一种臂丛根性损伤闭合动物模型装置及臂丛根性损伤检测方法

技术领域

本发明属于动物模型制备技术领域，尤其涉及一种臂丛根性损伤闭合动物模型装置及臂丛根性损伤检测方法。

背景技术

目前，常用的臂丛根性损伤动物模型均为开放制作，即分别通过背侧和腹侧入路暴露臂丛神经根，然后用显微器械将其逐一向外拔出，所撕脱的神经根连同神经干一起剪除。然而，两种方法均采用了手术切开的方式，损伤较大，从而会影响对实验动物进行准确的功能学及神经形态学评价；其次，模型制作过程中牵拉神经根力量的大小和作用时间难以定量，很难达到标准化。除此之外，开放手术造模不能模拟人类臂丛根性损伤的受伤机制，一种快速、高能量暴力导致的颈-肩分离。Narakas在一项超过1000例臂丛损伤患者的调查中发现70％的创伤性臂丛损伤是由机动车车祸引起的，除此之外还有牵拉伤及压砸伤。总体来说，人类臂丛根性损伤的受伤机制主要是头部固定撞击肩部，或肩部固定撞击头部而造成头颈之间的颈部筋膜、斜方肌、臂丛神经椎间孔韧带结构的分离，最后脑脊膜的抗张强度也被超越，则臂丛根丝失去保护，从而导致椎间孔神经根损伤。

为了模拟人类臂丛根性损伤的受伤机制，Spinner等设计了一种模型制作装置，通过对实验大鼠前肢被动牵拉的方法制作臂丛根性撕脱伤模型，研究发现撕脱神经根的数量与牵拉力的大小显著相关，而与实验动物的体重无明显相关。然而，在此方法中只有一个方向的牵拉力可以传递至实验大鼠的前肢，即肩关节外展90°，这也导致了该模型制作装置不能模拟临床特定的神经根损伤类型。另外，证明一个动物模型是否符合实验研究的要求，全面而详细的功能及组织学评估是必要的，而该研究并没有对此模型进行有效的评估，故很难将其作为动物模型应用于臂丛根性损伤的实验研究。

因此，建立可靠、准确的模拟人类臂丛根性损伤受伤机制的动物模型，并在此模型基础上进行臂丛根性损伤修复及重建的实验研究极为必要，而现有技术中尚无此种技术的公开报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种臂丛根性损伤闭合动物模型装置及臂丛根性损伤检测方法，旨在建立模拟臂丛根性损伤受伤机制、符合临床神经根损伤病理特点的动物模型。

本发明是这样实现的，一种臂丛根性损伤闭合动物模型装置，包括固定座、用于放置所述动物躯干的容器、用于放置所述动物肘关节的可移动的容器附属器及对所述动物肘关节施加不同大小、不同方向作用力的施力装置；所述容器固定在所述固定座上所述容器上具有孔洞，所述容器附属器具有供所述动物肘关节伸入的入口。

具体地，所述施力装置包括多个不同重量的配重块、滑轮及绳索，所述滑轮能上、下活动地安装在所述平面板上，并且位于所述容器的侧边位置；所述绳索的绕置于所述滑轮上，其一端伸入所述容器附属器并与所述动物的肘关节连接，另一端与某一重量的所述配重块连接。

具体地，所述施力装置还包括导杆以及螺丝，多个不同重量的配重块上分别开设有螺纹孔，所述导杆的上端与所述绳索连接，其下端通过所述螺丝与某一重量的所述配重块连接。

具体地，所述固定座为一竖向放置的平面板。

具体地，所述配重块为砝码。

具体地，容器附属器为一两端具有开口的中空套筒。

本发明还提供了一种臂丛根性损伤检测方法，采用上述所述的臂丛根性损伤闭合动物模型装置进行检测，所述臂丛根性损伤检测方法包括以下步骤：

将实验动物置于容器中，并将其前肢从所述孔道内伸出，将所述实验动物的肘关节置于容器附属器中，并通过钢丝及滑轮与导杆连接；

固定所述实验动物前肢的外展角度，利用滑轮及砝码对实验动物的前肢进行牵拉；

对损伤后的实验动物立即进行臂丛的解剖观察、功能学评估、脊髓取材及组织学评估；

更换新的实验动物，仅改变所述外展角度，对实验动物进行相同操作。

具体地，所述解剖观察包括：

采用前、后入路分别对臂丛的椎管内外结构进行探查，并记录臂丛神经根的损伤特点及其对应牵拉力的大小及方向。

具体地，所述功能学评估包括：

利用Grooming Test检查实验动物的前肢肩关节外展及肘关节屈曲功能和利用Grasping Test用于评估实验动物正中神经损伤后神经再生的功能，均从实验后l周开始每周观察一次持续到12周；利用Footprint test检查实验动物行走时步态的异常，损伤后3周进行观察。

具体地，所述脊髓取材及组织学评估包括：

在不同时间点灌注实验动物取脊髓，进行Nissl染色，染色后在200倍显微镜下计数脊髓前角运动神经元，记录存活运动神经元百分比；所述存活运动神经元百分比为损伤侧阳性的运动神经元与正常侧阳性运动神经元数目的比值。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明实施例提供的臂丛根性损伤闭合动物模型装置，改良以往的动物实验造模方式，通过将实验动物躯干置于容器中、前肢置于容器附属器中，利用施力装置对实验动物的肘关节施加力作用。通过所述臂丛根性损伤闭合动物模型装置，可以很好地控制影响神经再生和功能恢复的因素，并对这些影响因素分别进行研究。

本发明实施例提供的新的模拟臂丛根性撕脱的闭合动物实验造模装置，前期结果表明可有效制作的神经根性撕脱模型，为临床上臂丛根性撕脱的研究提供新的动物模型。

附图说明

图1为本发明实施例提供的臂丛根性损伤闭合动物模型装置示意图；

图2为本发明实施例1提供的实验大鼠牵拉伤后臂丛神经根损伤的解剖图片；

图3为本发明实施例1提供的实验大鼠的Grooming Test(美容测试)评估结果示意图；

图4为本发明实施例1提供的实验大鼠的Grasping Test评估结果示意图；

图5为本发明实施例1提供的实验大鼠的Footprint Test(足迹测试)评估结果示意图；

图6为本发明实施例1提供的实验大鼠的脊髓组织学评估结果示意图，其中图6a是实验组牵拉伤后1天、7天和28天脊髓(C5、6)横切面的Nissl染色示意图；图6b是不同时间点存活运动神经元百分比柱状示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

参见图1，本发明第一实施例提供了一种臂丛根性损伤闭合动物模型装置100，包括固定座1、用于放置所述动物躯干的容器2、用于放置所述动物肘关节的可移动的容器附属器3及对所述动物肘关节施加不同大小、不同方向作用力的施力装置5；容器2固定在固定座1上，容器2上具有孔洞4，容器附属器3具有供所述动物肘关节伸入的入口(图中未示出)。

本发明第一实施例提供的臂丛根性损伤闭合动物模型装置100，改良以往的动物实验造模方式，通过将实验动物躯干置于容器2中、前肢置于容器附属器3中，利用施力装置5对实验动物的肘关节施加力作用。通过所述臂丛根性损伤闭合动物模型装置，可以很好地控制影响神经再生和功能恢复的因素，并对这些影响因素分别进行研究。

本发明第一实施例提供的新的模拟臂丛根性撕脱的闭合动物实验造模装置，前期结果表明可有效制作的神经根性撕脱模型，为临床上臂丛根性撕脱的研究提供新的动物模型。

具体地，施力装置5包括多个不同重量的配重块8、滑轮6及绳索7，滑轮6能上、下活动地安装在固定座1上，并且位于容器2的侧边位置；绳索7的绕置于滑轮6上，其一端伸入容器附属器3并与所述动物的肘关节连接，另一端与某一重量的配重块8连接。

具体地，施力装置5还包括导杆9以及螺丝10，多个不同重量的配重块8上分别开设有螺纹孔(图中未示出)，导杆9的上端与绳索7连接，其下端通过所述螺丝与某一重量的配重块8连接。其中，配重块8可在导杆9上移动。

具体地，固定座1为一竖向放置的平面板。

具体地，配重块8为砝码。

具体地，容器2为圆筒，容器附属器3为一两端具有开口的中空套筒。

本发明第二实施例提供了一种臂丛根性损伤检测方法，采用上述所述的臂丛根性损伤闭合动物模型装置100进行检测，所述臂丛根性损伤检测方法包括以下步骤：

将实验动物置于容器2中，并将其前肢从所述孔道内伸出，将所述实验动物的肘关节置于容器附属器3中，并通过钢丝及滑轮与导杆连接；

固定所述实验动物前肢的外展角度，利用滑轮及砝码对实验动物的前肢进行牵拉；

对损伤后的实验动物立即进行臂丛的解剖观察、功能学评估、脊髓取材及组织学评估；

更换新的实验动物，仅改变所述外展角度，对实验动物进行相同操作。

本发明第二实施例提供的臂丛根性损伤检测方法中，所用的实验动物造模装置就是建立臂丛根性损伤模型最关键和最基础的一步。通过该动物模型，可以使用客观的方法评价损伤的早期阶段及神经再生的过程，并可以在此基础上进行细胞和分子水平的研究，这在临床研究中是很难做到的。

具体地，所述解剖观察包括：

采用前、后入路分别对臂丛的椎管内外结构进行探查，并记录臂丛神经根的损伤特点及其对应牵拉力的大小及方向。

具体地，所述功能学评估包括：

利用Grooming Test检查实验动物的前肢肩关节外展及肘关节屈曲功能和利用Grasping Test用于评估实验动物正中神经损伤后神经再生的功能，均从实验后l周开始每周观察一次持续到12周，利用Footprint test检查实验动物行走时步态的异常，损伤后3周进行观察。

具体地，所述脊髓取材及组织学评估包括：

在不同时间点灌注实验动物取脊髓，进行Nissl染色(尼氏染色)，染色后在200倍显微镜下计数脊髓前角运动神经元，记录存活运动神经元百分比；所述存活运动神经元百分比为损伤侧阳性的运动神经元与正常侧阳性运动神经元数目的比值。

以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

制作动物造模装置并对实验模型进行评估，包括以下步骤：

第一步：模型制作装置

目的：模拟临床上臂丛根性损伤机制，进行动物造模。

模拟人类臂丛根性损伤受伤机制设计动物模型制作装置，将直径为5cm的圆筒固定在50cm×100cm的钢板上，可将实验大鼠置于其中。圆筒外侧做一直径为2cm的圆孔可将实验大鼠的前肢伸出，肘关节置于尺寸匹配的套筒中并通过钢丝及滑轮与导杆连接。钢丝及导杆通过一个可拆卸的螺丝相连以便放入不同重量的砝码。滑轮系统可以上下移动改变牵拉力的方向。

第二步：进行动物实验验证

根据前肢外展角度的不同(30°，90°，150°)分为3组，每组36只，利用滑轮系统对实验大鼠前肢使用不同重量的砝码(0.5，1，2kg)进行牵拉；对照组12只，仅将实验大鼠置于圆筒中1min，不对前肢进行牵拉。

其中，表1为测试重量及方向与神经根损伤的类型。其中，A：神经根撕脱；R：神经根断裂；—：无明显神经根撕脱及断裂。

第三步：大体解剖观察

目的：验证装置造模后实验动物的功能状态，以此验证动物模型的有效性。

对实验中的所有实验大鼠在损伤后立即行臂丛的解剖观察，采用前、后入路分别对臂丛的椎管内外结构进行仔细探查，并记录臂丛神经根的损伤特点及其对应牵拉力的大小(测试重量)及方向。

图2为实验大鼠牵拉伤后臂丛神经根损伤的病理特点，其中，(A)为大鼠正常臂丛结构；(B)中神经根从椎孔内撕脱至椎孔外，蜷曲在锁骨下；(C)中C8、T1神经根撕脱，可见撕脱的脊神经节及前后根丝；(D)中C6～8神经根撕脱，C6、7神经根可见神经节及根丝；(E)中椎管内见C7神经根撕脱，C8神经根看似连续，而打开外层根袖后发现内部为凝血块，无神经组织(箭头示)；(F)中C7、8神经根节前撕脱。

第四步：功能学评估

Grooming Test：用于检查实验大鼠前肢肩关节外展及肘关节屈曲功能，从实验后第1周开始每周观察一次持续到12周。用1-3mL生理盐水淋湿大鼠鼻部，在5min内观察实验大鼠的理毛行为，正常大鼠的双前肢会同时举起至耳后，然后向口鼻部进行重复性梳理动作以去除头面部的水。使用数码录像机将整个过程记录，并放慢播放速度对患肢功能进行评分。图3为Grooming Test评估情况，验证接受牵拉伤处理后大鼠的肩肘功能状态。从图3中可以看出，对照组实验大鼠可以正常举起双侧前肢并能达到耳后方区域。而接受牵拉伤处理的实验大鼠(上臂丛损伤)几乎不能或很难抬起损伤侧前肢，特别是肩外展功能几乎完全丧失。与对照组相比，实验组大鼠的Terzis评分从第一周开始显著降低(P<0.05)，并且在观察周期内都没有明显的恢复(P<0.05)。所以，实验组大鼠在接受牵拉伤处理后存在长期的肩肘功能障碍。

Grasping Test：用于评估实验大鼠正中神经损伤后神经再生的功能，从实验后l周开始每周观察一次持续到12周。轻轻提起鼠尾，让其前爪去抓网格板(50cm×40cm×10cm)，网格孔大小为(1.5cm×l.5cm)，底部连接于电子秤，记录牵拉鼠尾患肢前爪松开网格时的最大拉力。每只大鼠测试3次，记录最大值。图4为Grasping Test评估情况，验证大鼠在牵拉伤后腕关节及前爪的主动屈曲活动状态。从图4中可以看出，实验组大鼠在牵拉伤后2d内无明显腕关节及前爪的主动屈曲活动，然而在3d后其活动明显增加。出现此现象的原因我们认为可能是牵拉伤造成患肢剧烈疼痛，从而影响了实验大鼠腕关节及前爪的主动屈曲活动。实验组大鼠患肢的抓握力较对照组轻度减弱，但两者之间差异没有统计学意义(P>0.05)。所以，实验组大鼠在接受牵拉伤处理后不存在患侧腕关节及前爪的功能障碍。

Footprint test：用于检查实验大鼠行走时步态的异常，损伤后3周进行观察。损伤后3周在实验大鼠的前肢和后肢分别涂上红色和蓝色的染料，然后把实验大鼠放进一个长50cm，宽10cm的密闭的盒子里让其行走，每走一次更换一张记录纸，观察对比足印的变化。

图5为Footprint Test评估结果图片，验证大鼠前肢牵拉伤后的步态情况。从图5中可以看出，实验组大鼠前肢牵拉伤后3周，步态明显异常，患侧前肢存在明显的拖拽现象(箭头所示)，而对照组实验大鼠步态正常。

第五步：脊髓取材及组织学评估

目的：验证动物臂丛根性损伤后脊髓神经元存活情况，进一步验证模型有效性。

在不同时间点灌注大鼠取脊髓，进行Nissl染色，染色后在200倍显微镜下计数脊髓前角运动神经元，以胞体清晰，尼氏体染成蓝色并可见胞核为计数标准，存活运动神经元百分比为损伤侧阳性的运动神经元与正常侧阳性运动神经元数目的比值。

具体过程如下：按不同时间点(1、2、3、7、14、28d)每组随机选取实验大鼠5只，4％多聚甲醛固定液灌注，切开实验大鼠背部皮肤，分离肌肉，打开椎板，显露脊髓，分别切取C5-7及C8，T1节段脊髓，进行脊髓Nissl染色。

图6为脊髓组织学评估结果，验证大鼠前肢牵拉伤后脊髓前角存活神经元的存活情况。从图6a中可以看出，实验组大鼠牵拉伤侧C5～7节段脊髓前角存活神经元明显减少，存活神经元百分比在损伤后1、2、3、7、14和28d分别为91.29±2.81％，89.31±3.47％，88.67±2.63％，77.80±3.38％，67.10±3.73％和43.92±5.85％(如图6b所示)。对照组损伤侧存活神经元百分比在各时间点均显著高于实验组(P<0.05)，在损伤后1、2、3、7、14和28d分别为98.49±1.69％,97.23±3.21％,103.00±4.97％，97.47±3.81％，101.81±4.90％和104.02±5.33％(如图6b所示)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。