针对生物药物组合物的生物学活性评价方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生物学活性评价方法，具体是指一种针对生物药物组合物的生物学活性评价方法。

背景技术

随着生物技术水平的不断提高，包括基因克隆技术、细胞培养与纯化技术、生物分析技术等持续高速发展，生物大分子药物研发逐步取代化药小分子药物而成为制药领域的研究热点。2015年全球销售排名前十的药物中有8个是生物药，研发处于临床到上市阶段的生物药有超过4500个，可谓市场强劲，研发火爆。在国内，生物制药被列为国家医药工业“十三五”发展规划的重点突破领域。而“生物产业倍增和健康中国行动计划”则被纳入国家十三五规划纲要。

生物技术药物主要包括生化提取类药物如人来源的血液制品如凝血因子、白蛋白等，和基因工程类药物包括疫苗、单克隆抗体、融合蛋白、多肽类药物等。其中单克隆抗体类药物以其安全性和有效性以及在抗肿瘤、自身免疫疾病领域的巨大成功和潜力，在生物技术药物的大的发展浪潮中独领风骚。2015年全球药物销售前十的8个生物技术药物中有6个是单克隆抗体药物，并且常年位居全球药物销售冠军的是雅培的阿达木单抗。

传统化药小分子类药物具有较好的抗肿瘤细胞作用，但其选择性较差，毒副作用较大，对患者体内正常细胞也有杀伤，极大限制了化药小分子类药物的应用和发展。生物药物特别是单克隆抗体类药物的1个突出显著特点和优势在于靶向性，以针对乳腺癌细胞表面HER2受体的赫赛汀单抗为例，该药在体内能够特异性作用于肿瘤细胞表面HER2受体而将肿瘤细胞杀死或抑制肿瘤细胞生长，达到治疗乳腺癌患者的目的。然而生物药物的应用也有其局限性，同样以赫赛汀为例，并非所有乳腺癌患者的乳腺癌肿瘤细胞表面都高表达HER2受体蛋白或者说表达的HER2受体蛋白都与赫赛汀表现出较好的亲和力。临床研究表明事实上仅有约30％-40％的乳腺癌患者接受赫赛汀单抗治疗能够表现良好的治疗效果，而其中的大部分患者在继续接受赫赛汀治疗时的治疗效果会逐步减弱。类似的案例有很多包括目前研发市场火热的免疫检查点PD1、PDL1、CTLA4单抗药物等，仅依靠单一作用靶点的单抗药物无法满足日益复杂的临床需要。目前大部分的生物药物特别是抗肿瘤的单克隆抗体药物还并未进入治疗用一线用药行列，而是作为化药小分子药物以及放射性疗法的补充，来改善癌症患者的生活质量。

在这样的大背景下，为了克服生物药物单一靶点作用局限性的问题，生物技术药物的研究呈现许多新的方向，包括抗体偶联小分子药物ADC类药物，以Amgen 2013年获批的Kadcyla(T-DM1)为代表；双特异性抗体Bispecific monoclonal antibody类药物，以Amgen2014年获批的Blinatumomab(BiTE)为代表；以及多个生物药物联合用药(Combination Cocktail)或生物药物与小分子药物联合用药，如针对乳腺癌患者HER2靶点的2个单克隆抗体药物Trastuzumab和Pertuzumab联合用药，针对非霍奇金淋巴瘤的2个单克隆抗体药物epratuzumab和rituximab联合用药等，大量的针对不同靶点的生物药物的联合用药的临床实验在各个大的临床研究中心积极开展中。国内生物技术药物的发展较国外虽然起步较晚，但发展势头迅猛，紧跟国际步伐，从传统靶点的生物类似药研发开始，到新的免疫检查点靶点的创新生物药，再到抗体偶联小分子药物ADC、双特异性抗体、生物药物组合物等，有数十个研发项目处于临床前或临床研究的不同阶段，涉及的生物制药企业超过百家，近些年国内生物药物IND申报数量也逐年提升达到近百件IND申报/年。2016年，上海医药基于国际上治疗乳腺癌患者采用2个单克隆抗体药物Trastuzumab和Pertuzumab联合用药的研究思路，开创性的将这2个抗体分子按照1:1质量比例混合形成抗体组合物，得到一种新型组合药物，用于治疗乳腺癌。Trastuzumab(T组分)和Pertuzumab(P组分)这2个单抗分子均靶向乳腺癌细胞表面生长因子受体HER2，作用于HER2胞外区的不同表位，抑制肿瘤细胞生长，具有协同作用。临床前药理研究结果也表明该新型抗体组合药物具有优于T组分或P组分单独给药的药效。该新型组合药物相对传统单抗药物进步明显，具有更广泛的应用前景。此外，针对VEGF单抗、PCSK9单抗、阿达木单抗、自噬调节类药物的生物药物组合物等的研究也屡见报端，该类药物将多个不同作用机制、不同作用靶点药物组合而发挥各自的功效，克服前述单靶点生物药物的作用靶点单一的缺陷，达到更好治疗效果。

生物技术药物研究方向的拓展和进步势必促发生物药物质量研究手段的不断变革，生物技术药物的最终产品上市离不开质量研究的保障。即使单个生物药物组分的质量研究手段已经健全，也不能保证多个生物药物形成组合物后，之前的传统成熟手段还适用。以2种单克隆抗体药物组合而成的生物药物组合物为例，质量研究重点关注产品纯度、活性和杂质含量。其中杂质含量检测与常规单抗药物基本一致；产品纯度检测则需要对组合物单抗的2个核心组分进行区分，在纯度分析方法开发过程中不止需考虑杂质峰的分离度，也需要考虑2个核心组分的分离效果，开发难度高于常规单抗药物；而针对该抗体组合物的活性评价则是最困难的：首先，2个核心单抗组分的靶点不同，生物学评价手段也很可能不同，2者作为传统单抗药物都有各自的生物活性评价方法，在利用各自的生物活性方法检测单抗组合物时可能出现协同作用，也可能相互阻碍使得检测结果难以评价；其次，2者的蛋白浓度需要分别检测确认，不能简单用2者混合之后的蛋白浓度作为组合物的生物活性评价基准，因为二者的作用机理可能不同；更进一步在稳定性研究中，希望通过该组合物的生物学活性检测能够区分判断组合物的各个组分是否出现活性下降。所以简而言之，针对生物药物组合物的生物活性方法开发难点在于如何建立和使用一种生物活性方法能够评价生物药物组合物作为整体新型药物的生物学活性，同时利用该生物活性方法还能够表征和追踪生物药物组合物各个单一活性组分的生物活性的变化。

进行由多个针对不同靶点表位生物药物组合而得的生物药物组合物的生物学活性方法开发，特别是体外细胞生物活性方法的开发，需要克服上述针对生物药物组合物生物学活性检测的难题。针对不同单一活性组分可能存在各自的活性检测手段的问题，尽量寻找基于与各个活性组分都相关的作用机理为基础建立细胞活性方法，这样能够实现将生物药物组合物视为一个整体用一种生物活性方法进行评价，该生物活性方法能够用于评价生物药物组合物中的各个单一组分的生物学活性；针对不同单一活性蛋白组分的蛋白定量，传统方法基于HPLC色谱方法难以实现对不同蛋白组分的充分分离而对蛋白精准定量，本发明采用ELISA夹心法定量的方法实现对生物药物组合物的各个单一组分进行精确定量；针对生物药物组合物各个单一组分的活性变化情况的追踪，采用数据采集的方式，将不同单一活性蛋白组分按照各种比例进行混合，并用针对整体的生物活性方法进行检测，由于该生物活性方法能够用于评价各个单一组分，因此在计算和记录不同比例生物药物组合物的生物学活性时，分别以某单一组分为基准记录当其他组分的比例发生变化时的检测结果的变化(包括活性检测值，活性检测4-或5-参数曲线拟合的EC₅₀值等)。根据该变化能够汇总得到假设某单一组分不变而其他组分变化时的活性检测情况，通过该汇总能够在实际应用中利用该针对整体的生物活性检测结果而判断稳定性研究或其他条件下该生物药物组合物的各个组分的活性变化。基于上述思路，进行生物药物组合物的生物学活性评价方法开发，完成本发明，利用该发明方法能够实现对生物药物组合物各个组分的生物学活性的深入分析，用于生物药物组合物的活性研究及稳定性评价。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述缺陷和不足，提供了一种实现对生物药物组合物的生物活性进行深入分析和研究、可将生物药物组合物视为整体评价该生物药物组合物的生物学活性、同时也可以利用该同一生物学活性分析方法对生物药物组合物的各个组分的生物活性进行分析追踪、在生物药物组合物的稳定性研究中能够实现对各个组分可能发生的生物活性降解情况进行监控的针对生物药物组合物的生物学活性评价方法。

为了实现上述目的，在本发明提供了一种针对生物药物组合物的生物学活性评价方法，其特点是，包括以下步骤：

步骤(1)：建立针对生物药物组合物中的各个蛋白组分的蛋白定量方法，用于准确检测生物药物组合物各个蛋白组分的蛋白浓度；

步骤(2)：确认生物药物组合物中的各个蛋白组分的共同的生物学作用机理，并基于该作用机理建立生物学活性评价方法，该生物学活性评价方法满足能够评价生物药物组合物各个单一蛋白组分的生物学活性；

步骤(3)：将生物药物组合物的各个组分在已知浓度情况下按照不同比例混合，利用所建立生物学活性评价方法检测不同比例混合的生物药物组合物的生物学活性，以某单一组分蛋白浓度为基准，记录不同混合比例条件下的生物药物组合物的生物学活性检测结果。

较佳的，所述针对生物药物组合物各个蛋白组分的定量方法是基于ELISA的蛋白定量方法。

较佳的，所述的生物药物组合物包括至少两种组分，所述的组分选自单克隆抗体药物、融合蛋白、多肽类药物。

较佳的，所述的生物药物组合物为单克隆抗体组合物，如果所述的生物药物组合物的各个蛋白组分为基于同一靶点的不同表位，则建立针对同一靶点的生物学作用机理的生物学活性评价方法；如果所述的生物药物组合物的各个蛋白组分的靶点不同，则建立针对单抗Fc段共同的生物学功能的生物学活性评价方法或者找到包含各个不同靶点的细胞株，建立所述的细胞株针对不同组分的生物学活性方法。

较佳的，所述的生物药物组合物为各个组分针对同一靶点不同表位的生物药物组合物，同一靶点不同表位生物药物组合物示例性地包括EGFR靶点药物、HER2靶点药物、VEGF/VEGFR靶点药物、PCSK9靶点药物、TNFa靶点药物、CD20靶点药物、自噬调节类药物等的生物药物组合物。

较佳的，所述的生物药物组合物是由2个或2个以上的生物药物按照一定比例混合而成。

较佳的，步骤(2)中所述生物学活性评价方法包括ELISA结合活性方法、体外细胞活性方法、体内动物实验活性方法。

较佳的，步骤(3)中所述生物学活性检测结果包括活性检测值、量效关系4-参数或5-参数拟合曲线EC₅₀值。

较佳的，所述的步骤(2)中的生物学活性评价方法具体包括以下步骤：

步骤(21)：取对数生长期的细胞经胰酶消化后调整一定的密度铺96孔细胞板，放置一段时间待细胞贴壁；

步骤(22)：取出待测蛋白药物或组合物用培养基稀释得到系列稀释浓度的样品并加入细胞板中与细胞共同孵育一段时间，在药物的作用下细胞的增殖受到抑制，加入细胞染色液MTS检测细胞增殖抑制情况；

步骤(23)：根据药物浓度与染色信号值的量效关系进行4-参数拟合，计算得到待测蛋白药物信号值抑制一半时的药物浓度EC50值，蛋白药物参考品EC50值除以待测蛋白药物EC50值计算得到待测蛋白药物相对参考品的生物学活性值。

较佳的，所述的步骤(1)中的定量方法为具体包括以下步骤：

步骤(11)：取针对蛋白药物的特异性抗原包被96孔ELISA板，加BSA封闭；

步骤(12)：取已知浓度的蛋白药物标准蛋白进行系列稀释得到系列浓度的标准曲线样品加入ELISA板中与包被抗原结合，与此同时加入内控样品和待测样品；

步骤(13)：孵育一段时间后取出ELISA板加入偶联HRP标记的酶标二抗，孵育一段时间后接着加入TMB进行显色反应；

步骤(14)：根据标准曲线样品孔的样品浓度和显色反应OD值的量效关系进行4-参数曲线拟合，绘制分别针对蛋白药物A或B的定量曲线，将内控样品孔和待测样品孔的显色反应OD值带入标准曲线中计算得到内控样品和待测样品的样品浓度，用以方法准确度、精密度控制、以及待测样品的定量检测。

本发明的有益效果具体在于：采用本发明的方法，能够系统全面的对生物药物组合物的生物学活性进行评价，利用组合物中的各个单一蛋白组分的共同作用机理为基础建立生物活性评价方法，将生物药物组合物视为整体，利用统一的方法对生物药物组合物的生物学活性进行评价；基于ELISA定量手段对组合物各个单一蛋白组分进行精准蛋白定量，由于所建立统一的生物学活性方法能够单独用于各个单一蛋白组分的生物学活性检测，因此基于单一蛋白组分可进行生物学活性检测结果的计算，包括活性拟合曲线EC₅₀值或活性检测值，并根据这些检测结果的变化而判断其他蛋白组分是否发生活性降解。基于该统一的活性检测手段和方法能够实现对生物药物组合物的生物学活性的全方位分析。

基于本发明研究思路的生物药物组合物生物活性分析方法的适用范围十分广泛，包括单克隆抗体药物、融合蛋白、多肽类蛋白药物组合物，只需基于组合物的共同作用机理进行生物学活性方法开发，并蛋白定量，结合数据分析就能够实现全方位的生物药物组合物的生物学活性评价。所涉及生物学活性方法包括细胞活性、结合活性以及动物体内活性实验等。该发明方法是对生物药物组合物研究开发的药学部分研究的有力补充和支持，可用于该类产品的活性研究、产品放行、稳定性研究等。

附图说明

图1a为50％、75％单抗A组分生物学活性检测图谱。

图1b为125％、150％单抗A组分生物学活性检测图谱。

图2a为50％、75％单抗B组分生物学活性检测图谱。

图2b为125％、150％单抗B组分生物学活性检测图谱。

图3a为50％、75％单抗药物组合物P生物学活性检测图谱。

图3b为125％、150％单抗药物组合物P生物学活性检测图谱。

图4为单抗A组分蛋白定量检测图谱。

图5为单抗B组分蛋白定量检测图谱。

图6a为受到破坏的单抗药物组合物P(A+B)、P(A*+B)生物学活性检测结果。

图6b为受到破坏的单抗药物组合物P(A+B*)、P(A*+B*)生物学活性检测结果。

图7a为以单抗药物A组分的蛋白浓度为基准检测受到破坏的单抗药物组合物P(A+B)、P(A*+B)生物学活性检测结果。

图7b为以单抗药物A组分的蛋白浓度为基准检测受到破坏的单抗药物组合物P(A+B*)、P(A*+B*)生物学活性检测结果。

图8a为以单抗药物B组分的蛋白浓度为基准检测受到破坏的单抗药物组合物P(A+B)、P(A*+B)生物学活性检测结果。

图8b为以单抗药物B组分的蛋白浓度为基准检测受到破坏的单抗药物组合物P(A+B*)、P(A*+B*)生物学活性检测结果。

图9为本发明的针对生物药物组合物的生物学活性评价方法的流程简图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

为了能够更清楚的理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

一、材料和试剂

材料：同时针对某靶点不同表位的单抗药物A和单抗药物B按照1:1的质量浓度比例组合(A单抗组分和B单抗组分浓度均为5mg/mL)而成得到由2个单抗蛋白药物组合而成的生物药物组合物P(或者记为P(A+B)或P₁₀₀)。将其视为整体以及生物药物组合物参考品，生物学活性看做100％；将P视为整体，利用制剂缓冲液Buffer进行稀释得到不同效价水平(50％，75％，125％，150％效价水平)的生物药物组合物P₅₀、P₇₅、P₁₂₅、P₁₅₀。将单抗药物A的生物学活性看做100％(记为A₁₀₀)，即单抗药物A参考品，利用制剂缓冲液Buffer进行稀释得到不同效价水平(50％，75％，125％，150％效价水平)的单抗药物A₅₀、A₇₅、A₁₂₅、A₁₅₀。将单抗药物B的生物学活性看做100％(记为B₁₀₀)，即单抗药物B参考品，利用制剂缓冲液Buffer进行稀释得到不同效价水平(50％，75％，125％，150％效价水平)的单抗药物B₅₀、B₇₅、B₁₂₅、B₁₅₀。将单抗药物A和单抗药物B按照不同质量浓度比例进行混合得到含单抗药物A组分和单抗药物B组分不同比例的生物药物组合物P(3A+B)、P(2A+B)、P(A+2B)、P(A+3B)。

试剂：细胞活性实验用试剂包括细胞培养基、染色液MTS、胰酶等；ELISA定量实验用试剂包括特异性针对单抗药物A组分和单抗药物B组分的检测抗原、偶联HRP标记的酶标二抗、TMB显色试剂等。

细胞株：针对单抗药物A组分和单抗药物B组分细胞增殖抑制活性检测实验用细胞株。

耗材：细胞活性实验及ELISA定量实验用96孔板、吸管等。

二、实验方法

1、细胞活性实验：基于实验用细胞株的增殖抑制活性检测实验，

实验过程如下：

取对数生长期的细胞经胰酶消化后调整一定的密度铺96孔细胞板，放置一段时间待细胞贴壁；

接着取出待测单抗药物或组合物用培养基稀释得到系列稀释浓度的样品并加入细胞板中与细胞共同孵育一段时间，在药物的作用下细胞的增殖受到抑制，加入细胞染色液MTS检测细胞增殖抑制情况。

可以发现，增殖抑制程度随着药物浓度的变化呈现量效关系，根据药物浓度与染色信号值的量效关系进行4-参数拟合，可以计算得到待测单抗药物信号值抑制一半时的药物浓度EC50值。单抗药物参考品EC50值除以待测单抗药物EC50值计算得到待测单抗药物相对参考品的生物学活性值。

2、ELISA定量实验：利用特异性针对单抗药物A和单抗药物B的检测抗原，基于ELISA夹心法实验原理建立针对这2个组分的ELISA蛋白定量方法，针对单抗药物A和单抗药物B的ELISA定量方法，除包被特异性抗原不同之外，其余步骤基本一致。

实验过程如下：

取针对单抗药物A或B的特异性抗原包被96孔ELISA板，加BSA封闭；

接着取已知浓度的单抗药物A或B标准蛋白进行系列稀释得到系列浓度的标准曲线样品加入ELISA板中与包被抗原结合，与此同时加入内控样品和待测样品；

孵育一段时间后取出ELISA板加入偶联HRP标记的酶标二抗，孵育一段时间后接着加入TMB进行显色反应。

根据标准曲线样品孔的样品浓度和显色反应OD值的量效关系进行4-参数曲线拟合，绘制分别针对单抗药物A或B的定量曲线，将内控样品孔和待测样品孔的显色反应OD值带入标准曲线中可以计算得到内控样品和待测样品的样品浓度用以方法准确度、精密度控制，以及待测样品的定量检测。

三、本发明的针对生物药物组合物的生物学活性评价方法的具体步骤

1、单抗药物A和单抗药物B针对肿瘤细胞同一靶点的不同表位，2个组分单独作用均具有对肿瘤细胞的增殖抑制作用，将单抗药物A和B按照质量比1:1混合形成新型生物药物组合物与肿瘤细胞作用时，单抗药物A组分和B组分与肿瘤靶点不同表位结合，能够发挥协同效应，对肿瘤细胞的增殖抑制效果更加明显。基于该单抗药物A或B的共同的作用机理，筛选确定高表达目标靶点的肿瘤细胞株用于针对A或B组分的细胞增殖抑制活性方法开发，筛选得到的实验用肿瘤细胞株对单抗A或B组分均表现敏感。基于该细胞株建立增殖抑制生物学活性检测方法，可用于单抗A或单抗B或单抗药物组合物(将二者组合视为整体)的生物学活性评价。完成方法开发，利用该生物学细胞活性方法检测单抗A或单抗B或单抗药物组合物的生物学活性的典型图谱见图1a～图3b。对该生物学活性方法分别对单抗A或单抗B或单抗药物组合物进行活性检测方法的验证和确认，重点考察方法准确度，分别见表1～表3，可以发现利用该生物学活性方法在分别检测单抗A、单抗B或单抗药物组合物的生物学活性时，在活性效价水平50％～150％范围内的方法检测准确度满足在75％～125％的范围内，完成对该针对单抗药物组合物的生物学细胞活性方法的确认。在方法确认的基础上，进一步完成该细胞活性方法的方法学验证。

表1.单抗A组分生物学活性检测准确度考察结果

表2.单抗B组分生物学活性检测准确度考察结果

表3.单抗组合物P生物学活性检测精密度考察结果汇总表

2、针对单抗药物组合物的生物学细胞活性方法建立并完成方法确认和验证之后，建立分别针对该组合物单抗药物A组分和单抗药物B组分的ELISA蛋白定量方法。ELISA蛋白

定量方法建立的关键在于筛选确认可用于药物定量ELISA方法开发的分别针对单抗药物A组分和单抗药物B组分的特异性抗原。筛选确定了分别针对单抗药物组合物的单抗A组分和单抗B组分的特异性抗原后，分别针对单抗A组分和单抗B组分建立ELISA定量方法，该方法满足能够特异性对单抗药物组合物中的单抗A组分或单抗B组分进行蛋白定量，且相互之间没有干扰。完成方法开发，针对单抗A组分和单抗B组分的蛋白定量标准曲线见图4～图5。

进行方法验证和确认，重点考察针对某单抗组分的定量方法实际检测结果的精密度和准确度，并且不受另一单抗组分存在与否的干扰。以针对单抗A组分的ELISA定量方法的方法验证和确认为例，制备3个样品包括A+B(A与B按照质量比1:1混合，A浓度保持5mg/mL)、A+3B(A与B按照质量比1:3混合，其中A的浓度保持5mg/mL)、A+1/3B(A与B按照质量比3:1混合，其中A的浓度保持5mg/mL)，针对这3个样品进行不同样品的板排列方式的6次独立ELISA定量检测，每次检测做3个平行，检测数据汇总见表4，针对3个样品分别得到18次检测结果并进行统计学分析，单抗A组分浓度测定结果的RSD满足<10％，回收率满足在90％～110％范围内。以此类推，针对单抗B组分的ELISA定量方法的方法验证和确认结果汇总见表5，针对3个样品分别得到18次检测结果并进行统计学分析，单抗B组分浓度测定结果的RSD满足<10％，回收率满足在90％～110％范围内。通过这些实验结果确认所建立的ELISA定量方法能够准确对单抗药物组合物的A组分和B组分实现蛋白定量，且相互之间没有干扰。

表4.单抗A组分蛋白定量检测准确度和精密度考察结果汇总表

表5.单抗B组分蛋白定量检测准确度和精密度考察结果汇总表

3、完成分别针对单抗组分A和组分B的ELISA定量检测之后，进一步将单抗组分A和单抗组分B按照不同的质量比例混合，得到系列混合比例的单抗药物组合物，用针对单抗药物组合物的生物细胞活性方法检测系列混合比例的单抗药物组合物，记录在不同比例条件下的活性4-参数拟合曲线EC50值，以及相对单抗药物A组分和B组分按照1:1质量比而成的单抗药物组合物(P(A+B))的相对生物学活性。以单抗药物A组分为基准计算得到含不同质量比例的A组分的单抗药物组合物的生物细胞活性检测结果见表6，以单抗药物B组分为基准计算得到含不同质量比例的B组分的单抗药物组合物的生物细胞活性检测结果见表7。

表6.以单抗A组分为基准计算系列混合比例单抗药物组合物生物学活性

表7.以单抗B组分为基准计算系列混合比例单抗药物组合物生物学活性

由表6和表7的结果可以看出，当以单抗组分A为基准计算单抗药物组合物的生物学活性时，随着单抗A组分质量百分含量的不断下降即单抗B组分的质量百分含量不断上升，活性检测结果的EC₅₀值不断下降，组合物相对单抗组分A和B按照1:1质量比例混合的P(A+B)单抗药物组合物的生物活性则不断上升，说明单抗B组分对A组分的生物学功能有单方向的协同促进作用。而当以单抗组分B为基准计算单抗药物组合物的生物学活性时，同样发现随着B组分质量百分含量的下降即A组分质量百分含量的上升，活性检测结果的EC₅₀值不断下降，而组合物相对单抗组分A和B按照1:1质量比例混合的P(A+B)单抗药物组合物的生物学活性不断上升，同样说明单抗A组分对B组分的生物学功能有单方向的协同促进作用。

由上述结果可以发现单抗A组分和B组分在抗肿瘤作用上相互具有协同促进作用，将二者组合成为新型的单抗药物组合物在治疗肿瘤方面是有积极意义的。与此同时，根据表6和表7的实验结果可以得到单抗A组分和B组分的不同质量比例混合条件下的相对生物活性值及EC₅₀值的变化情况，在实际应用中可以根据单抗组合物的相对活性值或EC₅₀值的变化来判断单抗A组分和B组分的比例变化，结合ELISA浓度定量结果能够判断单抗A组分或B组分是否出现活性变化，实现对单抗药物组合物P的生物学活性的深入分析和研究。四、本发明实际应用

取单抗药物A和单抗药物B按照1:1质量百分比混合得到P(A+B)，并且单抗药物A和B的浓度均为2.5mg/mL；将2.5mg/mL的单抗药物A在80℃高温放置30分钟进行破坏，并假设其浓度没有发生变化，将该经过高温处理的单抗药物A与未经破坏的单抗药物B组分按照质量比1:1混合得到P(A*+B)，单抗药物B的浓度为2.5mg/mL；将2.5mg/mL的单抗药物B在80℃高温放置30分钟进行破坏，并假设其浓度没有发生变化，将该经过高温处理的单抗药物B与未经破坏的单抗药物A组分按照质量比1:1混合得到P(A+B*)，单抗药物A的浓度为2.5mg/mL；将经80℃高温放置30分钟进行破坏的单抗药物A和单抗药物B组分，假设其浓度没有发生变化，按照质量比1:1进行混合，得到P(A*+B*)。得到上述4个样品之后，利用前述的生物细胞活性方法和ELISA蛋白定量方法分别检测这4个样品的生物学活性及各自对应的单抗药物A组分和B组分的蛋白浓度，并根据检测结果对4个单抗药物组合物样品的生物学活性进行分析。

第1步分析，将4个样品均视为整体，直接利用UV法，将4个经不同程度破坏的单抗药物A和B组分直接进行蛋白浓度分析，分别得到4个样品作为整体的蛋白浓度检测结果分别见表8，可以发现通过直接UV法检测4个样品的蛋白浓度并未观察到蛋白浓度的显著变化。UV法基于蛋白组合物整体的氨基酸组成成分进行蛋白定量，无法区分组合物各个组分的浓度变化。

表8.受到破坏的单抗药物组合物蛋白浓度UV法蛋白浓度检测结果汇总表

直接根据单抗药物组合物的UV法检测得到的蛋白浓度结果，将单抗药物组合物视为整体，以单抗药物A和单抗药物B按照1:1组合的参考品为标准，分别检测P(A+B)、P(A*+B)、P(A+B*)、P(A*+B*)4个受到破坏的单抗组合物样品的生物学活性，检测结果见图6a～6b(以单抗药物组合物整体浓度为基准)及表9。

表9.受到破坏的单抗药物组合物生物学活性检测结果汇总表

由上述实验结果可以看出当以单抗药物组合物视为整体时，基于UV法检测的组合物的蛋白浓度，利用该生物活性方法能够灵敏的检测出单抗药物组分A或者单抗药物组分B受破坏时的活性的变化，当单抗组分A或单抗组分B均没有受破坏时，P(A+B)的细胞活性与参考品的生物学活性并无显著差异，而当单抗药物组合物的A或B发生稳定性破坏时，P(A*+B)、P(A+B*)、P(A*+B*)的细胞活性均发生显著下降。当A组分和B组分均发生稳定性破坏时，P(A*+B*)的细胞活性下降最为显著。

尽管通过上述第1步实验能够检测得到P(A*+B)、P(A+B*)、P(A*+B*)这3个样品的细胞活性下降，但是难以判断是由于A活性组分或是由于B活性组分发生破坏而导致的整体样品的细胞活性下降，针对该疑问需进行后续第2步和第3步的实验分析。第2步分析利用分别针对单抗药物组分A和单抗药物组分B的ELISA定量方法对上述4个未知的经高温稳定性破坏的单抗药物组合物的各个组分的蛋白浓度进行检测确定。第2步分析确定蛋白浓度检测结果见表10。

表10.受到破坏的单抗药物组合物蛋白浓度ELISA检测结果汇总表

由表10蛋白定量检测结果可以发现利用所建立的分别针对单抗组分A和单抗组分B的ELISA蛋白定量方法能够特异性识别并检测单抗药物组合物的组分A和组分B的“有效”蛋白浓度，当将单抗药物组分A或组分B经高温破坏，基于该ELISA定量方法得到的“有效”蛋白浓度出现显著下降，与预期一致。准确的ELISA蛋白定量结果是后续准确判定单抗药物组合物的组分A或组分B是否发生生物活性变化的基础。经过第2步ELISA定量检测对4个未知的经高温破坏的单抗药物组合物的A组分和B组分分别进行蛋白定量检测，根据蛋白定量结果，可以初步得出P(A+B)样品的A组分和B组分均未受破坏；P(A*+B)样品的A组分受到破坏，B组分正常；P(A+B*)样品的A组分正常，B组分受到破坏；P(A*+B*)样品的A组分和B组分均受到破坏。然而该结论仅仅基于ELISA蛋白定量得出的，需要经过细胞活性检测的进一步确证，即开展第3步的基于ELISA蛋白定量结果对4个蛋白药物组合物的细胞生物活性进行分析检测。

在通过第2步分析的蛋白ELISA定量实验确定单抗药物组合物的A组分或B组分的准确“有效”蛋白浓度后，利用能够同时针对单抗药物A组分或B组分的生物学细胞活性实验对4个受不同程度稳定性破坏的单抗药物组合物样品进行生物学活性分析，分别以单抗药物A组分的蛋白浓度或以单抗药物B组分的蛋白浓度为基准进行相对单抗药物组合物(未受破坏的A、B组分按照1:1混合)参考品的生物学活性分析。并将检测结果与之前完成的表6、表7在不同A、B组分混合比例条件下的活性结果数据进行比较，根据活性结果推测A与B组分的组合比例，并与实际通过ELISA定量得到的A与B组分的组合比例进行比较，对基于ELISA定量得到的A组分和B组分的相对组合比例进行确证，并推断组合物中的A组分或B组分是否发生了破坏。

以单抗药物A组分的蛋白浓度为基准检测稳定性破坏的单抗药物组合物样品生物学细胞活性结果见图7a～7b(以单抗药物组分A“有效”浓度为基准)和表11。

表11.受到破坏的单抗药物组合物生物学活性结果汇总表(以单抗药物组分A“有效”浓度为基准)

由上述结果可以看出基于单抗药物A“有效”浓度为基准对4个经不同程度破坏的单抗药物组合物的活性进行检测，根据检测结果，结合表6得到的根据不同比例单抗A或B组分的活性检测结果，对4个经不同程度破坏的单抗药物组合物的A和B的相对比例进行推测，可以发现根据活性结果推测的A组分和B组分的比例与经过第2步蛋白定量得到的A组分和B组分的实际检测比例基本一致。针对P(A+B*)样品，因为A蛋白组分的蛋白浓度基本没有变化，可以得出该组合物中B蛋白组分发生破坏的推论。针对P(A*+B)样品，因为B蛋白组分的蛋白浓度基本没有变化，可以得出该组合物中A蛋白组分发生破坏的推论。针对P(A*+B*)样品，基于蛋白A组分和B组分的蛋白定量结果均偏低，并且该样品相对P(A+B)蛋白组合物标准品的细胞活性并不一致，可以得出该组合物中A蛋白组分和B蛋白组分均发生破坏的推论。

以单抗药物B组分的蛋白浓度为基准检测稳定性破坏的单抗药物组合物样品生物学细胞活性结果见图8a～8b(以单抗药物组分B“有效”浓度为基准)和表12。

表12.受到破坏的单抗药物组合物生物学活性检测结果汇总表(以单抗药物组分B“有效”

浓度为基准)

由上述结果可以看出基于单抗药物B“有效”浓度为基准对4个受不同程度破坏的单抗药物组合物的活性进行检测，根据检测结果，结合表7得到的根据不同比例单抗A或B组分的活性检测结果，对4个经不同程度破坏的单抗药物组合物的A和B的相对比例进行推测，可以发现根据活性结果推测的A组分和B组分的比例与经过第2步蛋白定量得到的A组分和B组分的实际检测比例也基本一致。同样根据该结果对4个单抗药物组合物的A和B组分的相对比例能够进行确证，得到针对该4个单抗药物组合物样品中的A组分或B组分发生破坏的结论。

利用上述3个步骤的实验，对4个模拟的未知的受到不同程度破坏的单抗药物组合物的细胞生物学活性进行分析，能够发现含有破坏组分的单抗药物组合物的细胞生物活性有不同程度的下降，同时基于ELISA蛋白定量和活性确证对细胞生物活性下降的单抗药物组合物的组分的相对比例进行了准确分析，能够推断单抗药物组合物中的A组分或B组分发生了破坏现象。

综上所述，本发明建立了一种针对生物药物组合物的生物学活性评价方法，该方法是在生物技术药物不断研发进步，特别是新型生物药物组合物的药物开发过程的质量研究领域的拓展。传统针对单一生物药物组分的生物活性评价方法无法满足对多种生物药物形成的组合物的生物活性深入分析的需要。本发明结合生物活性方法开发、ELISA蛋白定量分析方法开发，以及通过对不同混合比例样品的活性检测结果分析，能够实现通过1种生物活性方法实现对复杂的生物药物组合物的各个组分可能发生的活性变化情况进行分析。该方法思路清晰，开发和使用难度适中，易推广，能够满足对生物药物组合物的生物学功能评价、产品放行、稳定性研究等的需要。

本发明的有益效果具体在于：采用本发明的方法，能够系统全面的对生物药物组合物的生物学活性进行评价，利用组合物中的各个单一蛋白组分的共同作用机理为基础建立生物活性评价方法，将生物药物组合物视为整体，利用统一的方法对生物药物组合物的生物学活性进行评价；基于ELISA定量手段对组合物各个单一蛋白组分进行精准蛋白定量，由于所建立统一的生物学活性方法能够单独用于各个单一蛋白组分的生物学活性检测，因此基于单一蛋白组分可进行生物学活性检测结果的计算，包括活性拟合曲线EC₅₀值或活性检测值，并根据这些检测结果的变化而判断其他蛋白组分是否发生活性降解。基于该统一的活性检测手段和方法能够实现对生物药物组合物的生物学活性的全方位分析。

基于本发明研究思路的生物药物组合物生物活性分析方法的适用范围十分广泛，包括单克隆抗体药物、融合蛋白、多肽类蛋白药物组合物，只需基于组合物的共同作用机理进行生物学活性方法开发，并蛋白定量，结合数据分析就能够实现全方位的生物药物组合物的生物学活性评价。所涉及生物学活性方法包括细胞活性、结合活性以及动物体内活性实验等。该发明方法是对生物药物组合物研究开发的药学部分研究的有力补充和支持，可用于该类产品的活性研究、产品放行、稳定性研究等。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。