞系并根据商业提供者的推荐进行培养。根据标准的人上皮细胞处理程序，直接从其被培养的医院接收活的原发性患者材料，典型在不含血清含抗生素的缓冲乳腺上皮生长培养基的塑料细胞实时培养烧瓶中，在37℃，5％CO₂，85％湿度下。在添加到阻抗微孔板之前，将细胞从其含胰蛋白酶/EDTA溶液的生长容器中除去，计数并重新悬浮于含抗生素不含血清或其他生长因子的培养基中。

程序：使用的检验程序(下文称为CELx)包含以下步骤：全部在5％CO₂，85％湿度，37℃下进行：

1.细胞接种：将含有如下的180μL等分试样分布到阻抗微孔板的每个指定孔(C、CCF、CF1、CF2)：来自含抗生素不含血清或其他生长因子的乳腺上皮生长培养基中的每个患者或细胞系的15,000个活上皮细胞。在如下描述的步骤2-4中连续测量阻抗。

2.接种后6小时将确认剂(20uL)加入到每个细胞样品的预先指定的CCF孔中。没有接受确认剂的孔接受培养基作为对照。

3.针对每个样品在接种到预先指定的CF孔后18小时，加入干扰因子(20uL)。没有接受干扰因子的孔接受培养基作为对照。

4.针对每个患者，对每个检验孔进行连续阻抗记录，典型在加入干扰剂后持续至少15小时。

结果和图说明：

由阻抗CReMS收集的数据在每个图中以X轴上的分钟时间和Y轴上的细胞指数表示。细胞指数表示在检验期间，针对在检验期间添加的不同药剂，不同细胞的生理变化。

使用荧光活化细胞分选(FACS)来确定用于此实例的不同患者细胞的受体水平。将患者活细胞用针对结合到HER2受体的细胞外部分的荧光抗体进行标记。图12显示了在此实例中检验的不同患者材料的HER2受体水平的FACS数据。此FACS数据证实，已经针对此实例检验的不同类别的细胞具有不同水平的HER2受体。数据指示，未表达的HER2癌症患者具有与健康患者和未表达的HER2细胞系相似的HER2受体蛋白水平，并且这些水平远低于过表达的HER2细胞系的受体水平。

图13显示针对活细胞与较没活力的(不可检验细胞)细胞附着CAS。本发明旨在实时连续地仅检验活细胞。每个检验确保仅检验活细胞。

图14显示了在针对一个癌症患者(R112)的CELx检验期间收集的数据。显示了EGF和NRG干扰因子的情况下的癌症患者R112实例时程(X轴)与阻抗(Y轴)。图中还显示了每个干扰因子加法与HER2参与确认因子添加。

下表16可以看出，针对患者R112对于C、CF对于NRG、CF对于EGF和CCF对于每个干扰因子计算的被测变量的表格。

表16

注意：C＝仅添加培养基的对照样品，CF＝仅添加干扰因子的样品，CCF＝确认因子+干扰因子添加样品。(CF-C)是干扰剂引发的信号的总量。配体被测变量为～(CF-C)-(CCF-C)。通过((CF-C)-(CCF-C))/(CF-C))*100计算％HER2参与。其中CF和CCF的值通过上面提供的非线性向量算法的求和来计算。

这些结果指示，用受体配体且没有添加确认因子对完整通路的干扰产生了此非过表达HER2患者(CF-C)的最高细胞指数。对两种不同的受体干扰剂样品添加确认因子证明，HER2-HER3受体连接通路信号传导或HER2-HER4受体连接通路信号传导的NRG1干扰为90％，而HER1-HER2受体连接通路信号干扰具有针对这个患者的显著更低的HER2受体参与。每个患者在两个干扰中的每一个中具有不同水平的HER2参与，进一步证明了在每个患者中HER2驱动的通路信号传导的两个方面的个体化检验的重要性。

图15A-D表示了一个过表达HER2细胞系(SKBr3；图15A)、具有HER2驱动疾病的一个非过表达HER2患者(R39；图15B)、不具有HER2驱动疾病的一个非过表达HER2患者(R49；图15C)和一个健康患者(R62；图15D)的NRG1干扰数据比较的条形图被测变量。过表达的HER2细胞系(图15A，SKBR3)和非过表达的HER2患者样品(图15B，R39)显示出可比较的NRG1驱动活性。HER2二聚体阻断剂(培妥珠单抗)确认剂抑制结果证实，测量的PI3K活性的大部分涉及这些患者的HER2受体。注意，非过表达的HER2患者样品(R39)中，培妥珠单抗抑制量较大。无HER2驱动疾病的非过表达HER2癌症患者样品(图15C，R49)的通路信号传导活性的NRG1干扰代表在此实例中检验的非过表达HER2患者样品的80％，并可与代表性的健康患者样品(图15D，R62)比较。注意，针对肿瘤(图15D；R49)和健康(图15D，R62)样品测量的NRG1活性水平小于左侧针对SKBR3和R39样品测量的活性的25％。

进行了一项研究，以检验如下零假设，使用CELx检验，非过表达HER2癌症患者与健康非病变患者在统计学上是不可分离的。图16表示了定义此实例中检验的不同患者群的四分位数的晶须图(whisker-box plot)。CELx检验测量NRG1干扰对HER2/HER3受体的通路信号传导应答。细胞系和原代样品结果是一致的。数据显示，非过表达HER2患者存在异常的HER2通路。过表达HER2细胞系的HER2通路信号传导的NRG1干扰和非过表达HER2患者的前20位百分位数与具有较低CAS的健康人群是与众不同的。

约20％的非过表达的HER2癌症患者具有与过表达HER2患者(虚线以上)的前50位百分位数一致的HER2通路信号传导活性的NRG1干扰。这些结果表明，为了区分健康和非过表达的HER2群体，无效假设被拒绝，并证实了过表达的HER2组活性与非过表达的HER2组信号传导通路活性之间的重叠。

图17显示HER2/HER1受体二聚体的CELx EGF干扰通路信号传导活性的数据。这是因为已知HER2/HER1参与HER2驱动的疾病而提供。数据显示，EGF干扰的通路信号传导活性在过表达的HER2和非过表达的HER2样品中是相似的。数据显示在NRG1干扰通路信号传导活性中发现的前四分位的非过表达HER2和过表达的HER2样品的CELx EGF干扰通路信号传导活性的相似升高。数据还显示，与健康人群相比，非过表达的HER2CELx EGF干扰通路信号传导活性升高。

下表17表示具有HER2驱动疾病的非过表达HER2癌症患者的代表性NRG1确认剂数据，其中针对根据CELx试验确定为具有HER2驱动疾病的5名患者，确认剂是治疗药物。

表17：代表性的CELx NRG1抑制数据*

*％NRG1信号衰减

表17中的数据显示HER2通路信号传导治疗抑制剂应答。每种抑制剂以临床相关的单一浓度使用以证明每位患者的药物应答。共价受体酪氨酸激酶抑制剂药物(RTKi)来那替尼和阿法替尼对这些患者产生NRG1和EGF驱动活性(仅显示NRG1数据)的最高百分比衰减。非共价RTKi、拉帕替尼和单克隆抗体(培妥珠单抗)产生了通路信号的显著衰减，但低于共价RTKi的。意外的是，相比过表达HER2细胞系，HER2药物在非过表达HER2患者中抑制高百分比的HER2驱动通路信号传导活性。

实例7结果的讨论

此实例中描述的结果说明了本文所述的发明和方法的关键方面，并提供意想不到的结果。证实非过表达的HER2癌细胞样品的HER2受体水平与健康乳腺细胞中的一样低，并且显著低于过表达的HER2癌症患者的HER2受体水平。因此，在非过表达的HER2癌细胞中测量的通路信号传导活性不能归因于这些受试者组之间HER2受体水平的差异。此实例还证实该方法能够分离和定量特异性HER2/HER3和HER2/HER1通路活性。此外，该实例证实了在非过表达的HER2癌症患者中存在异常HER2信号传导活性的假设，并且非过表达HER2癌症患者的子组(15％)具有与过表达的HER2癌症患者相似的HER2通路信号传导活性。这个意想不到的结果证明了这些方法的值。另一个意想不到的结果是HER2靶向药物抑制非过表达的HER2癌症患者中更高百分比的HER2信号传导通路活性的能力，相比过表达的HER2癌症患者。总体上，此实例中描述的结果证实，该方法可以鉴定、诊断和治疗具有活性HER2信号传导网络的非过表达HER2患者。这是一个重要的结果，因为该实例表明，约15％的所有非过表达的HER2乳腺癌患者都有未经诊断和未经治疗的HER2驱动乳腺癌。本发明允许鉴定此患者群体，使得可以选择他们用靶向ErbB信号传导通路的治疗剂进行治疗。

实例8

新鲜基础培养基对测量信号传导通路活性的影响

许多细胞筛选测定规定了简化的培养基缓冲液，在被检验的短时间之前和期间放置细胞。具有活的原代患者细胞的本发明是用用于维持活的原代细胞样品的基础培养基进行，使得在连续测量的完整检验时间内细胞群体维持活力并维持其各细胞类型的异质性和代表细胞周期不同阶段的细胞正态分布。基础培养基不含已知干扰感兴趣的信号传导通路的试剂。该方法的另一方面包括在与开始干扰剂或确认剂接触的72小时内用新鲜的基础培养基代替基础培养基。

图18显示了证明使用不新鲜的基础培养基对细胞样品的MAPK信号传导通路活性的影响的数据。当细胞样品C54在不新鲜的基础培养基中培养(干扰之前)之后用EGF干扰时，CAS小于当C54未用EGF干扰时的。实际上，没有测量信号传导通路活性。这与在将细胞样品C54在与EGF接触之前在新鲜的基础培养基中培养时测量的CAS显著形成对比。在新鲜的基础培养基实例中，测量的CAS表明C54样品中存在显著的MAPK信号传导通路活性。数据突出了在细胞样品与干扰剂或确认剂接触之前，在新鲜的基础培养基中培养细胞的重要性。